Name: applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota
Uploaded: 2019-02-15T14:45:00
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Sra. Audrey Thomas-Gahring é reconhecido por seus GC/MS de trabalho. Gostaríamos também de agradecer Massimo Marzorati para editar o manuscrito.

1. materiais e preparações
Nota: O médio definido é comprado como um pó (ver Tabela de materiais). A composição do meio definido em g/L é o seguinte: Arabinogalactan (1.2), pectina (2.0), xilana (0,5), glicose (0,4), extrato de levedura (3.0), peptona especial (1.0), mucina (2.0), L-cisteína-HCl (0,2).
<ol><li>
Prepare o suporte definido
	<ol>
<li>Encha um frasco de 4L com 2 L de água destilada, deionizada dupla.</li>
		<li>Adicion...

<ol>
	<li>Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+mucus+layers+of+colon+are+organized+by+the+MUC2+mucin,+whereas+the+outer+layer+is+a+legislator+of+host-microbial+interactions.">The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).</li><li>Xu, J., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honor+thy+symbionts.">Honor thy symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).</li><li>Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+normal+gut+microbiota.">Role of the normal gut microbiota.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).</li><li>Macfarlane, G., Macfarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+intestinal+fermentation:+association+between+food+components,+delivery+systems,+bioavailability+and+functional+interactions+in+the+gut.">Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+distal+gut+mucosal+and+luminal+communities+using+packed-column+biofilm+reactors+and+an+in+vitro+chemostat+model.">Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinoxylans,+inulin+and+Lactobacillus+reuteri+1063+repress+the+adherent-invasive+Escherichia+coli+from+mucus+in+a+mucosa-comprising+gut+model.">Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).</li><li>Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+selects+mucosal+and+luminal+associations+of+coevolved+gut+microorganisms:+a+novel+concept.">The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+a+mucosal+environment+in+a+dynamic+gut+model+results+in+a+more+representative+colonization+by+lactobacilli.">Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli.</a> Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).</li><li>Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome-host+interactions+in+health+and+disease.">Gut microbiome-host interactions in health and disease.</a> Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).</li><li>Wissenbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+metabolomics+of+defined+in+vitro+gut+microbial+ecosystems.">Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems.</a> International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+microbial+community+reproducibility,+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model.">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li><li>Venema, K., van den Abbeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+the+gut+microbiome.">Experimental models of the gut microbiome.</a> Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).</li><li>Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+functions+of+gut+microbiota+metabolism+impacting+host+physiology.">Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).</li><li>Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anxiety,+Depression,+and+the+Microbiome:+A+Role+for+Gut+Peptides.">Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides.</a> Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).</li><li>Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Axenic+Larvae+Colonization+with+Human+Intestinal+Microbiota.">Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota.</a> Zebrafish. 00 (00), (2017).</li><li>Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaped+fecal+gut+microbiota+composition+by+the+intake+of+high+molecular+weight+persimmon+tannin+in+normal+and+high-cholesterol+diet-fed+rats.">Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats.</a> Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).</li><li>Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Hale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+Versus+Phylogeny:+a+Comparison+of+Gut+Microbiota+in+Captive+Colobine+Monkey+Species.">Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species.</a> Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+contributes+to+longitudinal+diversity+of+fecal+microbiota+in+swine+selected+for+lean+growth.">Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth.</a> Microbiome. 6 (1), 4 (2018).</li><li>Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+in+vitro+human+gut+fermentation+modeling.">Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling.</a> Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).</li><li>Muegge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+drives+convergence+in+gut+microbiome+functions+across+mammalian+phylogeny+and+within+humans.">Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans.</a> Science. 332 (6032), 970-974 (2011).</li><li>Santiago-Rodriguez, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat+culture+systems+support+diverse+bacteriophage+communities+from+human+feces.">Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces.</a> Microbiome. 9 (3), 58 (2015).</li><li>Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastrointestinal+microbiota+as+a+site+for+the+biotransformation+of+drugs.">The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).</li><li>Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combined+LC-MS+Metabolomics-+and+16S+rRNA+Sequencing+Platform+to+Assess+Interactions+between+Herbal+Medicinal+Products+and+Human+Gut+Bacteria+in+Vitro:+a+Pilot+Study+on+Willow+Bark+Extract.">A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract.</a> Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).</li><li>Cueva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+grape+seed+flavan-3-ol+fractions+by+human+faecal+microbiota:+changes+in+microbial+groups+and+phenolic+metabolites.">In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites.</a> FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).</li><li>Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+5-step+multi-chamber+reactor+as+a+simulation+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apigenin+Impacts+the+Growth+of+the+Gut+Microbiota+and+Alters+the+Gene+Expression+of+Enterococcus.">Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus.</a> Molecules. 22 (8), (2017).</li><li>Caporaso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST.">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li><li>Cole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+Database+Project:+data+and+tools+for+high+throughput+rRNA+analysis.">Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea.">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).</li><li>Liu, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+mucosal+gut+microbial+community+in+vitro+using+an+artificial+simulator.">Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator.</a> PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).</li><li>Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+The+Simulator+of+the+Human+Intestinal+Microbial+Ecosystem+(SHIME+&#174;).">Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME &#174;).</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate-producing+Clostridium+cluster+XIVa+species+specifically+colonize+mucins+in+an+in+vitro+gut+model.">Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model.</a> The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).</li><li>Possemiers, S., Verth&#233;, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-DGGE-based+quantification+of+stability+of+the+microbial+community+in+a+simulator+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem.</a> FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).</li><li>Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">The role of short-chain fatty acids in health and disease.</a> Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).</li><li>Yang, J., Kweon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota:+a+key+regulator+of+metabolic+diseases.">The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases.</a> BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).</li><li>Sonnenburg, J., B&#228;ckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-microbiota+interactions+as+moderators+of+human+metabolism.">Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism.</a> Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).</li></ol>

Sistemas de cultivo in vitro foram desenvolvidos para estudar a microbiota do intestino do intestino grosso. Eles usam aparelhos projetados para simular as condições fisiológicas do tracto gastro intestinal, promovendo o crescimento de uma comunidade microbiana do intestino maduro para cada região do cólon33. Enquanto o conceito é lógico e compreensível, o funcionamento real dos sistemas de cultivo in vitro para o estudo da microbiota do intestino exige precisão e uma compreensão do que ...

A microbiota do intestino é uma comunidade de microorganismos que residem no trato gastrointestinal humano (GIT).  Esta comunidade atinge a concentração máxima no cólon, que é estimado para segurar 10-13-1014 bactérias, de 500-1.000 espécies, que vivem em simbiose com o meio de cólon1,2. A composição e a funcionalidade da microbiota do intestino espacialmente mudam ao longo do GIT, formando comunidades específicas da região, com a maioria dos diversidade encontrada distalmente2,3,4,5. Para cada região anatômica, separadas das comunidades microbianas residem no lúmen e no forro mucosal6. A comunidade de lúmen tem acesso mais direto aos nutrientes como substratos se move através do compartimento luminal7. Apesar disso, algumas bactérias residam preferencialmente na camada de muco, utilizando mucina produzida pelas células do cólon como energia fonte1,5,8. A diferença entre as fases luminal e mucosas microambiente que resulta em divergência e o desenvolvimento de comunidades específicas de fase. Juntas, estas comunidades fornecem funções metabólicas, tais como o metabolismo de nutrientes e a produção de vitaminas e funções imunológicas, tais como prevenir a colonização de patógenos humanos1,3, 9. a microbiota do intestino também funciona funcionalmente em conjugação com as células de cólon humano3.
Como uma parte importante do GIT humano, não é surpreendente que a microbiota do intestino é conhecida por contribuir para ambos anfitrião saúde e doença estatuto3,9,10,11,12. Uma mudança na população microbiana do intestino tem sido associada com várias doenças humanas, incluindo transtornos do GIT como doença intestinal intestinal (IBD) e síndrome do intestino (IBS), mas também de outras doenças, como obesidade, doenças circulatórias e autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabólitos produzidos a partir da microbiota do intestino tem um efeito global, atingindo locais longe do intestino12,13. Por exemplo, o eixo do intestino-cérebro é associado com transtornos mentais, como ansiedade e depressão14. Portanto, estudar a microbiota do intestino é importante para vários campos de pesquisa e é aplicável a muitas doenças, mesmo aqueles não frequentemente associada com o GIT.
Enquanto é amplamente reconhecido que a microbiota do intestino a estudar é importante, é uma tarefa complicada. Vários modelos animais estão disponíveis, desde pequenos animais como o peixe-zebra, ratos e camundongos, para maiores como macacos e porcos,15-19. No entanto, a aplicação destes animais em termos da microbiota do intestino humano é não simples, desde que estes animais têm uma comunidade única bacteriana que evoluiu com base no ambiente e dieta, e eles são anatomicamente distintos dos seres humanos20 , 21. o uso de cobaias humanas, remove a questão da relevância, no entanto, apresenta um outro conjunto de desafios. Estudos em humanos são caros, consomem tempo e são eticamente restrita11. Além disso, fatores de confundimento influenciam a microbiota do intestino em estudos humanos, incluindo a idade ou grau de desenvolvimento, ambiente, dieta, medicação e fatores genéticos,2,4,22.  Também há restrições sobre o que pode ser testado em seres humanos, e que tipo de amostras pode ser colhido no qual vezes4.
Uma desvantagem crítica de usar um sistema na vivo para estudar a microbiota do intestino é a presença de componentes dos mamíferos. A microbiota do intestino e células humanas interagem um com o outro, e em um no vivo definindo, é impossível distinguir os dois. Os metabólitos produzidos pela microbiota do intestino são tomados pelas células do cólon, então as medidas não podem ser calculadas com precisão. Portanto, qualquer estudo mecanicista deve ser limitado aos pontos de extremidade medições11. Outra grande desvantagem para estudos in vivo é a incapacidade para colher amostras de diferentes regiões do GIT longitudinalmente23. Isto não permite a avaliação das mudanças que podem ocorrer no microambiente do cólon ao longo do tempo12.  Muitos na vivo estudos, incluindo os humanos, dependem de análise de amostras fecais para detectar as alterações para o intestino microbiota12. Enquanto isso é informativo, ele não fornece dados sobre a microbiota do intestino através do GIT e não faz distinção entre as comunidades luminal e mucoso5,6,7,8.
A microbiota do intestino, a aplicação de um método em vitro é necessário estudar a dinâmica da comunidade bacteriana, sem interferência dos componentes dos mamíferos. Usar um método em vitro permite o controle apertado de condições ambientais10testes de vários parâmetros simultaneamente e a capacidade de amostra longitudinalmente e em grandes volumes11. Desde que um método in vitro utiliza um dispositivo mecânico e não uma série, sem considerações são necessárias para idade, ambiente, dieta ou plano de fundo genético. Estes sistemas pode ser usado para testar de qualquer comunidade de microbiota intestino inteiro, somente selecionado organismos, ou mesmo única cepas. Importante, os resultados in vitro são reproduzíveis, ainda manter um nível de diversidade comparável para estudos in vivo11,22.
Dependendo da hipótese em questão e os resultados desejados, eun vitro estudos podem ser realizados de várias formas.  Eles podem utilizar sistemas single-navio e métodos simples, como incubar as amostras fecais homogenate24 ou executar culturas único lote ao longo de 24-48 h25. Eles também podem ser realizados usando sistemas single-navio e métodos mais complexos, como o uso de um sistema de quimiostato para produzir um intestino estável comunidade microbiana11. No entanto, o uso de um único reator over simplificar a microbiota12 desde que representa apenas uma parte do cólon, mesmo que o cólon é composto por regiões ascendentes, transversais e descendentes.
Para estudar a comunidade de microbiota do intestino que se desenvolve nas diferentes regiões do cólon (ascendentes, transversais e descendentes regiões), um sistema complexo, com vários estágio pode ser empregado. Nestes sistemas, vários navios estão constituídos para imitar as diferentes regiões do cólon, então a microbiota do intestino das regiões ascendentes, transversais e descendentes são cultivados de forma independente. Estes vasos são conectados, usando bombas para mover substratos em sequência, a partir do ascendente para o transverso às regiões do cólon descendente, imitando o fluxo de nutrientes através do GIT.
O objetivo deste estudo foi demonstrar como um sistema de cultura in vitro de 5 estágios (ver Tabela de materiais) pode ser usado para cultivar a Comunidade microbiota do intestino e para demonstrar a dinâmica da Comunidade em termos de estabilidade e composição. Neste sistema, um navio representa o estômago e um representar o intestino delgado. O cólon é dividido em três regiões (ascendente, transverso, descendente), com um navio que representa cada região26. Nesta instalação experimental, dois sistemas completos foram executados em paralelo, com 1 unidade contendo portadores de mucina que representa a superfície da mucosa e unidade 2 contendo não portadores de mucina. As comunidades que se desenvolveu nas fases de luminal e da mucosa de cada região foram comparadas entre si e para o inóculo fecal ao longo do tempo usando análise de CCPA e sequenciamento de gene 16S rRNA. Os resultados apresentados demonstram o tipo de comunidade, tanto em termos de composição e funcionalidade, que pode ser produzida a partir deste tipo de sistema in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TWINSHIME</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex tubing</td>
			<td>cole Parmer</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine Drainage bag</td>
			<td>Bard</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsorb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fecal sample</td>
			<td>Openbiome</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined medium</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxgall Bile</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass ware</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization pouches</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeadBug</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free, DNAse free, sterile water</td>
			<td>Roche</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25&#181;m</td>
			<td>Restek</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic mucin carriers</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota

A microbiota do intestino humano desempenha um papel vital na saúde e na doença. Estudar a microbiota do intestino utilizando um modelo in vivo , é difícil devido à sua natureza complexa e sua associação diversificada com componentes dos mamíferos. O objetivo do presente protocolo é cultura a microbiota do intestino in vitro, que permite o estudo da dinâmica de microbiota do intestino, sem ter que considerar a contribuição do meio de mamíferos. Usando em vitro tecnologia de cultivo, as condições fisiológicas do tracto gastro-intestinal são simuladas, incluindo parâmetros como pH, temperatura, anaerobiose e tempo de trânsito. A superfície intestinal do cólon é simulada adicionando transportadoras revestidas mucina, criando uma fase da mucosa, e adicionando outra dimensão. A microbiota do intestino é introduzida por inocular com o material fecal humano. Após a inoculação com esta mistura complexa de bactérias, micróbios específicos são enriquecidos na diferentes longitudinal (ascendente, transversais e descendentes de dois-pontos) e transversais (luminal e da mucosa) ambientes do modelo in vitro. É crucial permitir que o sistema alcança um estado estacionário, em que a Comunidade e os metabólitos produzidos permanecem estáveis. Os resultados experimentais neste manuscrito demonstram como a comunidade de microbiota do intestino inoculados se desenvolve em uma comunidade estável ao longo do tempo. Uma vez que o estado estacionário é alcançado, o sistema pode ser usado para analisar interações bacterianas e funções de Comunidade ou para testar os efeitos de quaisquer aditivos sobre a microbiota do intestino, tais como alimentos, componentes de alimentos ou produtos farmacêuticos.

O protocolo acima descreve o conjunto acima, inoculação e execução de um sistema in vitro de 5 estágios para estudar o intestino microbiota do cólon. Para gerar os dados apresentados a seguir, após a extração de DNA, sequenciamento de DNA de gene 16S rRNA marcador da região V1V2 foi realizado utilizando a taxa de transferência alta sequenciamento (por exemplo,, MiSeq Illumina plataforma) pelo centro Microbiome no Hospital infantil de Philadelphia,27</...

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Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Aplicação avançada em Vitro cultivo tecnologia para estudar a Microbiota do intestino humano

Aqui, apresentamos um protocolo para cultivo a microbiota do intestino do cólon in vitro, usando uma série de biorreatores que simulam as condições fisiológicas do tracto gastro-intestinal.

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

O objetivo deste protocolo é cultivar microbiota intestinal in vitro. Permitirá o estudo da dinâmica da microbiota sem ter que considerar a contribuição de um componente moderno. Usando este sistema in vitro multi estágio, contamos que a comunidade de microbiotas para desenvolver no lumin e na mucosa de várias regiões do cólon pode ser iniciada simultaneamente.Uma demonstração visual deste método é útil devido à complexidade deste sistema in vitro. Comece preenchendo o cólon ascendente com 500 mililitros de meio definido, o cólon transversal com 800 mililitros de meio definido, e o cólon descendente com 600 mililitros de meio definido. Adicione agricarriers de mucina às regiões do cólon em uma quantidade proporcional ao volume do reator, e use o tubo de amostra e a seringa para remover qualquer meio definido em excesso de cada reator.Use as sondas de pH para ajustar o pH em cada reator. E ligue a descarga de nitrogênio por 20 minutos. Em seguida, descongele o homogeneato fecal de acordo com as diretrizes do fabricante antes de carregar uma seringa de 60 mililitros com a amostra homogênea fecal.Em seguida, inocular cada reator de cólon através da porta de amostra com uma quantidade de homogeneizar igual a 5% de cada volume de reator para cultura noturna com controle de pH. Na manhã seguinte, limpe o bloqueio de luer na porta de amostra de cada bioreator com álcool. Quando as portas secarem, conecte a seringa de 30 mililitros, limpa de todo o ar, a uma das portas de amostra.Retire o êmbolo três a cinco vezes para garantir uma mistura completa dos componentes do vaso antes de aspirar 15 mililitros do superatado da cultura do bioreator. Em seguida, transfira a amostra luminal para um tubo falcão estéril e coloque no gelo. Para análise de DNA, colete de um a três mililitros de fluido luminal usando uma seringa de cinco mililitros.Colete a forma superata dos outros bioreatores da mesma forma. Para reservar material amostral para análise de ácidos graxos de cadeia curta, centrífugas 15 mililitros da amostra luminal de interesse, e filtro de seringa o superata através de um filtro de poros de 0,2 micrômetro para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para reservar material amostral para análise de DNA, centrífugas um mililitro de fluido luminal e armazenar a pelota a menos 80 graus Celsius.Para a colheita da amostra de mucosa, remova os portadores de mucina preparados de quatro graus Celsius de armazenamento e ligue a descarga de nitrogênio. Abra rapidamente a tampa do reator e substitua 50% dos porta-aviões em cada reator por novos. Quando todos os porta-aviões tiverem sido substituídos, recira rapidamente a tampa e mantenha a descarga de nitrogênio por mais 20 minutos.Em seguida, alíquota de 0,25 a 0,5 gramas de ágar portador de mucina em dois tubos mililitros individuais para armazenamento de menos 80 graus Celsius até a extração de DNA. Três vezes ao dia o sistema pedala automaticamente. Isso começa com 140 mililitros de meio definido transferidos para o bioreator estomacal seguido de uma incubação de uma hora com controle de pH.No final da incubação, o conteúdo do estômago é transferido para o intestino delgado junto com 60 mililitros de suco pancreático. No bioreator do intestino delgado, o pH é ajustado automaticamente para 6,7 a 6,9, e o conteúdo incuba por 90 minutos. Durante esta incubação, a descarga de nitrogênio para cada sistema é ligada por um total de 10 minutos.No final desta incubação, os conteúdos do intestino delgado são transferidos para o cólon ascendente, do cólon ascendente ao cólon transversal, do cólon transverso ao cólon descendente, e do cólon descendente para o lixo. Nesta análise representativa das coordenadas principais, a comunidade mudou depreciadamente entre os dias um e sete. No entanto, desde o 11º pós-inoculação até o final do experimento, as amostras ocuparam uma pequena região do espaço principal de análise de coordenadas para ambos os escores de distância amostrais com base na unidade taxonômica operacional, presença à ausência e abundância.A medição de três proeminentes ácidos graxos de cadeia curta revela que o ácido propiônico, o ácido butanoico e o ácido acético flutuam desde o início do experimento até o dia 15 pós-inoculação. Após o dia 15, as quantidades desses ácidos produzidos em cada região do cólon permaneceram constantes com apenas mudanças mínimas até o final do experimento. A análise da comunidade estável para a fase luminal e mucosa de cada região do cólon demonstra que as comunidades que se desenvolvem nas regiões coloniais individuais do sistema in vitro são semelhantes à composição do inóculo fecal.A comparação da diversidade alfa do sistema in vitro revela um nível de diversidade semelhante ao do inóculo para todas as regiões, exceto as amostras luminais da região ascendente. Demonstrando que o sistema de cultura in vitro é capaz de produzir uma comunidade comparável ao inóculo fecal, tanto em termos de composição quanto de diversidade. Para produzir uma comunidade de microbiota intestinal estável usando este protocolo, é fundamental garantir que as soluções sejam preparadas com precisão e que as condições aneróbicas e parâmetros de pH sejam mantidos durante todo o experimento.Após este procedimento, as amostras podem ser analisadas para composição comunitária usando sequenciamento de DNA de próxima geração seguido de análise bioinformática e para funcionalidade utilizando metabolômica.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Bioengenharia

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Cartilagem Human Tissue Fabricação Usando tridimensional Inkjet Tecnologia de Impressão

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Cultura Rato Cardiac Valves no Sistema de Cultura de Tecidos Miniature

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

TAPE: Uma biodegradável Hemostática Glue Inspirado por um Composto Ubiquitous em plantas para aplicação cirúrgica

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Derreter a eletrofiação escrita de andaimes Poly(ε-caprolactone) tridimensional com morfologias controláveis para aplicações de engenharia de tecidos

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

Criando um modelo geométrico de elementos finitos estruturalmente realista de um casos para estudar o papel da arquitetura celular em casos de biologia de sistemas

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Micromatrizes de biopartículas para análise quimiotática e molecular de swarming de nêutrons humanos in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...