Name: applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota
Uploaded: 2019-02-15T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota at JoVE.com

MS. Audrey Thomas-Gahring är erkänt för hennes GC/MS arbete. Vi vill också tacka Massimo Marzorati för redigering manuskriptet.

1. material och preparat
Obs: Det definiera mediet köps som pulver (se Tabell för material). Sammansättningen av det definierade mediet i HB är följande: Arabinogalactan (1,2), pektin (2.0), Xylan (0,5), glukos (0,4), jästextrakt (3.0), särskilda pepton (1,0), Mucin (2.0), L-cystein-HCl (0,2).
<ol><li>
Förbereda det definierade mediet
	<ol>
<li>Fyll en 4 L kolv med 2 L av dubbel destillerat och avjoniserat vatten.</li>
		<li>Lägg ti...

<ol>
	<li>Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+mucus+layers+of+colon+are+organized+by+the+MUC2+mucin,+whereas+the+outer+layer+is+a+legislator+of+host-microbial+interactions.">The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).</li><li>Xu, J., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Honor+thy+symbionts.">Honor thy symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).</li><li>Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+normal+gut+microbiota.">Role of the normal gut microbiota.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).</li><li>Macfarlane, G., Macfarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+intestinal+fermentation:+association+between+food+components,+delivery+systems,+bioavailability+and+functional+interactions+in+the+gut.">Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulating+distal+gut+mucosal+and+luminal+communities+using+packed-column+biofilm+reactors+and+an+in+vitro+chemostat+model.">Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabinoxylans,+inulin+and+Lactobacillus+reuteri+1063+repress+the+adherent-invasive+Escherichia+coli+from+mucus+in+a+mucosa-comprising+gut+model.">Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016 (2016).</li><li>Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+selects+mucosal+and+luminal+associations+of+coevolved+gut+microorganisms:+a+novel+concept.">The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporating+a+mucosal+environment+in+a+dynamic+gut+model+results+in+a+more+representative+colonization+by+lactobacilli.">Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli.</a> Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).</li><li>Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome-host+interactions+in+health+and+disease.">Gut microbiome-host interactions in health and disease.</a> Genome Medicine. 3 (3), 14 (2011).</li><li>Wissenbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+metabolomics+of+defined+in+vitro+gut+microbial+ecosystems.">Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems.</a> International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).</li><li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+microbial+community+reproducibility,+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model.">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li><li>Venema, K., van den Abbeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+the+gut+microbiome.">Experimental models of the gut microbiome.</a> Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).</li><li>Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+functions+of+gut+microbiota+metabolism+impacting+host+physiology.">Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).</li><li>Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anxiety,+Depression,+and+the+Microbiome:+A+Role+for+Gut+Peptides.">Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides.</a> Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).</li><li>Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Axenic+Larvae+Colonization+with+Human+Intestinal+Microbiota.">Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota.</a> Zebrafish. 00 (00), (2017).</li><li>Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reshaped+fecal+gut+microbiota+composition+by+the+intake+of+high+molecular+weight+persimmon+tannin+in+normal+and+high-cholesterol+diet-fed+rats.">Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats.</a> Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).</li><li>Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research.">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li><li>Hale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+Versus+Phylogeny:+a+Comparison+of+Gut+Microbiota+in+Captive+Colobine+Monkey+Species.">Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species.</a> Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+contributes+to+longitudinal+diversity+of+fecal+microbiota+in+swine+selected+for+lean+growth.">Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth.</a> Microbiome. 6 (1), 4 (2018).</li><li>Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+in+vitro+human+gut+fermentation+modeling.">Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling.</a> Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).</li><li>Muegge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+drives+convergence+in+gut+microbiome+functions+across+mammalian+phylogeny+and+within+humans.">Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans.</a> Science. 332 (6032), 970-974 (2011).</li><li>Santiago-Rodriguez, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemostat+culture+systems+support+diverse+bacteriophage+communities+from+human+feces.">Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces.</a> Microbiome. 9 (3), 58 (2015).</li><li>Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gastrointestinal+microbiota+as+a+site+for+the+biotransformation+of+drugs.">The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).</li><li>Pferschy-Wenzig, E., Koskinen, K., Moissl-Eichinger, C., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combined+LC-MS+Metabolomics-+and+16S+rRNA+Sequencing+Platform+to+Assess+Interactions+between+Herbal+Medicinal+Products+and+Human+Gut+Bacteria+in+Vitro:+a+Pilot+Study+on+Willow+Bark+Extract.">A Combined LC-MS Metabolomics- and 16S rRNA Sequencing Platform to Assess Interactions between Herbal Medicinal Products and Human Gut Bacteria in Vitro: a Pilot Study on Willow Bark Extract.</a> Frontiers in Pharmacology. 8 (893), (2017).</li><li>Cueva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fermentation+of+grape+seed+flavan-3-ol+fractions+by+human+faecal+microbiota:+changes+in+microbial+groups+and+phenolic+metabolites.">In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota: changes in microbial groups and phenolic metabolites.</a> FEMS Microbiology Ecology. 83 (3), 792-805 (2013).</li><li>Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+5-step+multi-chamber+reactor+as+a+simulation+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apigenin+Impacts+the+Growth+of+the+Gut+Microbiota+and+Alters+the+Gene+Expression+of+Enterococcus.">Apigenin Impacts the Growth of the Gut Microbiota and Alters the Gene Expression of Enterococcus.</a> Molecules. 22 (8), (2017).</li><li>Caporaso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data.">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature Methods. 7 (5), 335-336 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Search+and+clustering+orders+of+magnitude+faster+than+BLAST.">Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST.</a> Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461 (2010).</li><li>Cole, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+Database+Project:+data+and+tools+for+high+throughput+rRNA+analysis.">Ribosomal Database Project: data and tools for high throughput rRNA analysis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (database issue), 633-642 (2014).</li><li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+Greengenes+taxonomy+with+explicit+ranks+for+ecological+and+evolutionary+analyses+of+bacteria+and+archaea.">An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea.</a> The ISME Journal. 6 (3), 610-618 (2012).</li><li>Liu, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+mucosal+gut+microbial+community+in+vitro+using+an+artificial+simulator.">Establishing a mucosal gut microbial community in vitro using an artificial simulator.</a> PLoS ONE. 13 (7), e0197692 (2018).</li><li>Van de Wiele, T., Van den Abbeele, P., Ossieur, W., Possemiers, S., Marzorati, M., Verhoeckx, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+27:+The+Simulator+of+the+Human+Intestinal+Microbial+Ecosystem+(SHIME+&#174;).">Chapter 27: The Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME &#174;).</a> The Impact of Food Bio-Actives on Gut Health. , (2015).</li><li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butyrate-producing+Clostridium+cluster+XIVa+species+specifically+colonize+mucins+in+an+in+vitro+gut+model.">Butyrate-producing Clostridium cluster XIVa species specifically colonize mucins in an in vitro gut model.</a> The ISME Journal. 7 (5), 949-961 (2013).</li><li>Possemiers, S., Verth&#233;, K., Uyttendaele, S., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-DGGE-based+quantification+of+stability+of+the+microbial+community+in+a+simulator+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem.">PCR-DGGE-based quantification of stability of the microbial community in a simulator of the human intestinal microbial ecosystem.</a> FEMS Microbiology Ecology. 49 (3), 495-507 (2004).</li><li>Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+health+and+disease.">The role of short-chain fatty acids in health and disease.</a> Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).</li><li>Yang, J., Kweon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota:+a+key+regulator+of+metabolic+diseases.">The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases.</a> BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).</li><li>Sonnenburg, J., B&#228;ckhed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-microbiota+interactions+as+moderators+of+human+metabolism.">Diet-microbiota interactions as moderators of human metabolism.</a> Nature. 535 (7610), 56-64 (2016).</li></ol>

In vitro-odling system har utvecklats för att studera tarmfloran i tjocktarmen. De använder apparaturar för att simulera de fysiologiska förhållandena av mag tarmkanalen, främja tillväxten av en mogen gut mikrobiell community för varje region av den kolon33. Konceptet är logiskt och begripligt, kräver den faktiska driften av in vitro-odling system att studera tarmfloran precision och en förståelse för vad som krävs och förväntas producera tillförlitliga resultat.
<p class="jov...

Tarmfloran är en gemenskap av mikroorganismer som finns i den mänskliga mag-tarmkanalen (GIT).  Denna gemenskap når maximal koncentration i tjocktarmen, som är beräknad för att hålla 1013-1014 bakterier, från 500-1 000 arter, som lever i symbios med kolon milieu1,2. Sammansättning och funktionalitet av tarmfloran förändras rumsligt längs GIT, bildar regionen specifika samhällen, med de flesta mångfalden hittade distalt2,3,4,5. För varje anatomisk region finns separata mikrobiella samhällen i lumen och på slemhinnor foder6. Lumen gemenskapen har mer direkt tillgång till näringsämnen som substrat flyttar genom den luminala fack7. Trots detta bor vissa bakterier företrädesvis i slem lagret, utnyttja mucin produceras av kolon celler som energi källa1,5,8. Skillnaden i mikromiljö mellan luminala och slemhinnor faser resulterar i divergens och utvecklingen av fas specifika samhällen. Tillsammans ger dessa samhällen metaboliska funktioner, såsom näringsämne metabolism och produktionen av vitaminer, och immunologiska funktioner, såsom att förhindra koloniseringen av mänskliga patogener1,3, 9. tarmfloran fungerar också funktionellt i konjugering med mänskliga kolon celler3.
Som en viktig del av den mänskliga GIT är det inte förvånande att tarmfloran är kända för att bidra till både värd hälsa och sjukdom status3,9,10,11,12. En förändring i tarmen mikrobiella populationen har förknippats med flera sjukdomar, inklusive GIT sjukdomar som intestinal tarmsjukdom (IBD) och intestinal tarm syndrom (IBS), men också andra sjukdomar som fetma, hjärt sjukdom och autism 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metaboliter som produceras från tarmfloran har en global effekt, att nå platser långt från gut12,13. Till exempel är den gut-brain-axis associerad med psykiska sjukdomar som ångest och depression14. Därför studera tarmfloran är viktigt för flera forskningsområden, och gäller för många sjukdomar, även om de inte ofta förknippas med GIT.
Det är allmänt erkänt att studera tarmfloran är viktigt, är det en komplicerade strävan. Flera modeller finns tillgängliga, från små djur som zebrafisk, råttor och möss, till större uppstickare som apor och grisar15-19. Dock tillämpningen av dessa djur när det gäller mänskliga tarmfloran är inte enkelt, eftersom dessa djur har en unik bakteriell gemenskap som har utvecklats baserat på miljö och kost, och de anatomiskt skiljer sig från människor20 , 21. användningen av försökspersoner tar bort frågan relevans ändå introducerar en annan uppsättning utmaningar. Studier på människa är dyrt, tidskrävande, och etiskt begränsad11. Dessutom påverka störande faktorer tarmfloran i humanstudier, inklusive ålder eller utvecklingsstadier, miljö, kost, medicinering och genetiska faktorer2,4,22.  Det finns också begränsningar på vad kan testas på människor, och vilken typ av prover kan skördas på vad gånger4.
En avgörande nackdel att använda ett in vivo -system för att studera tarmfloran är förekomsten av däggdjur komponenter. Av tarmfloran och mänskliga celler interagerar med varandra, och i en in-vivo inställning, det är omöjligt att särskilja de två. De metaboliter som produceras av tarmfloran tas av kolon celler, så mätningar inte kan beräknas med precision. Någon mekanistisk studie måste därför begränsas till slutpunkten mätningar11. En annan stor nackdel för in vivo-studier är oförmågan att skörda prover från olika regioner i GIT längdriktningen23. Detta tillåter inte för bedömning av förändringar som kan uppstå i mikromiljö i tjocktarmen över tid12.  Många in-vivo studier, inklusive mänskliga studier, lita på analys fecal prov att upptäcka förändringar till gut bakterieflora12. Medan detta är informativ, det ger inte data på tarmfloran över GIT och åtskillnad ingen mellan den luminala och slemhinnor samhällen5,6,7,8.
För tarmfloran krävs tillämpningen av ett in vitro- metod att studera dynamiken i bakteriell gemenskapen, utan inblandning från däggdjur komponenter. Med hjälp av in vitro- metod möjliggör snäva kontroll av miljöförhållandena10, testning av flera parametrar samtidigt och möjlighet att prova längdriktningen och i stora volymer11. Eftersom en in vitro-metod använder en mekanisk enhet och inte en värd, behövs inga överväganden för ålder, miljö, kost eller genetisk bakgrund. Dessa system kan användas för att testa antingen hela tarmen bakterieflora gemenskapen, endast utvalda organismer, eller ens enda stammar. Ännu viktigare, in vitro-resultaten är reproducerbara, ändå behålla en mångfald jämförbara studier i11,22.
Beroende på den aktuella hypotesen och önskat resultat, jagn vitro studier kan utföras på många olika sätt.  De kan utnyttja single-fartyget system och enkla metoder, såsom ruvning prover med fekal Homogenatet24 eller utför parti kulturer under loppet av 24-48 h25. De kan också åstadkommas med singel-fartyget system och mer komplexa metoder, till exempel använda ett chemostat system för att producera en stabil gut mikrobiell gemenskapen11. Dock kan användning av en enda reaktor över förenkla den bakterieflora12 eftersom det endast utgör en del av tjocktarmen, även om tjocktarmen består av Regionkommittén stigande, tvärgående och fallande.
För att studera gemenskapens gut bakterieflora som utvecklas i de olika regionerna av tjocktarmen (de stigande, tvärgående och fallande regionerna), kan en komplex, etappvis system användas. I dessa system, är flera fartyg inställda för att efterlikna olika regioner i tjocktarmen, så tarmfloran stigande, tvärgående och fallande Regionkommittén odlas självständigt. Dessa fartyg är anslutna, med pumpar för att flytta substrat i ordningsföljd, från den stigande till transverse till Regionkommittén fallande kolon, härma flödet av näringsämnen via GIT.
Syftet med denna studie var att visa hur en 5-stegs in vitro-kultur-systemet (se Tabell för material) kan användas att odla gut bakterieflora gemenskapen, och att Visa gemenskapens dynamics när det gäller stabilitet och sammansättning. I detta system, ett fartyg representerar magen och man representera tunntarmen. Tjocktarmen är indelad i tre regioner (stigande, tvärgående, fallande), med ett fartyg som representerar varje region26. I detta experiment, två kompletta system kördes parallellt, med enhet 1 som innehåller mucin transportörer att representerar slemhinneepitel och enhet 2 som innehåller inga mucin bärare. De samhällen som utvecklats i varje region luminala och slemhinnor faser jämfördes med varandra, och att det fekal inokulatet över tid med hjälp av 16S rRNA gensekvensering och kommittén analys. De resultat som presenteras visar vilken typ av samhället, både vad gäller sammansättning och funktionalitet, som kan produceras från denna typ av in vitro-system.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>TWINSHIME</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex tubing</td>
			<td>cole Parmer</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine Drainage bag</td>
			<td>Bard</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labsorb</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fecal sample</td>
			<td>Openbiome</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defined medium</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxgall Bile</td>
			<td>Becton Dickson</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pancreatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass ware</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine mucin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization pouches</td>
			<td>VWR</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BeadBug</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1mm Bead beater tube</td>
			<td>Benchmark Scientific</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse free, DNAse free, sterile water</td>
			<td>Roche</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilwax-DA column, 30m, 0.25mm ID, 0.25&#181;m</td>
			<td>Restek</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic mucin carriers</td>
			<td>Prodigest</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying advanced in vitro culturing technology to study the human gut microbiota

Mänskliga tarmfloran spelar en viktig roll i både människors hälsa och sjukdom. Att studera tarmfloran med en in-vivo -modell, är svårt på grund av dess komplexa natur och dess olika association och däggdjur. Målet med detta protokoll är att kultur tarmfloran in vitro som möjliggör studier av gut bakterieflora dynamiken, utan att behöva överväga de däggdjur milieu bidrag. Med in vitro- odling teknik, simuleras de fysiologiska förhållandena av mag tarmkanalen, inklusive parametrar som pH, temperatur, anaerobiosis och transittid. Tarmens yta av tjocktarmen simuleras genom att lägga till mucin-belagd bärare, att skapa en mukös fas, och ytterligare en dimension. Tarmfloran introduceras genom ympning med det mänskliga fekalt materialet. Vid inokulering med detta komplex blandning av bakterier, specifika mikrober är berikad med de olika longitudinella (stigande, tvärgående och fallande kolon) och tvärgående (luminala och slemhinnor) miljöer av in vitro-modellen. Det är avgörande för att systemet att nå steady-state, där gemenskapen och metaboliterna produceras förblir stabila. Experimentella resultat i detta manuskript demonstrera hur gemenskapens inokulerade gut bakterieflora utvecklas till en stabilitetsgemenskap över tid. När steady state uppnås, kan systemet användas att analysera bakteriell interaktioner och gemenskapens funktioner eller för att testa effekterna av tillsatser på tarmfloran, såsom mat, mat komponenter eller läkemedel.

Det ovannämnda protokollet beskriver uppsättningen upp, Inympning och driften av en 5-stegs in vitro-system att studera tarmfloran i tjocktarmen. För att generera de data som presenteras nedan, efter DNA-extraktion, utfördes 16S rRNA markör gen DNA-sekvensering av regionen V1V2 med hjälp av hög genomströmning sekvensering (t.ex., MiSeq Illumina plattform) av mikrobiomet Center på barnsjukhuset Philadelphia27. QIIME (kvantitativa inblick i mikrobie...

Watch this Scientific Journal Video about Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota at JoVE.com

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Tillämpa avancerade In Vitro odling teknik för att studera mänskliga tarmfloran

Här presenterar vi ett protokoll för odling tarmfloran i tjocktarmen in vitro-, med hjälp av en rad bioreaktorer som simulerar de fysiologiska förhållandena av mag tarmkanalen.

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Målet med detta protokoll är att odla gut mikrobiota in vitro. Det kommer att möjliggöra studier av mikrobiota dynamik utan att behöva överväga bidraget från en modern komponent. Med hjälp av detta flerstegs in vitro-system räknar vi mikrobiotasamhället för att utvecklas i luminummen och på slemhinnan i flera regioner av kolon kan startas samtidigt.En visuell demonstration av denna metod är till hjälp på grund av komplexiteten i detta in vitro-system. Börja med att fylla uppstigande kolon med 500 milliliter definierat medium, tvärgående kolon med 800 milliliter av definierat medium, och den fallande kolon med 600 milliliter av definierat medium. Tillsätt mucin agricarriers till kolon regionerna i en mängd som är proportionell mot volymen av reaktorn, och använda provröret och sprutan för att avlägsna eventuella överskott definierade medium från varje reaktor.Använd pH-sonderna för att justera pH-värdet i varje reaktor. Och sätt på kvävespolningen i 20 minuter. Därefter tina fekal homogenate enligt tillverkarens riktlinjer innan du laddar en 60 milliliter spruta med fekal homogenate provet.Därefter inokulerar varje kolonreaktor genom provporten med en mängd homogenate som motsvarar 5%av varje reaktorvolym för övernattningskultur med pH-kontroll. Nästa morgon rengör du luerspärren på provporten för varje bioreaktor med alkohol. När portarna har torkat, anslut 30 millilitersprutan, rensad från all luft, till en av provportarna.Dra tillbaka kolven tre till fem gånger för att säkerställa en grundlig blandning av kärlkomponenterna innan du aspirerar 15 milliliter av kulturens supernate från bioreaktorn. Överför sedan luminalprovet till ett sterilt Falcon-rör och lägg på is. För DNA-analys, samla en till tre milliliter luminalvätska med hjälp av en fem milliliter spruta.Samla den supernate formen de andra bioreaktorerna på samma sätt. För att avsätta provmaterial för kortkedjig fettsyraanalys, centrifug 15 milliliter av luminalprovet av intresse, och sprutan filtrerar supernaten genom ett 0,2 mikrometerporfilter för minus 80 grader Celsius-lagring. För att avsätta provmaterial för DNA-analys centrifug en milliliter luminalvätska och förvara pelleten vid minus 80 grader Celsius.För slemhinnan prov skörd, ta bort de beredda mucin bärare från fyra grader Celsius lagring och slå på kvävet spola. Öppna snabbt reaktorlocket och byt ut 50%av bärarna i varje reaktor mot nya. När alla bärarna har bytts ut, återförslut snabbt locket och underhåll kvävespolningen i ytterligare 20 minuter.Sedan alikvot 0,25 till 0,5 gram mucin bärare agar i enskilda två milliliter rör för minus 80 grader Celsius lagring tills DNA-extraktion. Tre gånger om dagen systemet automatiskt cykler. Detta börjar med 140 milliliter definierat medium överförs i magen bioreaktor följt av en en timmes inkubation med pH kontroll.I slutet av inkubationen överförs innehållet i magen i tunntarmen tillsammans med 60 milliliter bukspottskörtelns juice. I tunntarmen bioreaktor justeras pH-värdet automatiskt till 6,7 till 6,9, och innehållet inkuberar i 90 minuter. Under denna inkubation slås kvävespolningen för varje system på under totalt 10 minuter.I slutet av denna inkubation överförs innehållet från tunntarmen in i det stigande kolonet, från det stigande kolonet till tvärgående kolon, från tvärgående kolon till fallande kolon, och från fallande kolon till avfallet. I denna representativa huvudansvariga koordinerar analys, ändrade gemenskapen depreciably mellan dagar en och sju. Men från dag 11 post inokulering fram till slutet av experimentet, proverna ockuperade en liten region av de viktigaste koordinaterna analysutrymme för både prov för att ta prov avstånd poäng baserat på operativa taxonomiska enhet, närvaro till frånvaro, och överflöd.Mätningen av tre framträdande kort-kedjade fettsyror visar att Propionsyra, Butanoic syra, och Ättiksyra fluktuerar från början av experimentet fram till dag 15 post inokulering. Efter dag 15 förblev de mängder av dessa syror som produceras i varje kolonregion konstant med endast minimala förändringar fram till slutet av experimentet. Analys av den stabila gemenskapen för luminal och slemhinnan fasen av varje kolon region visar att de samhällen som utvecklas i de enskilda kolon regionerna i in vitro-systemet liknar fekal inokulat sammansättning.Jämförelse av alfa mångfald av in vitro-systemet avslöjar en liknande nivå av mångfald som inokulat för alla regioner utom luminal prover från den stigande regionen. Visar att in vitro-kulturen systemet är i stånd att producera en gemenskap jämförbar med fekal inokulat både när det gäller sammansättning och mångfald. För att producera en stabil gut mikrobiota gemenskap med hjälp av detta protokoll, det är viktigt att säkerställa att lösningar förbereds korrekt och att aneroba förhållanden och pH parametrar upprätthålls under hela experimentet.Efter denna procedur kan prover analyseras för gemenskapens sammansättning med hjälp av nästa gen DNA-sekvensering följt av bioinformatisk analys och för funktionalitet med hjälp av metabolomik.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

Odling Mouse hjärtklaffar i miniatyr Tissue Culture System

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

TAPE: en biologiskt nedbrytbar Blods lim Inspirerad av en Ubiquitous förening i växter för kirurgisk applikation

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Co-kultur av levnads- Microbiome med Microengineered Human Intestinal Villi i en Gut-on-a-chip mikroflödessystem enhet

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smälta Electrospinning handstil av tredimensionella Poly(ε-caprolactone) ställningar med kontrollerbar morfologier för Tissue Engineering program

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

Skapa en strukturellt realistiska Finita Element geometriska modell av en hjärtmuskelcellen att studera rollen för cellulära arkitekturen i hjärtmuskelcellen systembiologi

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Biopartikel Mikroarrayer för chemotaktisk och molekylär analys av human neutrophil svärma in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...