Name: a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
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Wir danken Alexander Horswill für das Geschenk der PsarAP1- TdTomato Fusion, und Karen Creswell für Hilfe mit Flow-Zytometrie-Analyse. Wir danken auch Alyssa King für eine Beratung zur statistischen Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil durch ein NIH unsystematisch/Developmental Research Award (Grant AI123708) und Fakultät Start Fonds SRB finanziert. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerfassung und Auslegung oder die Entscheidung, das Werk zur Veröffentlichung einreichen.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Georgetown University genehmigt.
1. Generation der fluoreszierenden Reporter Belastung
<ol><li>Den Genom integrative pRB4 Vektor sequenziell mit EcoRI und SmaI Restriktionsenzymen zu verdauen. Nach Protokoll des Herstellers, eine Übernachtung Verdauung mit SmaI mit 1 µg der pRB4 bei 25 ° C, und fahren Sie dann mit der zweiten Verdauung für 1h bei 37 ° C, indem Sie das Reaktionsg...

Bakterielle Infektionskrankheiten sind eine wachsende Gesundheitsproblem weltweit durch den Erwerb von Antibiotikaresistenz Determinanten46. Denn Anpassung an Hostumgebungen wichtig für Wachstum und Überleben während der Infektion, können Strategien zielen gen-Ausdruck-Programme, die Erreger Fitness steigern therapeutisch nützlich erweisen. Ein solches Programm ist der Satz von Genen von SaeR/S zwei Komponentensystem (TCS), zuvor gezeigt, dass eine wichtige Rolle im Immunsystem Steuerhinterzi...

Bakterien reagieren auf veränderte physiologische Bedingungen und Veränderungen in der Ernährungszustand ihres Umfeldes differentiell zum Ausdruck bringen, Gene, die für Anpassung und das Überleben erforderlichen. Zum Beispiel besiedeln opportunistische Krankheitserreger Körper Oberflächen bei relativ geringer Dichte und sind oft harmlos. Jedoch sobald das Bakterium physikalische und chemische Barrieren eingedrungen ist, muss es mit Host Immunzelle Counter Abwehrkräfte und eingeschränkte Nährstoffverfügbarkeit1zu kämpfen. Als Beispiel Staphylococcus Aureus kolonisiert ungefähr ein Drittel der Bevölkerung asymptomatisch aber ist auch die Ursache des verheerenden Haut und Weichteilinfektionen, Osteomyelitis, Endokarditis und Bakteriämie2. Der Erfolg von S. Aureus als ein Pathogen ist oft seine metabolischen Flexibilität sowie ein ganzes Arsenal an Oberfläche verbunden und sekretierten Virulenzfaktoren, die es das Bakterium ermöglichen zu den Blutkreislauf zu entkommen und zu replizieren in peripheren Geweben zugeschrieben 3,4,5. Da Host Tod durch Staphylokokken Krankheit eine evolutionäre Sackgasse und Grenzen Übertragung auf neue Gastgeber6ist, muss die Verpflichtung zur Virulenz Faktor Produktion sorgfältig kontrolliert werden.
Einem komplexen regulatorischen Netzwerk von Proteinen und nicht-kodierende RNAs reagiert auf vielfältige Reize aus der Umwelt, einschließlich der Zelle Dichte, Wachstumsphase, Neutrophilen-assoziierte Faktoren und Nährstoffverfügbarkeit, um sicherzustellen, dass die Virulenz Gene exprimiert werden, bei der genaue Zeit und Ort im Host Gewebe7,8,9,10,11,12,13. Beispielsweise regelt das SaeR/S zwei-Komponentensystem (TCS) Ausdruck von mehreren Virulenzfaktoren über die Sensor-Kinase (SaeS) und der Reaktion Regler (SaeR)14. SaeS ist Autophosphorylated auf einen konservierten Histidin Überrest in Reaktion auf Host Signale (z.B., menschlichen Neutrophilen Peptide [HNPs], Calprotectin)8,15,16. Die Phosphoryl-Gruppe wird dann ein Aspartat-Rückstand auf SaeR, aktivieren es als ein DNA-bindendes Protein übertragen (SaeR ~ P)17. Die SaeR/S TCS regelt über 20 Gene, die zur Pathogenese einschließlich Fibronektin-bindende Proteine (FnBPs), Leukocidins und Coagulase14,18,19,20beitragen. Ziele lassen sich einteilen in hohe Affinität und niedrige Affinität gen Ziele, die geeignet sind, als das Niveau der SaeR induzierte ~ P steigt, wenn die Hinweise21ausgesetzt. Die SaeR/S-Aktivität erfolgt durch andere Regulatoren der Genexpression wie die Agr-Quorum-sensing-System, Repressor der Toxine Protein (Rot) und die alternative Sigma-Faktor B (SigB)22,23,24.
NUC ein Sae-abhängige Virulenz gen in Staphylococcus Aureus und kodiert Thermonuclease (Nuc), die wesentlich für die Flucht aus nEutrophilic eXtracellular tRaps (Netze) und für die Verbreitung während der Verlauf der Infektion25,26. Der Ausdruck der Nuc ist indirekt auch stark unterdrückt von CodY in Anwesenheit von verzweigtkettigen Aminosäuren und GTP27und direkt unterdrückt durch die Staphylokokken Zubehör Regler Protein SarA28,29 , deren Aktivität wird durch Sauerstoff (Redox-Zustand) und pH30beeinflusst. Angesichts der Tatsache, dass Sae und Nuc Mutanten in Mausmodellen der Infektion abgeschwächt werden, gibt es Interesse an der Entwicklung von chemischen Interventionen, die ihre entsprechende Aktivitäten26,31zu hemmen. Trotzdem gibt es keine Informationen über ihre Regulierung während der Infektion.
Fluoreszierende Reporter wurden zur Überwachung und Genexpression auf der Ebene der einzelnen Zelle zu quantifizieren. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Quantifizierung der S. Aureus Genexpression während der Infektion, wenn gepaart mit in-vitro-Transkriptom-Analyse und leistungsstarke bildgebende Verfahren wie Magnetresonanztomographie (MRT) und Magnetresonanz-Spektroskopie (MRS), können zeigen, wie bakterielle Physiologie ist in Vivo und die relativen Häufigkeiten von Nährstoffen in bestimmten Nischen geregelt. Die Methode kann für jede bakterielle Erreger mit einem gefügig genetische System angewendet werden.
Übersicht über das Genom integrative Vektor.
Die Genom-integrative Vektor-pRB4 enthält 500 niedrige Paare aus den vor- und nachgelagerten Regionen von S. Aureus USA300 SAUSA300_0087 Pseudogene homologe Rekombination zu erleichtern. pRB4 leitet sich aus dem temperaturempfindliche pMAD Vektor-Backbone mit Erythromycin Widerstand Kassette (ErmC) und thermostabile Beta-Galaktosidase gen BgaB für blau/weiß-Screening von Recombinants32. Veränderter Reporter Konstrukt enthält auch einen Chloramphenicol-Widerstand-Marker (Katze) für Auswahl nach Genom Integration und Plasmid Beseitigung sowie EcoRI und SmaI Sites zu Sicherung die regulatorischen Region von Interesse für Superfolder grün fluoreszierenden Proteins (sGFP) (Abbildung 1). Es ist bekannt, dass die Wahl der Ribosom Bindungsstelle (RBS) die Aktivität des Reporters beeinflusst und häufig empirische Optimierung33 erfordert. Somit wird eine RBS nicht mitgeliefert. Hier die native Ribosom Bindungsstelle wird verwendet, um ein natürliches Muster der Genexpression zur Verfügung stellen, aber andere Websites verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">5% sheep blood</td>
			<td style="width:343px;">Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td>
			<td style="width:139px;">A10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:343px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">C57Bl/6 Mice</td>
			<td style="width:343px;">Charles River</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">C-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture, Cap</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D+2:25NA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miniprep, plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaking water bath</td>
			<td>New Brunswick Innova</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR purification</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:343px;">Cellgrow</td>
			<td style="width:139px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:343px;">Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-Kan</td>
			<td>GenScript (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Q5 Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:367px;">Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6300L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sanger Sequencing</td>
			<td>Genewiz (Germantown, MD)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sub Xero clear tissue freezing medium</td>
			<td>Mercedes Medical</td>
			<td style="width:139px;">MER5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superloop</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe, Filter</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto 40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S11351</td>
			<td>Membrane permeant nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:343px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">90000-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter-DU350</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues

Bakteriellen Virulenz Gene sind oft auf transkriptioneller Ebene durch mehrere Faktoren reguliert, die auf verschiedenen Umweltsignale reagieren. Einige Faktoren wirken direkt auf die Virulenz Gene; andere Steuern Pathogenese durch Anpassung der Ausdruck der nachgeschalteten Regulierungsbehörden oder die Ansammlung von Signalen, die Regler beeinflussen. Während Verordnung ausgiebig während des Wachstums in Vitro untersucht wurde, ist, relativ wenig bekannt über wie Genexpression während der Infektion angepasst wird. Solche Informationen sind wichtig, wenn ein bestimmtes Gen-Produkt ein Kandidat für eine therapeutische Intervention ist. Transkriptionelle Ansätze wie quantitative, Real-Time RT-PCR und RNA-Seq sind leistungsfähige Möglichkeiten zur Genexpression auf globaler Ebene zu untersuchen, aber leiden viele technische Herausforderungen einschließlich niedrige Fülle von bakteriellen RNA im Vergleich zu Host RNA und Probe Abbau durch RNases. Bewertung der Verordnung mit fluoreszierenden Reporter ist relativ einfach und kann mit fluoreszierenden Proteinen mit einzigartigen spektralen Eigenschaften gemultiplext werden. Die Methode ermöglicht für einzellige, räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression in Geweben, die komplexe dreidimensionale Architektur und physiochemische Gradienten aufweisen, die bakterielle Regulationsnetzwerke beeinflussen. Diese Information geht verloren, wenn Daten über die Masse Bevölkerung gemittelt werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Genexpression in bakterielle Krankheitserreger in Situ. Die Methode basiert auf einfachen Gewebe Verarbeitung und direkte Beobachtung der Fluoreszenz von Reporter Proteine. Wir zeigen den Nutzen dieses System durch die Untersuchung des Ausdrucks von Staphylococcus Aureus Thermonuclease (Nuc), dessen Genprodukt für immun ausweichen und volle Virulenz ex-Vivo- und in-vivo benötigt wird. Wir zeigen, dass Nuc-Gfp äußert sich stark in renalen Abszessen und offenbaren heterogene Genexpression durch teilweise deutlich räumlicher Regulierung der Nuc Promotoraktivität in Abszessen engagiert mit der Immunantwort. Die Methode kann auf jedes Bakterium mit einem manipulierbar genetische System und jede Infektionsmodell, Bereitstellung von wertvollen Informationen für präklinische Studien und Entwicklung von Medikamenten angewendet werden.

Wir entwickelten ein Plasmid abgeleitet pMAD32 , die jeder Reporter liefern kann Fusion Konstrukt in das Chromosom durch doppelte Crossover homologe Rekombination (Abbildung 1). Diese Konstruktion ermöglicht Quantitative Analyse aller regulatorischen Regionen, die die Produktion von GFP-Protein und Fluoreszenzsignal über Hintergrund unterstützt. Das Plasmid verleiht die Ampicillin-Resistenz (Ap-f) für die Pflege und Verm...

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A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Eine Fluoreszenz basierende Methode, bakterielle Genregulation in infizierten Gewebe zu studieren

Hier beschrieben ist eine Methode zur Analyse von bakteriellen Genexpression in tierischem Gewebe auf zellulärer Ebene. Diese Methode bietet eine Ressource für das Studium der phänotypische Vielfalt innerhalb einer Bakterienpopulation in Reaktion auf die Umwelt Gewebe während einer Infektion auftreten.

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Diese Methode kann räumliche Muster der bakteriellen Genexpression und Strategien für die physiologische Anpassung an Wirtsgewebe-Mikroumgebungen aufdecken, die verloren gehen, wenn sie über die gesamte Population in Geweben gemittelt werden. Mit dieser Technik können potenzielle Heterogenitäten nachgewiesen werden, die bei der Identifizierung neuer bakterieller Pfade und Proteine berücksichtigt werden müssen, die durch Antivirulenz oder antibakterielle Verbindungen ins Visier genommen werden sollen. Beginnen Sie damit, S.aureus-Stämme von Interesse auf Blut-Agar-Platten aus einem gefrorenen Glyzerin-Bestand zu streifen und die Platten bei 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden zu bebrüten, um ihre hämolytischen Phänotypen auf der Grundlage ihrer Fähigkeit, rote Blutkörperchen zu lysieren und klare transparente Zonen zu bilden, zu bestätigen.In sterilen Glasröhren werden einzelne Kolonieisolate von jedem Stamm in vier Millilitern tryptischer Sojabrühe oder TSB geimpft und die Rohre 16 bis 24 Stunden in einer Rohrwalze in einem Winkel von etwa 70 Grad und 70 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius gedreht. Am nächsten Morgen messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 der Kulturen auf einem Spektralphotometer und verdünnen Die Zellen auf eine OD 600 von 0,05 in 25 Milliliter steriler TSB bei einem Verhältnis von fünf zu einem Kolben zu Volumen in 125 Milliliter Delong-Flaschen. Inkubieren Sie die Kulturen in einem 37 Grad Celsius Wasserbad mit 280 Umdrehungen pro Minute und ernten Sie die Zellen während der exponentiellen Phase.Pellet die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie die Zellen zweimal in einem gleichen Volumen von sterilen PBS. Dann setzen Sie die Zellen in frischem PBS auf ein mal 10 bis die achte Kolonie bildende Einheiten pro Milliliter Konzentration für ihre anschließende Injektion in ein Empfängertier aus. Am entsprechenden experimentellen Endpunkt die Niere, das Herz, die Leber, die Lunge und die Milz in 15 Milliliter Polypropylen-Röhren mit 10% gepuffertem Formalin für eine 24- bis 48-stündige Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln oder Drehen ernten.Am Ende der Fixierung, einbetten Sie die Organe in klares Gewebe Gefriermedium für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Verwenden Sie einen Kryostat, um 10 Mikrometer dicke Gewebeabschnitte zu erfassen und die Abschnitte auf einzelnen vorgereinigten geladenen Glasschlitten für 20 Minuten im Dunkeln zu trocknen, bevor Sie hartes Montagemedium auftragen, das mit DAPI ergänzt wird. Dann Deckelscheine auftragen und die Dias bei Raumtemperatur über Nacht aushärten, bevor die Proben bei vier Grad Celsius in die Langzeitlagerung überführen.Um Läsionen innerhalb der Proben zu identifizieren, legen Sie ein Dia auf die Bühne eines Laserscanning-Konfokalmikroskops und verwenden Sie ein geeignetes Ziel, um einzelne Zellen zu visualisieren, um Bilder der Läsionen zu erfassen. Um die Fluoreszenzintensitäten innerhalb der konfokalen Bilder zu messen, öffnen Sie ein Bild in ImageJ und passen Sie die Helligkeit und den Kontrast an, um das Fluoreszenzsignal der Läsion richtig zu visualisieren. Definieren Sie den Interessenbereich, indem Sie das Polygonauswahlwerkzeug verwenden, und fügen Sie den ROI dem ROI-Manager unter der Registerkarte Bearbeiten in ImageJ hinzu.Wählen Sie Bearbeiten, dann Auswahl und schließlich Hinzufügen zum Manager aus. Benennen Sie als Nächstes den ROI um, und beschriften Sie das entsprechende Bild. Um den Schwerpunkt zu definieren, öffnen Sie die Registerkarte Analysieren, und wählen Sie Bereich, mittlerer Grauwert, Schwerpunkt und Schwellenwert begrenzen aus.Extrahieren Sie den Zentroidfluoreszenzintensitätswert oder messen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität in einer bestimmten Läsion pro Flächeneinheit. Dies kann erreicht werden, indem die Schwellenfunktion verwendet wird, um die unteren und oberen Fluoreszenzgrenzwerte bei Bedarf festzulegen. Exportieren Sie die Daten in eine Excel-Datei, und bereiten Sie eine Spalte vor, die die mittlere Fluoreszenzintensität pro Flächeneinheit für die Peripherie und den Kern angibt.Um die mittleren Fluoreszenzintensitäten pro Flächeneinheit in der Peripherie und im Kern zu berechnen, definieren Sie manuell die oberen und unteren Grenzwerte der Schwellenwerte. Staphylococcus aureus Thermonuklease GFP-Fusionsfluoreszenz ist im Durchschnitt fast neunmal höher in Zellen, die das Fusionsgen tragen, als in Zellen, die die Reporterfusion nicht tragen. In ähnlicher Weise ist die Tandem-Dimer-Tomatenfusionsfluoreszenz etwa sechsmal höher als die Null-Reporter-Kontrolle.Das Muster der Reporteraktivitäten kann durch Durchflusszytometrie mit Gewebehomogenaten bestätigt werden. Obwohl die Faltenunterschiede in der Fluoreszenz in der Regel geringer sind. Variationen der Fluoreszenzmessungen können auf eine heterogene Expression der Reporter zurückzuführen sein.So wurde beispielsweise in diesen repräsentativen Proben beobachtet, dass einige Läsionen entweder einen oder beide der Reporter innerhalb von etwa 100 Mikrometern Entfernung in derselben Gewebeprobe ausdrückten. Die Untersuchung der Reporteraktivität zu einer Einzelzellauflösung in Staphylokokken-Abcess-Gemeinschaften zeigt eine räumliche Regulierung der Staphylococcus aureus Thermonuklease-Expression in Abszessen, die mit starker DAPI-Färbung begrenzt sind, wahrscheinlich im Zusammenhang mit der Bildung und Freisetzung von neutrophilen extrazellulären Fallen. Zum Beispiel wird im inneren Kern der Staphylokokken-Abcess-Gemeinschaft im Inneren im Inneren der Staphylokokken-Abcess-Gemeinschaft eine signifikant höhere Staphylococcus aureus-Thermonuklease-GFP-Fusionsfluoreszenz beobachtet als lokalisiert in die Peripherie.In der gleichen Abcess scheint das Muster für die Tandem-Dimer-Tomatenfusionsfluoreszenz invertiert zu sein. Das Muster in diesem Experiment war jedoch statistisch nicht signifikant. Die Beschaffung intakter kryo-eingebetteter Sezieren ist für die Fluoreszenzbildanalyse von entscheidender Bedeutung und sollte sorgfältig durchgeführt werden.Die Sortierung der Bakterienzellen zur Erfassung von Subpopulationen, die die Fusion in unterschiedlichem Ausmaß exemiten, in Verbindung mit der RNA-Seq-Analyse könnte genomweite Veränderungen im Transkriptom beleuchten. Achten Sie bei der Arbeit mit Formalin darauf, da es krebserregend ist und bei direkter Exposition Hautreizungen, allergische Reaktionen oder Augenschäden verursachen kann. Die Erzeugung mutierter Derivate von Stämmen, die fluoreszierende Reporter von Interesse tragen, kann helfen, die genetische Grundlage für die beobachteten räumlichen Regulierungsmuster aufzudecken.

Research

JoVE Journal

Genetics

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Forschung

Genetik

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation In Vivo zellulären Reaktionen auf einfache und komplexe DNA-Schäden zu studieren

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

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Eine Methode, um den C924T-Polymorphismus von Thromboxan-A2-Rezeptor-Gens zu studieren

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

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Lentiviral vermittelte Gen-Silencing in humanem Pseudoislet in niedrigen Befestigungsplatten zubereitet

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...