Name: a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

אנו מודים אלכסנדר Horswill על המתנה של PsarAP1- tdTomato פיוז'ן, וכן קרן קרסוול לעזרה עם ניתוח cytometry זרימה. אנו מודים גם המלך אליסה לקבלת ייעוץ על ניתוח סטטיסטי. עבודה זו הייתה מומן בחלקו על ידי פרס מחקר Exploratory/התפתחותית NIH (גרנט AI123708) וקרנות הפעלה סגל כדי SRB. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, פרשנות או ההחלטה להגיש את העבודה עבור פרסום.

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת ג'ורג'טאון.
1. דור של המתח כתב פלורסנט
<ol><li>לעכל את הווקטור pRB4 אינטגרטיבית הגנום ברצף עם אנזימי הגבלה EcoRI, מרק פורטנוי. הפרוטוקול של היצרן, להגדיר לילה עיכול עם מרק פורטנוי בעזרת µg 1...

מחלות זיהומיות חיידקים הם בעיה בריאות גדל והולך ברחבי העולם עקב הרכישה של עמידות לאנטיביוטיקה גורמים46. בגלל הסתגלות לסביבות מארח חיונית לצמיחה ההישרדות במהלך זיהום, אסטרטגיות מיקוד תוכניות ביטוי גנים המגבירים את הפתוגן כושר יוכיח שימושי רפואית. אחת מהתכניות היא ערכה של גני?...

חיידקים להגיב לשינויים בתנאים פיזיולוגיים והשינויים במצב התזונתי של סביבתם בהבעת באופן שונה גנים הדרושים עבור הסתגלות והישרדות. למשל, פתוגנים אופורטוניסטים ליישב גוף משטחים-יחסית נמוך צפיפות, הם לעתים קרובות לא מזיק. עם זאת, ברגע החיידק חודר חסמים הכימי והפיסי, זה חייב להתמודד עם המארח תא החיסון הגנות נגד וזמינות מזון מוגבלת1. לדוגמה, Staphylococcus aureus והצנרות בערך שליש מאוכלוסיית asymptomatically אבל הוא גם הגורם של העור הרסנית, רקמות רכות זיהומים, דלקת עצם מוגלתית, דלקת פנים הלב, בקטרמיה2. ההצלחה של S. aureus כמו. חיידק מיוחס לעתים קרובות את הגמישות מטבולית שלה, כמו גם ארסנל של גורמים הקשורים השטח, המופרש התקפה אלימה המאפשרים החיידק להימלט למחזור הדם. וישכפלו ברקמות היקפיים 3,4,5. כי המארח למוות בשל מחלת staphylococcal היא אבולוציונית מבוי סתום ו לתחום השידור מארחים החדש6, המחויבות התקפה אלימה גורם הייצור חייב להיות נשלט היטב.
רשת רגולטוריות מורכבות של חלבונים ללא קידוד RNAs מגיב מגוון רחב של גירויים סביבתיים, לרבות תא צפיפות, שלב הצמיחה, גורמים הקשורים נויטרופילים וזמינות חומר מזין, כדי להבטיח כי התקפה אלימה גנים מבוטאים זמן מדויק ובמיקום מארח רקמות7,8,9,10,11,12,13. למשל, מערכת דו קומפוננט SaeR/S (TCS) מסדיר ביטוי של מספר גורמים התקפה אלימה באמצעות את חיישן קינאז (SaeS), הרגולטור (SaeR) בתגובה14. SaeS הוא autophosphorylated על משקע היסטידין שנשמרת בתגובה מארח אותות (למשל, האנושי נויטרופילים פפטידים [HNPs], calprotectin)8,15,16. קבוצת phosphoryl הוא הועבר לאחר מכן שאריות אספרטט על SaeR, הפיכתו כמו חלבון ה-DNA מחייב (SaeR ~ P)17. TCS SaeR/S מסדיר מעל 20 גנים לתרום בפתוגנזה כולל fibronectin מחייב חלבונים (FnBPs), leukocidins ו coagulase14,18,19,20. ניתן לסווג מטרות יעדים ג'ין גבוה-זיקה ואהדה נמוכה, אשר צפויים המושרה ככל שרמת SaeR ~ P עולה כאשר הם נחשפים רמזים שלה21. הפעילות SaeR/S נשלטת על ידי הרגולטורים אחרים של ביטוי גנים כגון מערכת חישה quorum Agr, מדכא. שבולם רעלים חלבון (רוט), את פקטור סיגמה חלופה ב' (SigB)22,23,24.
nuc ג'ין התקפה אלימה Sae תלוית ב Staphylococcus aureus ו מקודד thermonuclease (Nuc), אשר חיוני עבור בריחה מן neutrophilic extracellular tראפ (רשתות), הפצת במהלך קורס של זיהום25,26. הביטוי של nuc גם בחום עקיף מודחקים מאת CodY בנוכחות חומצות אמינו מסועפות שרשרת ו GTP27, מודחקים ישירות על ידי החלבון staphylococcal הרגולטור אביזר שרה28,29 , שפעילותם היא מושפעת חמצן (מצב חמצון-חיזור) ו- pH30. בהתחשב בכך sae ו- nuc המוטציות הן הקלוש במודלים של העכבר של זיהום, יש עניין בפיתוח התערבויות כימי המעכבות שלהם26,המקביל פעילויות31. למרות זאת, אין מידע שלהם מנשר במהלך זיהום.
כתבים פלורסנט שימשו כדי לפקח ולכמת ביטוי גנים ברמה תא בודד. במסמך זה, אנו מציגים שיטה לכימות S. aureus ביטוי גנים במהלך זיהום זה, כאשר יחד עם transcriptome הפרייה analysis, טכניקות הדמיה חזקה כמו הדמיית תהודה מגנטית (MRI) וספקטרוסקופיה תהודה מגנטית (MRS), יכול לחשוף כמה חיידקים פיזיולוגיה מוסדר vivo, את abundances היחסית של חומרים מזינים בתוך נישות מסוימות. השיטה ניתן ליישם כל פתוגן חיידקי עם מערכת גנטית צייתן.
סקירה של הווקטור אינטגרטיבית הגנום.
PRB4 וקטור אינטגרטיבית הגנום מכיל 500 בסיסים כל אחד מהאזורים ויוצאת של פסאודוגן S. aureus USA300 SAUSA300_0087 כדי להקל על רקומבינציה הומולוגית. pRB4 נגזרת עמוד השדרה וקטור הרגיש pMAD המכילות את קלטת ההתנגדות אריתרומיצין (ermC) ואת הגן ביתא thermostable-galactosidase bgaB להקרנה כחול/לבן של ציטוקינים-חלבונים רקומביננטיים32. הבונה כתב מהונדס מכיל גם סמן ההתנגדות כלורמפניקול (חתול) לבחירה לאחר הגנום אינטגרציה פלסמיד חיסול, כמו גם אתרי EcoRI ולא מרק פורטנוי שתתיך האזור רגולטוריות לעניין superfolder ירוק חלבון פלואורסצנטי (sGFP) (איור 1). ידוע כי הבחירה של אתר קישור הריבוזום (RBS) משפיע על הפעילות של הכתב, לעיתים קרובות דורש אופטימיזציה אמפירי33. לפיכך, ה-RBS לא מסופק. כאן, באתר איגוד של ריבוזום יליד משמש כדי לספק עבור תבנית יותר טבעי של ביטוי גנים, אך באתרים אחרים עשוי לשמש.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">5% sheep blood</td>
			<td style="width:343px;">Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td>
			<td style="width:139px;">A10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:343px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">C57Bl/6 Mice</td>
			<td style="width:343px;">Charles River</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">C-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture, Cap</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D+2:25NA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miniprep, plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaking water bath</td>
			<td>New Brunswick Innova</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR purification</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:343px;">Cellgrow</td>
			<td style="width:139px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:343px;">Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-Kan</td>
			<td>GenScript (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Q5 Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:367px;">Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6300L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sanger Sequencing</td>
			<td>Genewiz (Germantown, MD)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sub Xero clear tissue freezing medium</td>
			<td>Mercedes Medical</td>
			<td style="width:139px;">MER5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superloop</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe, Filter</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto 40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S11351</td>
			<td>Membrane permeant nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:343px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">90000-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter-DU350</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues

התקפה אלימה חיידקי גנים מוסדרים לעתים קרובות באותה רמת תעתיק על ידי גורמים רבים מגיבים לאותות סביבתיים שונים. כמה גורמים פועלים ישירות על גנים התקפה אלימה; שאחרים שולטים פתוגנזה על-ידי התאמת הביטוי של הרגולטורים במורד הזרם או ההצטברות של הסימנים שמשפיעים מווסת פעילות. אמנם תקנה נחקרה בהרחבה במהלך צמיחה במבחנה , יחסית מעט מאוד ידוע על מה גנים מותאמת במהלך זיהום. מידע זה חשוב כאשר מוצר גן מסוים הוא מועמד התערבות טיפולית. תעתיק גישות כמו RT-PCR כמותי, בזמן אמת, RNA-Seq דרכים רב עוצמה כדי לבדוק ביטוי של גנים ברמה עולמית אבל סובלים אתגרים טכניים רבים כולל שפע נמוכה של RNA חיידקי לעומת מארח ה-RNA, לדוגמה השפלה על-ידי RNases. הערכת תקנה באמצעות עיתונאים פלורסנט הוא קל יחסית, יכול להיות מרובב עם חלבונים פלורסנט עם תכונות ספקטרליות ייחודי. השיטה מאפשרת ניתוח מתא בודד, ייתכן גנים ברקמות כי התערוכה מורכבת תלת מימדי physiochemical ואדריכלות מעברי צבע המשפיעות על רשתות בקרה רגולטריות חיידקי. מידע אובד כאשר הנתונים הם בממוצע באוכלוסייה בצובר. במסמך זה, אנו מתארים שיטה לכימות ביטוי גנים ב פתוגנים חיידקיים בתוך באתרו. השיטה מבוססת על עיבוד רקמות פשוטה וצפייה ישירה פלורסצנטיות מן הכתב חלבונים. נדגים את התועלת של מערכת זו על ידי בחינת הביטוי של Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), אשר המוצר ג'ין הוא הדרושים לשם התחמקות המערכת החיסונית שיתואר ex-vivo ו ויוו. אנחנו מראים את nuc-gfp מתבטא בחריפות מורסות כליות לחשוף ביטוי גנים הטרוגניות עקב בחלקו לכאורה תקנה מרחבי הפעילות יזם nuc אבצס מעורבת לגמרי עם התגובה החיסונית. השיטה ניתן ליישם כל חיידק עם מערכת גנטית manipulatable, כל דגם זיהום, מתן מידע יקר ערך עבור מחקרים פרה פיתוח תרופות.

פיתחנו על פלסמיד נגזר pMAD32 שיכולים לספק שום כתב פיוז'ן לבנות לתוך הכרומוזום מאת רקומבינציה הומולוגית מוצלב כפול (איור 1). מבנה זה מאפשר ניתוח כמותי בכל אזור רגולטורית שתומכת הייצור של חלבון ה-GFP ושידור פלורסנט מעל הרקע. פלסמיד מקנה עמידות אמפיצ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

המתוארים כאן היא שיטה לניתוח ביטוי גנים חיידקיים ברקמות בעלי חיים ברמה התאית. שיטה זו מספקת משאב ללמוד את הגיוון פנוטיפי המתרחשים בתוך אוכלוסיה חיידקי בתגובה הסביבה רקמות במהלך זיהום.

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

שיטה זו יכולה לחשוף דפוסים מרחביים של ביטוי גנים חיידקיים ואסטרטגיות להסתגלות פיזיולוגית לארח מיקרו-סביבות רקמות שאבדו כאשר ממוצע על פני האוכלוסייה כולה ברקמות. עם טכניקה זו ניתן לזהות הטרוגניות פוטנציאליות שיש לשקול בעת זיהוי מסלולים וחלבונים חיידקיים חדשים להיות ממוקדים על ידי אנטי ויראליות או תרכובות אנטיבקטריאליות. התחל על ידי פסים S.aureus זנים של עניין על צלחות אגר דם ממלאי גליצרול קפוא דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 24 שעות כדי לאשר פנוטיפים המופוליטיים שלהם מבוסס על היכולת שלהם lyse תאי דם אדומים ו ליצור אזורים שקופים ברורים.לחסן מושבה אחת מבודדת של כל זן בארבעה מיליליטר של מרק סויה טריפטי, או TSB, בצינורות זכוכית סטריליים ולסובב את הצינורות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 עד 24 שעות בגלגל צינור בזווית של כ 70 מעלות ו 70 סיבובים לדקה. למחרת בבוקר למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר, או OD 600, של התרבויות על ספקטרופוטומטר ולדלל את התאים OD 600 של 0.05 ב 25 מיליליטר של TSB סטרילי בבקבוקון אחד יחס נפח ב 125 מיליליטר דלונג פתיתים. הדגירה את התרבויות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס ב 280 סיבובים לדקה לקצור את התאים במהלך השלב המעריכי.גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף את התאים פעמיים בנפח שווה של PBS סטרילי. ואז להשתמש שוב את התאים PBS טריים לתוך פעם אחת 10 למושבה השמינית להרכיב יחידות לריכוז מיליליטר עבור הזריקה הבאה שלהם לתוך בעל חיים נמען. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, לקצור את הכליה, הלב, הכבד, הריאות והטחול לתוך 15 צינורות פוליפרופילן מיליליטר המכילים פורמלין 10% חציצה עבור דגירה 24 עד 48 שעות בחושך בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין או סיבוב.בסוף קיבעון, להטמיע את האיברים ברקמות ברורות הקפאת בינוני לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. השתמש cryostat לרכוש 10 מקטעי רקמה עבה מיקרומטר ולייבש את החלקים על שקופיות זכוכית טעון מראש בודדים במשך 20 דקות בחושך לפני החלת מדיום הרכבה קשה בתוספת DAPI. לאחר מכן להחיל תלושי כיסוי לרפא את השקופיות בטמפרטורת החדר לילה לפני העברת הדגימות לאחסון לטווח ארוך בארבע מעלות צלזיוס.כדי לזהות נגעים בתוך הדגימות, מקם שקופית על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר ולהשתמש במטרה מתאימה להדמיית תאים בודדים כדי לרכוש תמונות של נגעים. כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך התמונות הקונפוקליות, פתח תמונה ב- ImageJ והתאם את הבהירות והניגודיות כדי לדמיין כראוי את אות הפלואורסצנטיות של הנגע. הגדר את אזור העניין באמצעות הכלי בחירות מצולע והוסף את ה- ROI למנהל ההשקעות תחת הכרטיסיה עריכה ב- ImageJ.בחר ערוך ולאחר מכן בחר באפשרות בחירה ולבסוף הוסף למנהל. לאחר מכן, שנה את שם ה-ROI ותייג את התמונה המתאימה. כדי להגדיר את ה- centroid, פתח את הכרטיסיה נתח ובחר אזור, ערך אפור ממוצע, Centroid ו הגבל לסף.יש לחלץ את ערך עוצמת הפלואורסצנטיות של המרכז או למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת בנגע נתון ליחידת שטח. ניתן להשיג זאת באמצעות פונקציית הסף כדי להגדיר את גבולות הפלואורסצנטיות התחתונה והעליונה לפי הצורך. יצא את הנתונים לקובץ Excel והכן עמודה המציינת את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לכל אזור יחידה עבור הפריפריה והליבה.כדי לחשב את התעצמות הפלואורסצנטיות הממוצעת לכל אזור יחידה בפריפריה וליבה, הגדר ידנית את הגבולות העליונים והתחתונים של סף. סטפילוקוקוס aureus thermonuclease פלואורסצנטיות היתוך GFP הוא בממוצע כמעט פי תשעה גבוה יותר בתאים הנושאים את גן ההיתוך מאשר בתאים שאינם נושאים את היתוך הכתב. באופן דומה, פלואורסצנטיות היתוך עגבניות טנדם דימרי גבוה בערך פי שישה משליטת הכתב האפס.הדפוס של פעילויות הכתב יכול להיות מאושר על ידי ציטומטריה זרימה עם הומוגניטים רקמה. למרות ההבדלים לקפל פלואורסצנטיות הם בדרך כלל נמוכים יותר. וריאציות במדידות הפלואורסצנטיות יכולות להיות נובעות מביטוי הטרוגני של הכתבים.לדוגמה, בדגימות מייצגות אלה נצפתה כי כמה נגעים הביעו אחד או שני הכתבים בתוך כ 100 מיקרומטרים של מרחק באותה דגימת רקמה. בחינת פעילות הכתב לרזולוציית תא יחיד בקהילות abcess staphylococcal מגלה ויסות מרחבי של סטפילוקוקוס aureus thermonuclease ביטוי במורסות מוגבל עם כתמי DAPI חזקים, ככל הנראה הקשורים היווצרות ושחרור של מלכודות נויטרופילים חוץ תאיים. לדוגמה, סטפילוקוקוס aureus thermonuclease GFP פלואורסצנטיות היתוך נצפתה בליבה הפנימית של הקהילה abcess staphylococcal בהשוואה מקומית לפריפריה.באותה abcess, הדפוס של פלואורסצנטיות היתוך עגבניות עמומות טנדם נראה הפוך. עם זאת, הדפוס בניסוי זה לא היה מובהק סטטיסטית. השגת ניתוחים מוטבעים קריו שלמים חיונית לניתוח התמונה הפלואורסצנטית ויש לעשות זאת בזהירות.מיון תאי החיידקים ללכידת תת-אוכלוסיות המבטאת את ההיתוך בהיקפים משתנים, יחד עם ניתוח RNA-Seq, יכול להאיר שינויים רחבים בגנום בתעתיק. יש לדאוג בעת עבודה עם פורמלין כפי שהוא מסרטן עלול לגרום לגירוי בעור, תגובות אלרגיות, או נזק לעיניים על חשיפה ישירה. יצירת נגזרות מוטנטיות של זנים הנושאים כתבים פלואורסצנטיים מעניינים יכולה לעזור לחשוף את הבסיס הגנטי לדפוסי הרגולציה המרחבית שנצפו.

Research

JoVE Journal

Genetics

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

לנטינגינה ג'ין מתווכת השתקה האדם פסאודו איון מוכן לוחות מצורף נמוך

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...