Name: a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

हम पीsarAP1-tdTomato फ्यूजन के उपहार के लिए अलेक्जेंडर Horswill धंयवाद, और करेन Creswell प्रवाह cytometry विश्लेषण के साथ मदद के लिए । हम भी सांख्यिकीय विश्लेषण पर सलाह के लिए एलिसा राजा धंयवाद । इस काम के हिस्से में एक NIH खोजपूर्ण/विकासात्मक अनुसंधान पुरस्कार (अनुदान AI123708) और SRB के लिए संकाय स्टार्टअप कोष द्वारा वित्त पोषित किया गया । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और व्याख्या, या प्रकाशन के लिए काम प्रस्तुत करने का निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी ।

यहां वर्णित सभी विधियों को जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल एवं उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर तनाव की पीढ़ी
<ol><li>जीनोम एकीकृत pRB4 वेक्टर EcoRI...

बैक्टीरियल संक्रामक रोगों एक बढ़ती स्वास्थ्य समस्या एंटीबायोटिक प्रतिरोध निर्धारकों४६के अधिग्रहण के कारण दुनिया भर रहे हैं । क्योंकि वातावरण की मेजबानी के लिए अनुकूलन विकास और संक्रमण के...

जीवाणुओं को बदलने के लिए शारीरिक स्थितियों और उनके पर्यावरण के पोषण राज्य में परिवर्तन करने के लिए अंतर से अनुकूलन और अस्तित्व के लिए आवश्यक जीन व्यक्त करने का जवाब । उदाहरण के लिए, अवसरवादी रोगजनकों उपनिवेश शरीर अपेक्षाकृत कम घनत्व पर सतहों, और अक्सर हानिरहित हैं । हालांकि, एक बार जीवाणु शारीरिक और रासायनिक बाधाओं प्रवेश किया है, यह मेजबान प्रतिरक्षा सेल काउंटर के साथ संघर्ष-गढ़ और सीमित पोषक तत्वों की उपलब्धता1होगा । एक उदाहरण के रूप में, Staphylococcus aureus उपनिवेश करता आबादी के लगभग एक तिहाई स्पर्शोन्मुख है, लेकिन यह भी विनाशकारी त्वचा और कोमल ऊतक संक्रमण, अस्थिमज्जा, अन्तर्हृद्शोथ, और bacteremia2के कारण है । एक रोगज़नक़ के रूप में aureus की सफलता अक्सर इसके चयापचय लचीलापन के साथ ही सतह से जुड़े और स्रावित डाह कारकों है कि जीवाणु खून से बचने के लिए और परिधीय ऊतकों में नकल करने के लिए सक्षम के एक शस्त्रागार के लिए जिंमेदार ठहराया है 3,4,5. क्योंकि मेजबान मौत स्ताफ्य्लोकोच्कल रोग के कारण एक विकासवादी मर अंत और नई मेजबान6के लिए संचरण की सीमा है, डाह कारक उत्पादन के लिए प्रतिबद्धता सावधानी से नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
प्रोटीन और गैर कोडिंग RNAs के एक जटिल नियामक नेटवर्क सेल घनत्व, विकास चरण, न्युट्रोफिल जुड़े कारकों, और पोषक तत्वों की उपलब्धता, यह सुनिश्चित करने के लिए कि डाह जीन पर व्यक्त कर रहे है सहित पर्यावरणीय उत्तेजनाओं की एक किस्म का जवाब सटीक समय और मेजबान ऊतकों के भीतर स्थान7,8,9,10,11,12,13. उदाहरण के लिए, SaeR/S दो घटक सिस्टम (TCS) सेंसर कळेनासे (SaeS) और प्रतिक्रिया नियामक (SaeR)14के माध्यम से कई डाह कारकों की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है । SaeS (जैसे, मानव न्युट्रोफिल पेप्टाइड्स [HNPs], calprotectin)8,15,16होस्ट संकेतों के जवाब में एक संरक्षित histidine अवशेषों पर autophosphorylated है । phosphoryl समूह तो SaeR पर एक aspartate अवशेषों को हस्तांतरित किया है, यह एक डीएनए के रूप में सक्रिय-बाध्यकारी प्रोटीन (SaeR ~ P)17। SaeR/एस टीसीएस 20 जीन है कि fibronectin बंधन प्रोटीन (FnBPs), leukocidins, और coagulase14,18,19,20सहित रोगजनन के लिए योगदान पर नियंत्रित करता है । लक्ष्य उच्च संबंध और कम समानता जीन लक्ष्य है, जो SaeR के स्तर के रूप में प्रेरित कर रहे है में वर्गीकृत किया जा सकता है ~ पी उगता है जब अपने संकेतों को उजागर21। SaeR/एस गतिविधि Agr कोरम संवेदन प्रणाली के रूप में जीन अभिव्यक्ति के अंय नियामकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है, विषाक्त पदार्थों के प्रोटीन के दमन (सड़ांध), और वैकल्पिक सिग्मा कारक बी (SigB)22,23,24।
nuc Staphylococcus aureus में एक Sae-निर्भर डाह जीन है और encodes thermonuclease (nuc), जो एनeutrophilic ईxtracellular टीraps (जाल) से बचने के लिए और के दौरान प्रसार के लिए आवश्यक है संक्रमण का कोर्स25,26. nuc की अभिव्यक्ति भी मजबूती से शाखाई-चेन अमीनो एसिड और GTP27की उपस्थिति में कोड़ी द्वारा अप्रत्यक्ष रूप से दमित है, और सीधे स्ताफ्य्लोकोच्कल गौण नियामक प्रोटीन सारा28,29 द्वारा दमित , जिनकी सक्रियता ऑक्सीजन (redox state) और pH30से प्रभावित होती है । यह देखते हुए कि sae और nuc म्यूटेंट संक्रमण के माउस मॉडलों में तनु हैं, वहां रासायनिक हस्तक्षेप है कि उनकी इसी गतिविधियों को रोकना26,31के विकास में रुचि है । बावजूद इसके संक्रमण के दौरान उनके नियमन के संबंध में कोई जानकारी नहीं है ।
फ्लोरोसेंट पत्रकारों की निगरानी और एकल कोशिका स्तर पर जीन अभिव्यक्ति यों तो इस्तेमाल किया गया है । साथ ही, हम एसबढ़ाता के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । संक्रमण के दौरान aureus जीन अभिव्यक्ति है कि, जब इन विट्रो transcriptome विश्लेषण और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) और चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (श्रीमती) की तरह शक्तिशाली इमेजिंग तकनीक के साथ युग्मित, प्रकट कर सकते हैं कैसे बैक्टीरियल फिजियोलॉजी vivo में विनियमित है और कुछ niches में पोषक तत्वों के सापेक्ष बहुतायत । विधि एक तंत्रीय आनुवंशिक प्रणाली के साथ किसी भी जीवाणु रोगज़नक़ के लिए लागू किया जा सकता है ।
जीनोम एकीकरण वेक्टर का अवलोकन ।
जीनोम एकीकृत वेक्टर pRB4 है ५०० आधार जोड़े प्रत्येक के ऊपर और नीचे के क्षेत्रों से एस aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene के लिए मुताबिक़ पुनर्संयोजन की सुविधा । pRB4 तापमान के प्रति संवेदनशील pMAD वेक्टर इरिथ्रोमाइसिन प्रतिरोध कैसेट (ermC) और thermostable बीटा galactosidase जीन bgaB नीले/recombinants३२की सफेद स्क्रीनिंग के लिए युक्त रीढ़ से ली गई है । इंजीनियर रिपोर्टर का निर्माण भी जीनोम एकीकरण और प्लाज्मिड उंमूलन के बाद चयन के लिए एक क्लॉरॅंफेनिकोल प्रतिरोध मार्कर (cat), साथ ही साथ EcoRI और SmaI साइटों को superfolder ग्रीन को ब्याज की नियामक क्षेत्र फ्यूज होता है फ्लोरोसेंट प्रोटीन (sGFP) (चित्रा 1) । यह ज्ञात है कि ribosome बंधन साइट (आरबीएस) के चुनाव रिपोर्टर की गतिविधि को प्रभावित करती है, और अक्सर अनुभवजंय अनुकूलन३३की आवश्यकता है । इस प्रकार, एक आरबीएस की आपूर्ति नहीं की है । यहां, देशी ribosome बंधन साइट जीन अभिव्यक्ति की एक और अधिक प्राकृतिक पैटर्न के लिए प्रदान किया जाता है, लेकिन अंय साइटों का इस्तेमाल किया जा सकता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">5% sheep blood</td>
			<td style="width:343px;">Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td>
			<td style="width:139px;">A10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:343px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">C57Bl/6 Mice</td>
			<td style="width:343px;">Charles River</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">C-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture, Cap</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D+2:25NA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miniprep, plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaking water bath</td>
			<td>New Brunswick Innova</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR purification</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:343px;">Cellgrow</td>
			<td style="width:139px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:343px;">Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-Kan</td>
			<td>GenScript (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Q5 Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:367px;">Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6300L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sanger Sequencing</td>
			<td>Genewiz (Germantown, MD)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sub Xero clear tissue freezing medium</td>
			<td>Mercedes Medical</td>
			<td style="width:139px;">MER5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superloop</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe, Filter</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto 40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S11351</td>
			<td>Membrane permeant nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:343px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">90000-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter-DU350</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues

बैक्टीरियल डाह जीन अक्सर कई कारकों है कि विभिंन पर्यावरणीय संकेतों का जवाब द्वारा transcriptional स्तर पर विनियमित रहे हैं । कुछ कारकों डाह जीन पर सीधे कार्य; दूसरों के बहाव नियामकों या संकेतों के संचय कि नियामक गतिविधि को प्रभावित की अभिव्यक्ति का समायोजन करके रोगजनन नियंत्रण । जबकि विनियमन बड़े पैमाने पर इन विट्रो विकास के दौरान अध्ययन किया गया है, अपेक्षाकृत कम कैसे जीन अभिव्यक्ति संक्रमण के दौरान समायोजित है के बारे में जाना जाता है । इस तरह की जानकारी महत्वपूर्ण है जब एक विशेष जीन उत्पाद चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए एक उंमीदवार है । मात्रात्मक, वास्तविक समय आरटी-पीसीआर और आरएनए-Seq तरह Transcriptional दृष्टिकोण एक वैश्विक स्तर पर जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए शक्तिशाली तरीके हैं, लेकिन मेजबान आरएनए की तुलना में बैक्टीरियल आरएनए की कम बहुतायत सहित कई तकनीकी चुनौतियों से पीड़ित हैं, और नमूना RNases द्वारा ह्रास । विनियमन का मूल्यांकन फ्लोरोसेंट पत्रकारों का उपयोग अपेक्षाकृत आसान है और अद्वितीय वर्णक्रमीय गुणों के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है । विधि एकल कोशिका के लिए अनुमति देता है, ऊतकों में जीन अभिव्यक्ति की spatiotemporal विश्लेषण है कि जटिल तीन आयामी वास्तुकला और physiochemical ढाल है कि बैक्टीरियल विनियामक नेटवर्क को प्रभावित प्रदर्शन । ऐसी जानकारी खो जाती है जब डेटा का औसत थोक जनसंख्या से अधिक हो । साथ ही, हम सीटू मेंजीवाणु रोगजनकों में जीन अभिव्यक्ति को बढ़ाता है के लिए एक विधि का वर्णन । विधि सरल ऊतक प्रसंस्करण और रिपोर्टर प्रोटीन से प्रतिदीप्ति के प्रत्यक्ष अवलोकन पर आधारित है । हम Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), जिसकी जीन उत्पाद प्रतिरक्षा चोरी और पूर्ण डाह पूर्व vivo और vivo में के लिए आवश्यक है की अभिव्यक्ति की जांच करके इस प्रणाली की उपयोगिता का प्रदर्शन । हम बताते हैं कि nuc-gfp दृढ़ता से गुर्दे फोड़े में व्यक्त की है और विषम जीन अभिव्यक्ति स्पष्ट रूप से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ लगे फोड़े में nuc प्रमोटर गतिविधि के स्थानिक विनियमन के लिए भाग में कारण प्रकट होता है । विधि एक हेर-फेर आनुवंशिक प्रणाली और किसी भी संक्रमण मॉडल के साथ किसी भी जीवाणु के लिए लागू किया जा सकता है, नैदानिक अध्ययन और दवा के विकास के लिए बहुमूल्य जानकारी प्रदान करते हैं ।

हम एक pMAD३२ है कि किसी भी रिपोर्टर संलयन डबल क्रॉसओवर मुताबिक़ पुनर्संयोजन (चित्रा 1) द्वारा गुणसूत्र में निर्माण उद्धार कर सकते से व्युत्पंन प्लाज्मिड विकसित की है । इस ...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

संक्रमित ऊतकों में बैक्टीरियल जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति आधारित विधि

यहां वर्णित एक सेलुलर स्तर पर पशु ऊतकों में बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए एक विधि है । इस विधि एक संक्रमण के दौरान ऊतक पर्यावरण के जवाब में एक जीवाणु आबादी के भीतर होने वाली phenotypic विविधता का अध्ययन करने के लिए एक संसाधन प्रदान करता है ।

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

यह विधि ऊतक सूक्ष्म वातावरण की मेजबानी के लिए बैक्टीरियल जीन अभिव्यक्ति और शारीरिक अनुकूलन के लिए रणनीतियों के स्थानिक पैटर्न को प्रकट कर सकती है जो ऊतकों में पूरी आबादी में औसत होने पर खो जाते हैं। इस तकनीक के साथ संभावित विषमताओं का पता लगाया जा सकता है कि नए जीवाणु मार्गों और प्रोटीन की पहचान करते समय एंटीवायरलेंस या जीवाणुरोधी यौगिकों द्वारा लक्षित होने पर विचार किया जाना चाहिए। एक जमे हुए ग्लिसरोल स्टॉक से रक्त आगर प्लेटों पर ब्याज की एस ऑरियस उपभेदों लकीर से शुरू करें और 16 से 24 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेटिंग करें ताकि लाल रक्त कोशिकाओं को lyse करने और स्पष्ट पारदर्शी क्षेत्र बनाने की उनकी क्षमता के आधार पर उनके हीमोलिटिक फेनोटाइप की पुष्टि की जा सके ।बाँझ ग्लास ट्यूबों में ट्राइप्टिक सोया शोरबा, या टीएसबी के चार मिलीलीटर में प्रत्येक तनाव के एकल कॉलोनी को अलग करता है और ट्यूबों को लगभग 70 डिग्री कोण और प्रति मिनट 70 घूर्णन पर एक ट्यूब रोलर में 16 से 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर घुमाता है। अगली सुबह एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर संस्कृतियों के ६०० नैनोमीटर, या ओडी ६०० पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने और १२५ मिलीलीटर Delong फ्लास्क में मात्रा अनुपात के लिए एक पांच से एक flask पर बाँझ TSB के 25 मिलीलीटर में ०.०५ के एक ओडी ६०० के लिए कोशिकाओं को पतला । प्रति मिनट 280 घूर्णन पर 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में संस्कृतियों को इनक्यूबेट करें और घातीय चरण के दौरान कोशिकाओं को फसल दें।अपकेंद्री द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें और बाँझ पीबीएस की बराबर मात्रा में कोशिकाओं को दो बार धोएं। फिर ताजा पीबीएस में कोशिकाओं को एक प्राप्तकर्ता जानवर में उनके बाद इंजेक्शन के लिए मिलीलीटर एकाग्रता प्रति मिलीमीटर एकाग्रता के रूप में आठवीं कॉलोनी बनाने के लिए एक बार 10 से पुनर्व्यवित करें। उपयुक्त प्रायोगिक अंत बिंदु पर, कोमल मिलाते हुए या रोटेशन के साथ कमरे के तापमान पर अंधेरे में 24 से 48 इनक्यूबेशन घंटे के लिए 10% बफर फॉर्मेलिन युक्त 15 मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में गुर्दे, दिल, यकृत, फेफड़ों और तिल्ली की कटाई करें।निर्धारण के अंत में, शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए स्पष्ट ऊतक ठंड माध्यम में अंगों को एम्बेड करें। 10 माइक्रोमीटर मोटी ऊतक वर्गों को प्राप्त करने के लिए क्रायोस्टेट का उपयोग करें और DAPI के साथ पूरक कठिन बढ़ते मध्यम को लागू करने से पहले अंधेरे में 20 मिनट के लिए व्यक्तिगत पूर्व-साफ चार्ज ग्लास स्लाइड पर अनुभागों को सुखाएं। फिर कवर स्लिप लगाएं और नमूनों को चार डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण में स्थानांतरित करने से पहले रात भर कमरे के तापमान पर स्लाइड का इलाज करें ।नमूनों के भीतर घावों की पहचान करने के लिए, एक लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के चरण पर एक स्लाइड रखें और घावों की छवियों को प्राप्त करने के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए एक उपयुक्त उद्देश्य का उपयोग करें। कॉन्फोकल छवियों के भीतर फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के लिए, इमेजजे में एक छवि खोलें और घाव के फ्लोरेसेंस संकेत को ठीक से कल्पना करने के लिए चमक और विपरीत को समायोजित करें। बहुभुज चयन उपकरण का उपयोग करके रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करें और इमेजजे में एडिट टैब के तहत आरओआई प्रबंधक में आरओआई जोड़ें।संपादित करें, फिर चयन करें, और अंत में प्रबंधक में जोड़ें। इसके बाद, आरओआई का नाम बदलें और संबंधित छवि को लेबल करें। सेंट्रोइड को परिभाषित करने के लिए, विश्लेषण टैब खोलें और एरिया, मीन ग्रे वैल्यू, सेंट्रोइड और लिमिट टू थ्रेसहोल्ड का चयन करें।सेंट्रोइड फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य निकालें या प्रति इकाई क्षेत्र में दिए गए घाव में मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापें। यह आवश्यक के रूप में कम और ऊपरी फ्लोरेसेंस सीमा निर्धारित करने के लिए थ्रेसिंग फ़ंक्शन का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। डेटा को एक्सेल फाइल में निर्यात करें और परिधि और कोर के लिए प्रति इकाई क्षेत्र औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता का संकेत देने वाला कॉलम तैयार करें।परिधि और कोर में प्रति इकाई क्षेत्र औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता की गणना करने के लिए, मैन्युअल रूप से थ्रेसिंग की ऊपरी और निचली सीमाओं को परिभाषित करें। स्टेफिलोकोकस ऑरियस थर्मोन्यूक्लिज जीएफपी फ्यूजन फ्लोरेसेंस औसतन रिपोर्टर फ्यूजन नहीं ले जाने वाली कोशिकाओं की तुलना में संलयन जीन को ले जाने वाली कोशिकाओं में लगभग नौ गुना अधिक है । इसी तरह, टैंडेम डाइमरिक टोमैटो फ्यूजन फ्लोरेसेंस नल रिपोर्टर कंट्रोल से करीब छह गुना अधिक है ।रिपोर्टर गतिविधियों के पैटर्न की पुष्टि ऊतक समरूप के साथ प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा की जा सकती है। हालांकि फ्लोरेसेंस में गुना अंतर आम तौर पर कम होते हैं। फ्लोरेसेंस मापन में भिन्नता संवाददाताओं की विषम अभिव्यक्ति के कारण हो सकती है।उदाहरण के लिए, इन प्रतिनिधि नमूनों में यह देखा गया कि कुछ घावों ने एक ही ऊतक नमूने में लगभग 100 माइक्रोमीटर की दूरी के भीतर एक या दोनों संवाददाताओं को व्यक्त किया। स्टेफिलोकोकल एबीसीस समुदायों में एक एकल कोशिका संकल्प के लिए रिपोर्टर गतिविधि की जांच करने से स्टेफिलोकोकस ऑरियस थर्मोन्यूलिज़ अभिव्यक्ति के एक स्थानिक नियमन का पता चलता है जो मजबूत DAPI धुंधला के साथ घिरा हुआ है, जो न्यूट्रोफिल बाह्य जाल के गठन और रिहाई से जुड़ा होता है। उदाहरण के लिए, परिधि में स्थानीय की तुलना में स्टेफिलोकोकलस समुदाय के आंतरिक कोर में काफी अधिक स्टेफिलोकोकस ऑरियस थर्मोन्यूक्लूस जीएफपी फ्यूजन फ्लोरेसेसेंस मनाया जाता है।इसी एबीसीेस में टैंडेम डाइमरिक टोमैटो फ्यूजन फ्लोरेसेंस का पैटर्न उलटा दिखाई देता है। हालांकि, इस प्रयोग में पैटर्न सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं था। बरकरार क्रायो एम्बेडेड विच्छेदन प्राप्त फ्लोरेसेंस छवि विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है और ध्यान से किया जाना चाहिए।बैक्टीरियल कोशिकाओं की छंटाई उप-आबादी को अलग-अलग हद तक संलयन व्यक्त करने के लिए, आरएनए-सेक्यू विश्लेषण के साथ मिलकर ट्रांसक्रिप्टोम में जीनोम व्यापक परिवर्तनों को रोशन कर सकता है। फॉर्मेलिन के साथ काम करते समय ध्यान रखें क्योंकि यह एक कैंसरजन है और सीधे जोखिम पर त्वचा में जलन, एलर्जी प्रतिक्रियाओं या आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है। ब्याज के फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को ले जाने वाले उपभेदों के उत्परिवर्ती डेरिवेटिव पैदा करने से मनाया स्थानिक नियामक पैटर्न के लिए आनुवंशिक आधार प्रकट करने में मदद मिल सकती है।

Research

JoVE Journal

Genetics

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

रेट्रोवायरल स्कैनिंग: सेल-विशिष्ट विनियामक क्षेत्रों को परिभाषित करने के लिए मानचित्रण एमएलवी एकीकरण साइटें

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

इष्टतम गुणसूत्र स्थान का निर्धारण (ओं) एक डीएनए तत्व के लिए एक उपंयास Transposon-मध्यस्थता दृष्टिकोण का उपयोग कर ई कोलाई में

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

एक मानक पद्धति पर जांच करने के लिए साइट Mutagenicity के एक समारोह के रूप में बिंदु उत्परिवर्तन मरंमत Catalyzed द्वारा CRISPR/Cas9 और SsODN मानव कोशिकाओं में

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

लेजर Microirradiation Vivo में अध्ययन करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं सरल और जटिल डीएनए क्षति

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

एक Optogenetic विधि को नियंत्रित करने और सेल में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करने वाली सेल बातचीत

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Thromboxane A2 रिसेप्टर जीन के C924T Polymorphism अध्ययन करने के लिए एक विधि

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

जड़ Microbiome की खोज: मिट्टी, Rhizosphere से बैक्टीरियल समुदाय डेटा निकालने, और जड़ Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग जीन विनियामक अनुक्रम का उच्च प्रवाह पहचान (4c-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

मैक्सिकन Cavefish में जीन समारोह के हेरफेर

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral मध्यस्थता जीन Silencing में मानव Peudoislet कम अनुलग्नक प्लेट्स में तैयार

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...