Name: a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

ونحن نشكر ألكسندر هورسويل لهدية فsarAP1-تدتوماتو الانصهار، وكريسويل كارين للمساعدة في تحليل التدفق الخلوي. ونشكر أيضا الملك أليسا لإسداء المشورة بشأن التحليل الإحصائي. تم تمويل هذا العمل جزئيا "تحكيم البحث" الاستكشافي/الخلقية المعاهد الوطنية للصحة (منحة AI123708) وكلية أموال بدء التشغيل إلى SRB. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتفسير أو مقرر أن يقدم عمل للنشر.

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جورج تاون.
1-جيل سلالة مراسل نيون
<ol><li>هضم ناقل pRB4 التكاملية الجينوم تسلسلياً مع إنزيمات التقييد اكوري وسماي. بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، إعداد هضم بين عشية وضحاها مع سماي ...

الأمراض المعدية البكتيرية مشكلة صحية متزايدة في جميع أنحاء العالم بسبب الحصول على مقاومة المضادات الحيوية محددات46. لأن التكيف مع البيئات المضيف أمر ضروري للنمو والبقاء على قيد الحياة خلال العدوى، استراتيجيات تستهدف البرامج تعبير الجينات التي تزيد من اللياقة البدنية الممرض...

البكتيريا تستجيب لتغيير الظروف الفسيولوجية والتغيرات في الحالة التغذوية لبيئتهم بخلطات التعبير عن الجينات اللازمة للتكيف والبقاء على قيد الحياة. على سبيل المثال، استعمار مسببات الأمراض الانتهازية الجسم السطوح في نسبيا منخفضة الكثافة، وغالباً ما تكون غير مؤذية. ومع ذلك، مجرد البكتيريا قد اخترقت الحواجز المادية والكيميائية، يجب أن يتعامل مع المضيف المناعي خلية مكافحة الدفاعات وتقييد توافر المغذيات1. على سبيل مثال، المكوّرات العنقودية الذهبية كولونيزيس حوالي ثلث السكان أعراض ولكن أيضا قضية المدمرة الجلد والتهابات الأنسجة الرخوة والتهاب العظم والنقي والتهاب الشغاف وتجرثم2. ويعزى النجاح في المذهبة س. كمسببات المرض غالباً ما المرونة الأيضية، فضلا عن ترسانة من عوامل الفوعة المرتبطة بالسطح ويفرزها تمكن البكتيريا الهروب مجرى الدم وتكرار في الأنسجة المحيطة 34،،5. لأن المضيف الموت بسبب المرض العنقوديات هو مسدود التطورية ونقل حدود ل المضيفين الجديدة6، يجب أن تسيطر الالتزام بإنتاج عامل الفوعة بعناية.
شبكة تنظيمية معقدة من البروتينات والكشف غير الترميز يستجيب لمجموعة متنوعة من المحفزات البيئية، بما في ذلك الخلية كثافة ومرحلة النمو والعوامل المرتبطة العَدلات، وتوافر المغذيات، لضمان أن يتم التعبير عن الجينات الفوعة في دقة الوقت والمكان داخل المضيف الأنسجة7،8،9،10،11،،من1213. على سبيل المثال، ينظم النظام مركبين ساير/S (TCS) التعبير عن عدة عوامل الفوعة عبر كيناز الاستشعار (سايس) و رد منظم (ساير)14. سايس أوتوفوسفوريلاتيد على بقايا الحامض الأميني مصانة في استجابة للمضيف إشارات (مثل، البشرية العَدلات الببتيدات [هنبس]، كالبروتيكتين)8،،من1516. مجموعة فوسفوريل ثم نقل إلى بقايا اسبارتاتي على ساير، تفعيل ذلك بروتين الحمض النووي ملزم (ساير ~ ف)17. وينظم TCS ساير/S ما يزيد على 20 من الجينات التي تساهم في الآلية المرضية بما في ذلك فيبرونيكتين ملزم البروتينات (فنببس)، ليوكوسيدينس، والمخثره14،18،،من1920. ويمكن تصنيف الأهداف إلى الجينات تقارب عالية ومنخفضة-تقارب الأهداف، التي من المحتمل الناجم عن مستوى ساير ~ ف يرتفع عندما تتعرض لما العظة21. ويسيطر النشاط ساير/S الأخرى المنظمين للتعبير الجيني مثل نظام الاستشعار عن النصاب الزراعية، قامع السموم البروتين (Rot)، وبديلة سيغما عامل ب (سيجب)22،،من2324.
نشاط هو جينات فوعة تعتمد على ش في المكوّرات العنقودية الذهبية وترميز ثيرمونوكليسي (نشاط)، الذي أمر ضروري للهروب من نيوتروفيليك هإكستراسيلولار ربرامج العمل الإقليمية (شبكات) ونشر خلال دورة العدوى،من25إلى26. تعبير عن نشاط القمع أيضا بشدة شكل غير مباشر بواسطة كودي حضور الأحماض الأمينية متفرعة السلسلة وأنشئ27، ومباشرة للقمع بالبروتين منظم التبعي العنقوديات سارة28،29 ، يتأثر نشاطها بالأكسجين (حالة الأكسدة) ودرجة الحموضة30. نظراً لأن يتم تخفيف طفرات ساي و نشاط في نماذج الماوس للعدوى، هناك اهتمام بتطوير التدخلات الكيميائية التي تمنع تلك الأنشطة المقابلة26،31. وبالرغم من ذلك، لا توجد معلومات بشأن تنظيمها أثناء الإصابة.
وقد استخدمت الفلورسنت الصحفيين لرصد وقياس التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة. وهنا، نقدم طريقة لقياس S. التعبير الجيني في المذهبة أثناء الإصابة، عندما يقترن الترنسكربيتوم في المختبر تحليل وقوية تقنيات التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)، والتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي (السيدة)، يمكن أن تكشف عن كيف البكتيرية وينظم علم وظائف الأعضاء في فيفو ووفرة نسبية من المواد الغذائية في بعض المنافذ. يمكن تطبيق الأسلوب لأي مسببات الأمراض البكتيرية مع نظام وراثية أصعب.
نظرة عامة على ناقل الجينوم التكاملية.
PRB4 ناقلات التكاملية الجينوم يحتوي على 500 قاعدة أزواج كل من مناطق بسيودوجيني S. aureus USA300 SAUSA300_0087 لتسهيل جزئ مثلى المنبع والمصب. pRB4 مشتق من العمود الفقري ناقل بماد حساسة لدرجة الحرارة التي تتضمن الاريثروميسين المقاومة كاسيت (ارمك) والحرارة بيتا-جالاكتوسيداسي جين بجاب لفحص أبيض وأزرق من ريكومبينانتس32. بناء هندسيا مراسل يحتوي أيضا على علامة مقاومة كلورامفينيكول (لجنة مناهضة التعذيب) للتحديد بعد دمج الجينوم والقضاء بلازميد، فضلا عن مواقع اكوري وسماي فتيل المنطقة التنظيمية التي تهم الأخضر سوبيرفولدير الفلورسنت البروتين (سجفب) (الشكل 1). ومن المعروف أن اختيار موقع الربط الريبوسوم (RBS) يؤثر على نشاط المراسل، وغالباً ما يتطلب التحسين التجريبية33. وهكذا، لم يتم توفير RBS. هنا، يستخدم الموقع ملزم الريبوسوم الأصلية لتوفير لنمط أكثر طبيعية من التعبير الجيني، ولكن يمكن أن تستخدم في مواقع أخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">5% sheep blood</td>
			<td style="width:343px;">Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td>
			<td style="width:139px;">A10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:343px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">C57Bl/6 Mice</td>
			<td style="width:343px;">Charles River</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">C-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture, Cap</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D+2:25NA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miniprep, plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaking water bath</td>
			<td>New Brunswick Innova</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR purification</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:343px;">Cellgrow</td>
			<td style="width:139px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:343px;">Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-Kan</td>
			<td>GenScript (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Q5 Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:367px;">Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6300L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sanger Sequencing</td>
			<td>Genewiz (Germantown, MD)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sub Xero clear tissue freezing medium</td>
			<td>Mercedes Medical</td>
			<td style="width:139px;">MER5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superloop</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe, Filter</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto 40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S11351</td>
			<td>Membrane permeant nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:343px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">90000-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter-DU350</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues

وكثيراً ما ينظم الجينات الفوعة الجرثومية على المستوى النسخي العوامل المتعددة التي تستجيب لإشارات بيئية مختلفة. وتعمل بعض العوامل مباشرة على الجينات الفوعة؛ الآخرين السيطرة المرضية عن طريق ضبط التعبير عن المنظمين المصب أو تراكم الإشارات التي تؤثر على نشاط منظم. في حين درست التنظيم على نطاق واسع من خلال النمو في المختبر ، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول كيف يتم تعديل التعبير الجيني أثناء الإصابة. هذه المعلومات المهم عند منتج معين جينات مرشح للتدخل العلاجي. مثل النهج النسخي RT-PCR الكمي، في الوقت الحقيقي وتسلسل الحمض النووي الريبي وسائل قوية لدراسة التعبير الجيني على مستوى عالمي، لكنها تعاني من العديد من التحديات التقنية بما في ذلك وفرة منخفضة من الحمض النووي الريبي البكتيرية بالمقارنة مع المضيف الجيش الملكي النيبالي، وعينه تدهور قبل رنسيس. تقييم تنظيم استخدام الصحفيين الفلورسنت سهلة نسبيا، ويمكن أن يكون متعدد مع البروتينات الفلورية مع الخواص الطيفية فريدة من نوعها. الأسلوب يسمح لتحليل التعبير الجيني في الأنسجة التي تظهر التدرجات العمارة والفيزيائية ثلاثية الأبعاد المعقدة التي تؤثر على الشبكات التنظيمية البكتيرية وحيدة الخلية، والزمانية المكانية. هذه المعلومات يتم فقدان عندما يتم حساب متوسط البيانات على معظم السكان. وهنا، يصف لنا طريقة للتحديد الكمي للتعبير الجيني في مسببات الأمراض البكتيرية في الموقع. الأسلوب الذي يستند إلى تجهيز الأنسجة البسيطة والملاحظة المباشرة من الأسفار من البروتينات مراسل. نبدي بفائدة هذا النظام بدراسة التعبير عن المكوّرات العنقودية الذهبية ثيرمونوكليسي (نشاط)، منتج الجين الذي مطلوب للتهرب من الحصانة وضراوة كامل السابقين فيفو والمجراه. ونحن تبين أن نشاط التجارة والنقل هو المعرب عنها بقوة في الخراجات الكلوية وتكشف عن التعبير الجيني غير متجانسة الواجبة في الجزء الظاهر التنظيم المكاني نشاط المروج النشاط في الخراجات منخرطة تماما مع الاستجابة المناعية. يمكن تطبيق الأسلوب لأي جرثومة مع نظام وراثية مانيبولاتابل وأي نموذج العدوى، وتوفير معلومات قيمة للدراسات الإكلينيكية وتطوير العقاقير.

وضعنا بلازميد المستمدة من بماد32 التي يمكن أن يحقق أي مراسل بناء الانصهار في الكروموسوم من جزئ مثلى كروس مزدوجة (الشكل 1). هذا البناء يسمح للتحليل الكمي لأي منطقة التنظيمية التي تدعم إنتاج البروتين بروتينات فلورية خضراء وإشارة مضيئة فوق الخلف?...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

أسلوب Fluorescence المستندة إلى دراسة تنظيم الجينات البكتيرية في الأنسجة المصابة

الموصوفة هنا أسلوب لتحليل تعبير الجينات البكتيرية في الأنسجة الحيوانية على مستوى خلوي. هذا الأسلوب يوفر موردا لدراسة التنوع المظهرية التي تحدث داخل سكان بكتيرية في الاستجابة للبيئة الأنسجة أثناء عدوى.

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

ويمكن لهذه الطريقة أن تكشف عن الأنماط المكانية للتعبير الجيني الجرثومي واستراتيجيات التكيف الفسيولوجي مع بيئات الأنسجة الصغيرة المضيفة التي تضيع عندما يتم متوسطها عبر السكان بأكملهم في الأنسجة. مع هذه التقنية يمكن الكشف عن التجانس المحتملة التي يجب النظر عند تحديد مسارات بكتيرية جديدة والبروتينات التي تستهدفها مضادة للفيروسات أو المركبات المضادة للبكتيريا. تبدأ من قبل streaking سلالات S.aureus من الفائدة على لوحات أجار الدم من مخزون الجلسرين المجمدة واحتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة لتأكيد أنماط ظاهرية انحلالية على أساس قدرتها على إزالة خلايا الدم الحمراء وتشكيل مناطق شفافة واضحة.تلقيح مستعمرة واحدة يعزل كل سلالة في أربعة ملليلتر من مرق الصويا tryptic، أو TSB، في أنابيب زجاجية معقم وتدوير الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة في بكرة أنبوب في زاوية 70 درجة تقريبا و 70 التناوب في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر، أو OD 600، من الثقافات على مقياس الطيف وتمييع الخلايا إلى OD 600 من 0.05 في 25 ملليلتر من TSB العقيمة في خمسة إلى واحد نسبة قارورة إلى حجم في 125 ملليلتر ديلونج قارورة. احتضان الثقافات في حمام الماء 37 درجة مئوية في 280 التناوب في الدقيقة الواحدة والحصاد الخلايا خلال المرحلة الأسي.بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الخلايا مرتين في حجم متساو من برنامج تلفزيوني عقيم. ثم إعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني جديد إلى مرة واحدة 10 إلى مستعمرة الثامنة تشكيل وحدات لكل ملليلتر التركيز لحقنها اللاحقة في المتلقي. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، حصاد الكلى والقلب والكبد والرئتين والطحال في 15 ملليلتر أنابيب البولي بروبلين التي تحتوي على 10٪ buffered formalin ل 24 إلى 48 ساعة حضانة في الظلام في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف أو التناوب.في نهاية التثبيت، تضمين الأعضاء في الأنسجة واضحة تجميد المتوسطة للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. استخدام الكوابيست للحصول على 10 ميكرومتر أقسام الأنسجة السميكة وتجفيف المقاطع على الفردية مسبقا تنظيف الشرائح الزجاجية المشحونة لمدة 20 دقيقة في الظلام قبل تطبيق الثابت تصاعد المتوسطة تكمل مع DAPI. ثم تطبيق زلات الغطاء وعلاج الشرائح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها قبل نقل العينات إلى التخزين على المدى الطويل في أربع درجات مئوية.لتحديد الآفات داخل العينات، ضع شريحة على خشبة مسرح مجهر المجهر الدمجي بالليزر واستخدم هدفًا مناسبًا لتصور الخلايا الفردية للحصول على صور للآفات. لقياس شدة الفلوريسنس داخل الصور confocal، فتح صورة في ImageJ وضبط السطوع والتباين لتصور بشكل صحيح إشارة الفلوريسنس من الآفة. حدد المنطقة موضع الاهتمام باستخدام أداة تحديدات المضلعات وإضافة عائد الاستثمار إلى مدير عائد الاستثمار تحت علامة التبويب تحرير في ImageJ.حدد تحرير، ثم تحديد، وأخيراً إضافة إلى المدير. بعد ذلك، أعد تسمية ROI وتسمية الصورة المعنية. لتعريف المركزية، افتح علامة التبويب تحليل وحدد ناحية، متوسط قيمة رمادية، متوسطة، وحد إلى حد.استخراج قيمة كثافة الفلورس المركزية أو قياس شدة الفلورس في منطقة الوحدة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام دالة تحديد العتبة لتعيين حدود الفلورس السفلي والعلوي حسب الضرورة. قم بتصدير البيانات إلى ملف Excel واحضر عمودًا يشير إلى متوسط كثافة الفلورانس لكل منطقة وحدة للمحيط ولب.لحساب متوسط شدة الفلور لكل وحدة في محيطها ولبها، حدد يدوياً الحدود العليا والدنيا للعتبة. المكورات العنقودية aureus ثيوراتسي الانصهار GFP الفلورسيه الانصهار في المتوسط ما يقرب من تسعة أضعاف أعلى في الخلايا التي تحمل جين الانصهار مما كانت عليه في الخلايا التي لا تحمل الانصهار مراسل. وبالمثل، جنبا إلى جنب dimeric الطماطم الانصهار fluorescence هو حوالي ستة أضعاف أعلى من سيطرة مراسل فارغة.يمكن تأكيد نمط أنشطة المراسل عن طريق تدفق قياس خلايا الأنسجة المتجانسة. على الرغم من أن الاختلافات في طية fluorescence عادة ما تكون أقل. يمكن أن تكون الاختلافات في قياسات الفلوريسين نتيجة للتعبير غير المتجانس للمراسلين.على سبيل المثال، في هذه العينات التمثيلية لوحظ أن بعض الآفات تعبر عن أحد أو كليهما من المراسلين في حدود 100 ميكرومتر تقريباً من المسافة في نفس عينة الأنسجة. فحص نشاط المراسل إلى قرار خلية واحدة في المجتمعات abcess المكورات العنقودية يكشف عن تنظيم مكاني من التعبير الحراري المكوراتية في خراجات محيطة بتلوين DAPI قوي ، من المرجح أن يرتبط بتشكيل وإطلاق الفخاخ خارج الخلية العدلات. على سبيل المثال، لوحظ فلورسي الانصهار في الانصهار في المكورات العنقودية Aureus aureus ثيوفر في القلب الداخلي للمجتمع abcess المكورات العنقودية مقارنة بـ localized إلى المحيط المحيط.في نفس abcess، نمط الفلوري الانصهار الطماطم الترادف يبدو أن مقلوب. ومع ذلك، لم يكن النمط في هذه التجربة ذا دلالة إحصائية. الحصول على تشريح التبريد المضمنة سليمة أمر حيوي لتحليل صورة الفلوريسنس وينبغي القيام به بعناية.فرز الخلايا البكتيرية لالتقاط مجموعات فرعية تعبر عن الانصهار بدرجات متفاوتة ، إلى جانب تحليل الحمض النووي الريبي - Seq يمكن أن يضيء التغيرات الجينومية الواسعة في النص. رعاية عند العمل مع formalin كما هو مسرطنة، ويمكن أن يسبب تهيج الجلد, الحساسية, أو تلف العين عند التعرض المباشر. ويمكن أن يساعد توليد مشتقات متحولة من السلالات التي تحمل مراسلي الفلورسنت موضع الاهتمام في الكشف عن الأساس الوراثي للأنماط التنظيمية المكانية الملحوظة.

Research

JoVE Journal

Genetics

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

ريتروفيرال المسح الضوئي: تعيين مواقع تكامل ملف لتحديد المناطق التنظيمية الخاصة بالخلية

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

ميكرويرادييشن الليزر لدراسة في فيفو الاستجابات الخلوية لأضرار بسيطة ومعقدة الحمض النووي

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

أسلوب أوبتوجينيتيك لمراقبة وتحليل أنماط التعبير الجيني في تفاعلات الخلية للخلية

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

أسلوب لدراسة تعدد الأشكال C924T الجينات مستقبلات A2 ثرومبوكاني

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

التلاعب بالجينات الدالة في كافيفيش المكسيكي

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

لينتيفيروسي تسكت الجينات بوساطة في الزائفة البشرية أعدت في لوحات مرفق منخفضة

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...