Name: a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

Wij danken Alexander Horswill voor de gave van de PsarAP1- tdTomato fusion, en Karen Creswell voor hulp bij stroom cytometry analyse. Wij danken ook Alyssa King voor advies over statistische analyse. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door een NIH exploratiepremies/Developmental Research Award (grant AI123708) en SRB fondsen faculteit opstarten. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en interpretatie, of de beslissing tot het indienen van het werk voor publicatie.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Georgetown.
1. generatie van de fluorescerende verslaggever stam
<ol><li>De genoom integratieve pRB4 vector opeenvolgend met EcoRI en SmaI restrictie-enzymen verteren. Volgens de fabrikant protocol, opzetten van een overnachting spijsvertering met SmaI met behulp van 1 microgram van pRB4 bij 25 ° C, en ga vervolgens verder met de tweede spijsverteri...

Bacteriële infectieziekten zijn een toenemend gezondheidsprobleem wereldwijd als gevolg van de overname van antibioticaresistentie determinanten46. Omdat aanpassing aan de host-omgevingen essentieel voor groei en overleving tijdens de infectie is, kunnen strategieën gericht op gen expressie programma's waardoor pathogen fitness nuttig therapeutisch. Een dergelijk programma is de verzameling van genen gecontroleerd door de SaeR/S 2-componenten systeem (TCS), om te spelen een essentiële rol bij i...

Bacteriën reageren op de veranderende fysiologische omstandigheden en veranderingen in de voeding van hun omgeving door het differentieel uiten genen nodig voor aanpassing en overleving. Bijvoorbeeld, koloniseren opportunistische pathogenen lichaam oppervlakken op relatief lage dichtheden, en zijn vaak onschuldig. Echter, zodra de bacterie doorgedrongen de fysische en chemische belemmeringen tot is, moet het kampen met host immuun cel contra verdedigingen en beperkte beschikbaarheid van nutriënten1. Als voorbeeld, Staphylococcus aureus koloniseert ongeveer eenderde van de bevolking asymptomatically, maar is ook de oorzaak van de verwoestende huid en weke delen infecties, osteomyelitis, endocarditis en bacteriëmie2. Het succes van S. aureus als een ziekteverwekker wordt vaak toegeschreven aan de metabole flexibiliteit, alsmede een arsenaal van oppervlak-geassocieerde en secreted virulentiefactoren waarmee de bacterie te ontsnappen van de bloedbaan en repliceren in perifere weefsels 3,4,5. Omdat host overlijden ten gevolge van Staphylococcus ziekte een evolutionaire doodlopende en grenzen overbrenging op nieuwe hosts6 is, moet het streven naar virulentie factor productie zorgvuldig worden gecontroleerd.
Een complexe regelgeving netwerk van eiwitten en niet-coderende RNAs reageert op een verscheidenheid van milieu stimuli, met inbegrip van cel dichtheid, groeifase neutrofiele-geassocieerde factoren en nutriënten beschikbaarheid, om ervoor te zorgen dat virulentiegenen worden uitgedrukt in de precieze tijd en locatie in gastheer weefsel7,8,9,10,11,12,13. Bijvoorbeeld, regelt de SaeR/S 2-componenten systeem (TCS) expressie van verschillende virulentiefactoren via de sensor kinase (SaeS) en de reactie regulator (SaeR)14. SaeS is autophosphorylated op een residu van de geconserveerde histidine in reactie op host signalen (b.v., menselijke neutrofiele peptiden [HNPs], calprotectin)8,15,16. De fosforyl-groep wordt vervolgens overgebracht naar een aspartaat residu op SaeR, activeren als een DNA-bindend-proteïne (SaeR ~ P)17. De SaeR/S TCS regelt meer dan 20 genen die bijdragen aan de pathogenese waaronder fibronectine bindende proteïnen (FnBPs), leukocidins en coagulase14,18,19,20. Doelstellingen kunnen worden ingedeeld in hoge-affiniteit en lage-affiniteit gene doelstellingen, die waarschijnlijk veroorzaakt als het niveau van de SaeR ~ P stijgt wanneer blootgesteld aan haar signalen21. De SaeR/S activiteit wordt beheerd door andere regelgevers van genexpressie zoals de Agr quorum sensing systeem, onderdrukker van toxines eiwitten (Rot), en de alternatieve sigma factor B (SigB)22,23,24.
NOC is een Sae-afhankelijke virulentie gen in Staphylococcus aureus en codeert thermonuclease (NOC), die essentieel is voor het ontsnappen uit neutrophilic extracellular traps (netten) en voor verspreiding tijdens de cursus van infectie25,26. De uitdrukking van NOC is ook sterk indirect onderdrukt door CodY in aanwezigheid van vertakte-keten aminozuren en GTP27, en direct onderdrukt door de Staphylococcus accessoire regelgever proteïne SarA28,29 , waarvan de activiteit wordt beïnvloed door zuurstof (redox staat) en pH30. Gezien het feit dat sae en NOC mutanten zijn verzwakt in muismodellen van infectie, is er interesse in de ontwikkeling van chemische interventies die een remmende werking van hun overeenkomstige activiteiten26,31. Ondanks dit is er geen informatie met betrekking tot hun verordening tijdens de infectie.
Fluorescerende verslaggevers werden gebruikt om te controleren en te kwantificeren van genexpressie op het niveau van één cel. Hierin presenteren wij een methode voor de kwantificering van S. aureus genexpressie gedurende infectie die, wanneer in paren gerangschikt met in vitro transcriptome analyse en krachtige imaging technieken zoals magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en magnetische resonantie spectroscopie (MRS), kan onthullen hoe bacteriële Fysiologie is geregeld in vivo en de relatieve abundanties van voedingsstoffen in bepaalde niches. De methode kan worden toegepast op eventuele bacteriële pathogenen met een hanteerbare genetische systeem.
Overzicht van het genoom integratieve vector.
Het genoom integratieve vector pRB4 bevat 500 basenparen elk van de upstream- en downstream regio's van de S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene te vergemakkelijken van homologe recombinatie. pRB4 is afgeleid van de temperatuurgevoelige pMAD vector ruggengraat met de erythromycine weerstand cassette (ermC) en de thermostable beta-galactosidase gene bgaB voor blauw/wit screening van recombinanten32. De gemanipuleerde verslaggever construct bevat ook een chlooramfenicol weerstand marker (kat) voor selectie na genoom integratie en uitbanning van de plasmide, evenals EcoRI en SmaI sites om te fuseren de regelgevende regio van belang zijn voor superfolder groen fluorescente proteïne (sGFP) (Figuur 1). Het is bekend dat de keuze van ribosoom bindende site (RBS) de activiteit van de verslaggever beïnvloedt, en vaak empirische optimalisatie33 vereist. Dus, een RBS wordt niet geleverd. Hier is de inheemse ribosoom bindende site wordt gebruikt om te voorzien in een meer natuurlijke patroon van genexpressie, maar andere sites mogen worden gebruikt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">5% sheep blood</td>
			<td style="width:343px;">Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td>
			<td style="width:139px;">A10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:343px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">C57Bl/6 Mice</td>
			<td style="width:343px;">Charles River</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">C-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture, Cap</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D+2:25NA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miniprep, plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaking water bath</td>
			<td>New Brunswick Innova</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR purification</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:343px;">Cellgrow</td>
			<td style="width:139px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:343px;">Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-Kan</td>
			<td>GenScript (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Q5 Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:367px;">Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6300L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sanger Sequencing</td>
			<td>Genewiz (Germantown, MD)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sub Xero clear tissue freezing medium</td>
			<td>Mercedes Medical</td>
			<td style="width:139px;">MER5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superloop</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe, Filter</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto 40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S11351</td>
			<td>Membrane permeant nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:343px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">90000-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter-DU350</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues

Bacteriële virulentiegenen zijn vaak op het transcriptional niveau geregeld door meerdere factoren die inspelen op de verschillende Milieusignalen. Sommige factoren optreden rechtstreeks op virulentiegenen; anderen controleren pathogenese door de uitdrukking van downstream toezichthouders of de accumulatie van signalen die invloed hebben op de activiteit van de regelaar aan te passen. Terwijl de verordening is uitgebreid onderzocht tijdens de in vitro groei, is relatief weinig bekend over hoe genexpressie is geherwaardeerd tijdens de infectie. Dergelijke informatie is belangrijk wanneer het product van een bepaald gen een kandidaat voor therapeutische interventie is. Transcriptionele benaderingen zoals kwantitatieve, real-time RT-PCR en RNA-Seq zijn krachtige methoden voor het onderzoeken van genexpressie op mondiaal niveau maar lijden met vele technische uitdagingen, met inbegrip van lage overvloed van bacteriële RNA vergeleken met host RNA en monster aantasting door RNases. Evaluatie van de verordening met behulp van fluorescerende verslaggevers is relatief eenvoudig en kan worden multiplexed met fluorescerende eiwitten met unieke spectrale eigenschappen. De methode geschikt is voor eencellige, Spatio analyse van genexpressie in weefsels die vertonen complexe driedimensionale architectuur en physiochemical verlopen die invloed hebben op bacteriële regulerende netwerken. Deze informatie gaat verloren wanneer de gegevens zijn gemiddeld over de bevolking van de bulk. Hierin beschrijven we een methode voor de kwantificering van de genexpressie in bacteriële pathogenen in situ. De methode is gebaseerd op eenvoudige weefsel verwerking en directe observatie van fluorescentie van verslaggever eiwitten. We tonen het nut van dit systeem door onderzoek van de expressie van Staphylococcus aureus thermonuclease (NOC), wiens gene product vereist voor immuun belastingontduiking en volledige virulentie ex vivo en in vivo is. We laten zien dat NOC-gfp wordt sterk uitgedrukt in renal abcessen en heterogene genexpressie verschuldigde gedeeltelijk openbaren aan schijnbare ruimtelijke verordening voor NOC promotor activity in abcessen volledig betrokken bij de immuunrespons. De methode kan worden toegepast op elke bacterie met een manipulatable genetische systeem en ieder model van de infectie, verstrekken van waardevolle informatie voor preklinische studies en Geneesmiddelenontwikkeling.

We ontwikkelden een plasmide afgeleid van pMAD32 , die een verslaggever leveren kan fusion constructie in het chromosoom door dubbele crossover homologe recombinatie (Figuur 1). Deze constructie zorgt voor de kwantitatieve analyse van alle regelgevende regio die ondersteuning biedt voor de productie van GFP eiwit en fluorescent signaal boven achtergrond. Het plasmide verleent ampicilline-resistentie (Apr) voor onderhoud en v...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Deze methode kan ruimtelijke patronen van bacteriële genexpressie en strategieën voor fysiologische aanpassing aan gastheer weefsel micro-omgevingen die verloren gaan wanneer gemiddeld over de gehele bevolking in weefsels onthullen. Met deze techniek kunnen potentiële heterogeniteiten worden gedetecteerd die moeten worden overwogen bij het identificeren van nieuwe bacteriële paden en eiwitten die het doelwit zijn van antivirulentie of antibacteriële verbindingen. Begin met het strepen van S.aureus stammen van belang op bloed agar platen uit een bevroren glycerol voorraad en het uitbroeden van de platen op 37 graden Celsius voor 16 tot 24 uur om hun hemolytische fenotypes te bevestigen op basis van hun vermogen om rode bloedcellen lyse en duidelijke transparante zones te vormen.Inoculeren enkele kolonie isolaten van elke stam in vier milliliter van tryptische sojabouillon, of TSB, in steriele glazen buizen en draai de buizen op 37 graden Celsius gedurende 16 tot 24 uur in een buis roller in een hoek van ongeveer 70 graden en 70 rotaties per minuut. De volgende ochtend meet de optische dichtheid op 600 nanometer, of OD 600, van de culturen op een spectrofotometer en verdun de cellen tot een OD 600 van 0,05 in 25 milliliter steriele TSB bij een verhouding van vijf tot één kolf tot volume in 125 milliliter Delong kolven. Broed de culturen in een 37 graden Celsius waterbad bij 280 rotaties per minuut en oogst de cellen tijdens de exponentiële fase.Pellet de cellen door centrifugatie en was de cellen twee keer in een gelijk volume van steriele PBS. Dan resuspend de cellen in verse PBS aan één keer 10 aan de achtste kolonievormende eenheden per milliliterconcentratie voor hun verdere injectie in een ontvangend dier. Op het juiste experimentele eindpunt, oogst de nier, hart, lever, longen, en milt in 15 milliliter polypropyleen buizen met 10% gebufferd formaline voor een 24 tot 48 uur incubatie in het donker bij kamertemperatuur met zachte schudden of rotatie.Aan het einde van de fixatie, insluiten van de organen in helder weefsel bevriezing medium voor opslag bij min 80 graden Celsius. Gebruik een cryostat om 10 micrometer dikke weefselsecties te verwerven en droog de secties op individuele voorgezuiverde geladen glasplaten gedurende 20 minuten in het donker voordat u hard montagemedium toepast, aangevuld met DAPI. Breng vervolgens afdekbonen aan en genees de glijbanen 's nachts bij kamertemperatuur voordat u de monsters overbrengt naar langdurige opslag bij vier graden Celsius.Om laesies in de monsters te identificeren, plaatst u een dia op het podium van een confocale microscoop voor laserscannen en gebruikt u een geschikt doel voor het visualiseren van individuele cellen om beelden van de laesies te verkrijgen. Als u de fluorescentieintensiteiten in de confocale beelden wilt meten, opent u een afbeelding in ImageJ en past u de helderheid en het contrast aan om het fluorescentiesignaal van de laesie goed te visualiseren. Definieer het interessegebied met behulp van het gereedschap veelhoekselecties en voeg de ROI toe aan de ROI-manager onder het tabblad Bewerken in ImageJ.Selecteer Bewerken, vervolgens Selecteren en ten slotte Toevoegen aan Beheer. Wijzig vervolgens de naam van de ROI en label de desbetreffende afbeelding. Als u de centroid wilt definiëren, opent u het tabblad Analyseren en selecteert u Gebied, Gemiddelde grijze waarde, Centroid en Limiet tot drempelwaarde.Haal de centroid fluorescentieintensiteit of meet de gemiddelde fluorescentieintensiteit in een bepaald laesiegebied per eenheid. Dit kan worden bereikt door de drempelfunctie te gebruiken om de lagere en bovenste fluorescentielimieten zo nodig in te stellen. Exporteer de gegevens naar een Excel-bestand en bereid een kolom voor met de gemiddelde fluorescentieintensiteit per eenheidsgebied voor de periferie en kern.Om de gemiddelde fluorescentieintensiteiten per eenheidsgebied in de periferie en kern te berekenen, definieert u handmatig de boven- en ondergrenzen van drempels. Staphylococcus aureus thermonuclease GFP fusiefluorescentie is gemiddeld bijna negenvoudig hoger in cellen die het fusiegen dragen dan in cellen die de reporterfusie niet dragen. Op dezelfde manier, tandem dimeric Tomato fusie fluorescentie is ongeveer zes keer hoger dan de null reporter controle.Het patroon van de activiteiten van de verslaggever kan worden bevestigd door stroomcytometrie met weefselhomogenates. Hoewel de vouwverschillen in fluorescentie meestal lager zijn. Variaties in de fluorescentie metingen kunnen te wijten zijn aan heterogene expressie van de verslaggevers.In deze representatieve monsters werd bijvoorbeeld geconstateerd dat sommige letsels één of beide verslaggevers binnen ongeveer 100 micrometer afstand in hetzelfde weefselmonster uitdrukten. Het onderzoeken van de reporter activiteit om een enkele cel resolutie in staphylococcal abces gemeenschappen onthult een ruimtelijke regulering van staphylococcus aureus thermonuclease expressie in abcessen begrensd met sterke DAPI vlekken, waarschijnlijk geassocieerd met de vorming en het vrijkomen van neutrofiele extracellulaire vallen. Bijvoorbeeld, significant hogere staphylococcus aureus thermonuclease GFP fusie fluorescentie wordt waargenomen in de binnenkern van de staphylococcal abcess gemeenschap in vergelijking met gelokaliseerd naar de periferie.In dezelfde abcess, het patroon voor de tandem dimeric Tomato fusie fluorescentie lijkt te zijn omgekeerd. Het patroon in dit experiment was echter statistisch niet significant. Het verkrijgen van intacte cryo-embedded dissecties is van vitaal belang voor de fluorescentie beeldanalyse en moet zorgvuldig worden gedaan.Het sorteren van de bacteriële cellen om subpopulaties vast te leggen die de fusie in verschillende mate uitdrukken, in combinatie met RNA-Seq-analyse, kunnen genoombrede veranderingen in het transcriptoom verlichten. Let op bij het werken met formaline omdat het een kankerverwekkende stof is en huidirritatie, allergische reacties of oogschade kan veroorzaken bij directe blootstelling. Het genereren van gemuteerde derivaten van stammen die fluorescerende reporters van belang dragen, kan helpen de genetische basis voor de waargenomen ruimtelijke regelgevingspatronen te onthullen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retrovirale Scanning: Mapping MLV Integration Sites om de specifieke codespecifieke regio&#39;s te definiëren

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Een methode om te studeren het C924T polymorfisme van het Thromboxaan A2-Receptor gen

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Verkennen van de wortel Microbiome: extraheren van gegevens van de bacteriële Gemeenschap uit de bodem, de rhizosfeer, en de wortel Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentivirale gemedieerde gen-uitschakeling in humaan pseudo-eilandje bereid in lage bevestigings platen

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...