Name: a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
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我们感谢亚历山大·霍斯威尔赠送的 psarap1-ttoto融合, 并感谢 karen creswell 对流式细胞术分析的帮助。我们还感谢阿丽萨·金就统计分析提出的建议。这项工作的部分资金来自国家卫生研究院探索者/发展研究奖 (赠款 AI123708) 和向工代机构提供的教职员工创业基金。资助者在研究设计、数据收集和解释方面没有任何作用, 也没有决定将作品提交出版。

这里描述的所有方法都得到了乔治敦大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。
1. 荧光记者应变的产生
<ol><li>用 ecori 和 smai 限制性酶依次消化基因组整合性 rb4 载体。按照制造商的协议, 在25°c 下使用1μg 的 prb4 建立一个隔夜消化, 然后在37°c 下通过在反应混合物中添加 ecori 进行1h 的第二次消化。在65°c 孵育 20分钟, 使酶失活。</li>
	<li>pcr 扩增了基因组 dna 感兴趣的调控?...

由于获得抗生素耐药性决定因素46, 细菌传染病是全世界日益严重的健康问题。由于适应宿主环境对于感染过程中的生长和生存至关重要, 因此针对提高病原体适应性的基因表达程序的策略可能会被证明是有用的治疗方法。其中一个程序是由 SaeR/S s 双组分系统 (tcs) 控制的一组基因, 以前所显示的在免疫逃避中起着至关重要的作用47。SaeR/S 是由多种因素引起的, 最?...

细菌通过不同表达适应和生存所需的基因来应对环境中不断变化的生理条件和营养状态的变化。例如, 机会性病原体在体型相对较低的地方对体表进行殖民, 而且往往是无害的。然而, 一旦细菌已经穿透物理和化学屏障, 它必须与宿主免疫细胞的反防御和限制营养的可用性1。例如, 金黄色葡萄球菌在大约三分之一的人口中进行了无症状的殖民, 但也是造成破坏性皮肤和软组织感染、骨髓炎、心内膜炎和菌血症 2的原因。金黄色葡萄球菌作为病原体的成功通常归功于其代谢灵活性, 以及一系列与表面相关和分泌的毒力因子, 使细菌能够逃离血液并在外周组织中复制3,4,5。由于葡萄球菌病引起的宿主死亡是进化的死胡同, 限制了对新宿主6的传播, 因此必须谨慎控制对毒力因子生产的承诺。
一个复杂的蛋白质调节网络和非编码 rna 响应各种环境刺激, 包括细胞密度、生长阶段、中性粒细胞相关因素和营养物质的供应, 以确保毒力基因在宿主组织内的精确时间和位置7、8、9、10、11、12、13.例如, SaeR/S 双组分系统 (tcs) 通过传感器激酶 (saes) 和响应调节器 (saer)14调节几个毒力因子的表达。sais 是在保守的组氨酸残留物上自动磷酸化的, 以响应宿主信号 (例如,人类中性粒细胞肽 (hnps), 钙儿热锡) 8,15,16。然后将磷基转移到 sael 上的天冬氨酸残渣中, 将其激活为 dna 结合蛋白 (saer ~ p)17。SaeR/S tcs 调节20多个基因, 这些基因有助于其发病机制, 包括纤维连接蛋白结合蛋白 (FnBPs)、白细胞介素和凝血酶14、18、19、20.目标可分为高亲和力和低亲和力基因靶标, 当暴露在线索21下, 随着 saer ~ p 水平的升高, 很可能会诱发高亲和力和低亲和力基因靶标。SaeR/S 活性由基因表达的其他调节剂控制, 如 agr 仲裁传感系统、毒素蛋白抑制剂 (rot) 和替代西格玛因子 b (sigma)22、23、24.
nuc是金黄色葡萄球菌中的一种与 sae 依赖的毒力基因, 并编码了热尿 (nk), 这对于从顺性疾病和细胞t (net) 中的逃逸和传播是必不可少的。感染过程25,26。在支链氨基酸和 gtp27存在的情况下, cody也会强烈地抑制血指的表达, 而葡萄球菌辅助调节剂蛋白 sara28,29 直接抑制着共色的表达., 其活性受氧气 (氧化还原状态) 和 ph 值30的影响.鉴于在小鼠感染模型中, sae和cc突变体被衰减, 因此有兴趣开发抑制其相应活动的化学干预措施26、31。尽管如此, 没有关于他们在感染期间的监管的信息。
荧光记者已被用来监测和量化单个细胞水平上的基因表达。在此, 我们提出了一种量化s的方法。金黄色葡萄球菌在感染过程中的基因表达, 当与体外转录组分析和强大的成像技术, 如磁共振成像 (mri) 和磁共振波谱 (mrs), 可以揭示细菌如何生理在体内调节, 而营养物质在某些位位中的相对丰度。该方法可应用于任何具有可追踪遗传系统的细菌病原体。
基因组整合载体概述。
基因组整合载体 prb4 包含来自金黄色葡萄球菌 300 SAUSA300_0087 伪基因上游和下游区域的 500个碱基对, 以促进同源重组。prb4 来源于对温度敏感的 pmad 载体主干, 其中含有红霉素耐药盒 (ermc) 和热稳定性β-半乳糖苷酶基因bgaB , 用于重组剂的蓝白筛选32。工程记者结构还包含一个氯霉素耐药标记 (猫) 选择后基因组整合和质粒消除, 以及 ecri 和 smai 网站融合监管区域感兴趣的超级文件夹绿色荧光蛋白 (sgfp) (图 1)。人们知道核糖体结合位点 (rbs) 的选择会影响记者的活动, 往往需要经验优化33。因此, 不提供苏格兰皇家银行。在这里, 本地核糖体结合位点被用来提供更自然的基因表达模式, 但其他位点可能会被使用。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">5% sheep blood</td>
			<td style="width:343px;">Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td>
			<td style="width:139px;">A10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:343px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">C57Bl/6 Mice</td>
			<td style="width:343px;">Charles River</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">C-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture, Cap</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D+2:25NA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miniprep, plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaking water bath</td>
			<td>New Brunswick Innova</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR purification</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:343px;">Cellgrow</td>
			<td style="width:139px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:343px;">Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-Kan</td>
			<td>GenScript (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Q5 Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:367px;">Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6300L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sanger Sequencing</td>
			<td>Genewiz (Germantown, MD)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sub Xero clear tissue freezing medium</td>
			<td>Mercedes Medical</td>
			<td style="width:139px;">MER5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superloop</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe, Filter</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto 40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S11351</td>
			<td>Membrane permeant nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:343px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">90000-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter-DU350</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues

细菌毒力基因通常在转录水平上受到多种因素的调节, 这些因素对不同的环境信号做出反应。一些因素直接作用于毒力基因;其他人则通过调整下游调节器的表达或影响调节器活动的信号的积累来控制其发病机制。虽然在体外生长过程中对调节进行了广泛的研究, 但对感染期间如何调整基因表达的了解相对较少。当特定的基因产品是治疗干预的候选产品时, 这样的信息很重要。转录方法, 如定量, 实时 rt-pcr 和 rna-seq 是在全球范围内检查基因表达的有力方法, 但也面临许多技术挑战, 包括细菌 rna 的低丰度相比, 和样本由 rnase 降解。使用荧光记者评估调节相对容易, 并且可以使用具有独特光谱特性的荧光蛋白进行多路复用。该方法允许对表现出复杂的三维结构和影响细菌调控网络的物理化学梯度的组织中的基因表达进行单细胞、时空分析。当数据对大宗人口进行平均时, 就会丢失此类信息。在此, 我们描述了一种定量基因表达的方法,在细菌病原体中的原位。该方法基于简单的组织处理和对报告蛋白荧光的直接观察。我们通过检查金黄色葡萄球菌的表达证明了该系统的效用, 其基因产物是免疫逃避和体内完全毒性所必需的。我们发现, 核酸-gfp在肾脏脓肿中表达强烈, 并揭示异质性基因表达的部分原因是明显的空间调节的酶启动子活性与免疫反应。该方法可应用于任何具有可操纵遗传系统和任何感染模型的细菌, 为临床前研究和药物开发提供有价值的信息。

我们开发了一种从 pmad32中提取的质粒, 它可以通过双交叉同源重组将任何记者融合结构传递到染色体中 (图 1)。这种结构允许对支持在背景上生产 gfp 蛋白和荧光信号的任何监管区域进行定量分析。质粒赋予安培耐药 (apr),用于大肠杆菌的维持和繁殖, 并赋予金黄色葡萄球菌红霉素耐药性 (emr) .该结构还具...

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A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

基于荧光的感染组织细菌基因调控方法

本文介绍了一种在细胞水平上分析动物组织中细菌基因表达的方法。该方法为研究细菌种群中发生的表型多样性提供了资源, 以应对感染过程中的组织环境。

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

这种方法可以揭示细菌基因表达的空间模式和生理适应宿主组织微环境的策略，这些环境在组织中整个种群中平均时丢失。使用这种技术，可以检测到潜在的异质性，在确定新的细菌途径和蛋白质时，必须考虑抗病毒或抗菌化合物的目标。首先从冷冻甘油库存中条纹血脂盘上感兴趣的S.aureus菌株，并在37摄氏度下孵育血版，16至24小时，以基于其对红血球进行解压和形成透明区域的能力来确认其血解表型。在无菌玻璃管中，将每株单菌落分离在四毫升的尝试大豆汤（TSB）中，并在37摄氏度的管辊中以约70度角和每分钟70次旋转旋转管管16至24小时。第二天早上，测量分光光度计培养物的光学密度为600纳米（OD 600），并在25毫升无菌TSB中，以5至1瓶的体积比在125毫升德龙烧瓶中稀释至0.05的OD 600。在37摄氏度的水浴中孵育培养物，每分钟旋转280次，并在指数阶段收获细胞。通过离心使细胞产生离心，并在同等体积的无菌PBS中洗涤细胞两次。然后将新鲜PBS中的细胞重新注入到每毫升浓度形成单位的第八个菌落的1倍，供它们随后注射到接受动物体内。在适当的实验终点，将肾脏、心脏、肝脏、肺和脾脏收获到15毫升聚丙烯管中，含有10%缓冲的甲醛，在室温下在黑暗中通过温和的摇动或旋转孵育24至48小时。在固定结束时，将器官嵌入透明组织冷冻介质中，在零下80摄氏度储存。使用低温恒温器获取 10 微米厚的组织部分，并在黑暗中干燥单个预清洁带电玻璃幻灯片上的部分 20 分钟，然后应用硬安装介质，辅以 DAPI。然后应用盖板，并在室温下一夜之间固化幻灯片，然后将样品转移到四摄氏度的长期储存中。要识别样品中的病变，请将幻灯片放在激光扫描共认显微镜的舞台上，并使用适当的目标来可视化单个细胞，以获得病变的图像。要测量共合图像中的荧光强度，请打开 ImageJ 中的图像并调整亮度和对比度，以正确可视化病变的荧光信号。使用多边形选择工具定义感兴趣的区域，并将 ROI 添加到 ImageJ 中的"编辑"选项卡下的 ROI 管理器。选择"编辑"，然后选择，最后选择"添加到管理器"。接下来，重命名 ROI 并标记相应的映像。要定义质心，请打开"分析"选项卡并选择"面积、平均灰色值、中心值"和"限制阈值"。提取重心荧光强度值或测量给定单位面积给定病变中平均荧光强度。这可以通过使用阈值函数设置下荧光限值和上荧光限值来达到此目的。将数据导出到 Excel 文件，并准备一列，指示外围和核心单位区域的单位平均荧光强度。要计算外围和核心单位面积的均荧光强度，请手动定义阈值的上限和下限。金黄色葡萄球菌热核素聚变GP融合荧光在携带融合基因的细胞中平均比不携带记者融合的细胞高近9倍。同样，串联二元番茄聚变荧光比空处理者控制高大约六倍。记者活动的模式可以通过流动细胞学与组织均质体来证实。虽然荧光的折叠差异通常较低。荧光测量的变化可能是由于记者的异构表达。例如，在这些代表性的样品中，观察到在同一组织样本中，有些病变表示一个或两个记者在大约100微米的距离内。检查记者在金黄色葡萄球菌群落中单细胞分辨率的活动，可以发现金黄色葡萄球菌热核素酶表达在脓肿中的空间调节，这些脓肿受到强DAPI染色，可能与中性粒细胞外陷阱的形成和释放有关。例如，与局部到外围相比，在金黄色葡萄球菌聚变聚变荧光中观察到明显高于金黄色葡萄球菌。在同一个 abces 中，串联二元番茄融合荧光的模式似乎倒置。但是，此实验中的模式在统计学上并不显著。获得完整的低温嵌入解剖对于荧光图像分析至关重要，应谨慎进行。对细菌细胞进行排序，以捕获不同程度表达融合的亚群，加上RNA-Seq分析，可以照亮转录组基因组范围的变异。使用甲醛时小心，因为它是致癌物质，在直接接触时可能导致皮肤刺激、过敏反应或眼睛损伤。生成携带荧光报告者兴趣的菌株的突变衍生物有助于揭示观察到的空间调控模式的遗传基础。

Research

JoVE Journal

Genetics

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Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

科研

遗传学

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用新的转介导法测定大肠杆菌中 DNA 元素的最佳染色体位置 (s)

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Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

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