Name: a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
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Ringraziamo Alexander Horswill per il dono della fusione di PsarAP1- tdTomato e Karen Creswell per aiuto con l'analisi di citometria a flusso. Ringraziamo anche Alyssa King per consigli sull'analisi statistica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da un premio di ricerca esplorativi/Developmental NIH (grant AI123708) e fondi di avvio facoltà di SRB. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dei dati e interpretazione o la decisione di presentare il lavoro per la pubblicazione.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Georgetown.
1. generazione del ceppo Reporter fluorescente
<ol><li>Digerire il vettore di pRB4 integrativa del genoma in sequenza con enzimi di restrizione EcoRI e SmaI. Seguendo il protocollo del produttore, impostare una digestione durante la notte con SmaI utilizzando 1 µ g di pRB4 a 25 ° C e quindi procedere con la seconda digestione per 1h a 37 ° C con l'aggiunt...

Malattie infettive batteriche sono un crescente problema di salute in tutto il mondo grazie all'acquisizione di determinanti di resistenza agli antibiotici46. Perché adattamento ad ambienti host è essenziale per la crescita e la sopravvivenza durante l'infezione, strategie basati su programmi di espressione genica che aumentano la forma fisica agente patogeno possono risultare utile terapeuticamente. Uno di questi programmi è l'insieme dei geni controllati dal sistema bicomponente SaeR/S (TCS),...

Batteri di rispondere alle mutevoli condizioni fisiologiche e alterazioni dello stato nutrizionale del loro ambiente esprimendo differenzialmente geni richiesti per la sopravvivenza e di adattamento. Per esempio, agenti patogeni opportunistici colonizzano corpo superfici a relativamente basso densità e spesso sono innocui. Tuttavia, una volta che il batterio ha penetrato le barriere fisiche e chimiche, esso deve vedersela con contro-difese ospite delle cellule immuni e limitata disponibilità nutriente1. Ad esempio, lo Staphylococcus aureus colonizza circa un terzo della popolazione senza sintomi ma è anche la causa della devastante della pelle e infezioni dei tessuti molli, osteomielite, endocardite e bacteremia2. Il successo di S. aureus come agente patogeno è spesso attribuito a sua flessibilità metabolica, nonché un arsenale di fattori di virulenza secrete e superficie-collegati che permettono il batterio sfuggire il flusso sanguigno e replicare nei tessuti periferici 3,4,5. Perché la morte di host a causa di malattia stafilococcica è un vicolo cieco dell'evoluzione e la trasmissione di limiti al nuovo host6, l'impegno per la produzione di fattore di virulenza deve essere controllato attentamente.
Una rete complessa regolamentazione di proteine e non-codificazione RNAs risponde ad una varietà di stimoli ambientali, tra cui cellulare densità, fase di crescita, fattori neutrofilo-collegati e disponibilità di nutrienti, per garantire che i geni di virulenza sono espresse alla tempo preciso e la posizione all'interno di host tessuti7,8,9,10,11,12,13. Per esempio, il sistema a due componenti SaeR/S (TCS) regola l'espressione di numerosi fattori di virulenza attraverso la chinasi di sensore (SaeS) e la risposta regolatore (SaeR)14. SaeS è autophosphorylated su un residuo di istidina conservata in risposta a host segnali (ad es., umana del neutrofilo peptidi [HNPs], calprotectina)8,15,16. Il gruppo fosforile viene poi trasferito ad un residuo di aspartato su SaeR, attivarlo come una proteina legante il DNA (SaeR ~ P)17. Il TCS SaeR/S regola oltre 20 geni che contribuiscono alla patogenesi tra cui proteine leganti di fibronectina (FnBPs), leukocidins e coagulasi14,18,19,20. Gli obiettivi possono essere classificati in ad alta affinità e bassa affinità geni bersaglio, che sono probabilmente indotta come il livello di SaeR ~ P aumenta quando esposti a suoi spunti21. L'attività di SaeR/S è controllata da altri regolatori dell'espressione genica, come ad esempio il sistema di rilevamento del quorum di Agr, repressore della proteina di tossine (Rot) e il fattore sigma alternativo B (SigB)22,23,24.
NUC è un gene di virulenza Sae-dipendente in stafilococco aureo e codifica thermonuclease (Nuc), che è essenziale per fuggire da neutrophilic einases traps (reti) e per diffusione durante il corso di infezione25,26. L'espressione di nuc è anche fortemente indirettamente repressa da CodY in presenza di aminoacidi a catena ramificata e GTP27e direttamente represso dalla proteina stafilococcica accessorio regolatore SarA28,29 , cui l'attività è influenzata da ossigeno (stato redox) e pH30. Dato che sae e nuc mutanti vengono attenuati in modelli murini di infezione, c'è interesse a sviluppare interventi chimici che inibiscono la loro corrispondente attività26,31. Nonostante questo, non c'è nessuna informazione per quanto riguarda la loro regolazione durante l'infezione.
Reporter fluorescenti sono stati utilizzati per monitorare e quantificare l'espressione genica a livello di singola cellula. Qui, presentiamo un metodo per quantificare S. espressione genica aureus durante l'infezione che, quando accoppiato con l'analisi del trascrittoma in vitro e potenti tecniche di imaging come la risonanza magnetica (MRI) e la spettroscopia a risonanza magnetica (MRS), può rivelare come batterica fisiologia è regolata in vivo e l'abbondanza relativa delle sostanze nutrienti in alcune nicchie. Il metodo può essere applicato a qualsiasi agente patogeno batterico con un sistema genetico trattabile.
Panoramica del vettore integrativo del genoma.
PRB4 di vettore integrativo il genoma contiene 500 accoppiamenti bassi dalle regioni a Monte e a valle del pseudogene di S. aureus USA300 SAUSA300_0087 per facilitare la ricombinazione omologa. pRB4 è derivato dalla spina dorsale di vettore termosensibile pMAD contenente la cassetta di resistenza all'eritromicina (ermC) e beta-galattosidasi termostabile gene bgaB per lo screening blu/bianco di ricombinanti32. La costruzione del reporter ingegnerizzati contiene anche un indicatore di resistenza di cloramfenicolo (cat) per la selezione dopo l'integrazione del genoma ed eliminazione di plasmide, nonché siti EcoRI e SmaI di fondere la regione regolatrice di interesse al verde superfolder proteina fluorescente (sGFP) (Figura 1). È noto che la scelta del sito di legame del ribosoma (RBS) influenza l'attività del reporter e spesso richiede ottimizzazione empirica33. Così, un RBS non è fornito. Qui, il sito di legame del ribosoma nativo viene utilizzato per fornire per un modello più naturale di espressione genica, ma altri siti possono essere utilizzati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">5% sheep blood</td>
			<td style="width:343px;">Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td>
			<td style="width:139px;">A10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:343px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">C57Bl/6 Mice</td>
			<td style="width:343px;">Charles River</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">C-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture, Cap</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D+2:25NA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miniprep, plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaking water bath</td>
			<td>New Brunswick Innova</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR purification</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:343px;">Cellgrow</td>
			<td style="width:139px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:343px;">Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-Kan</td>
			<td>GenScript (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Q5 Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:367px;">Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6300L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sanger Sequencing</td>
			<td>Genewiz (Germantown, MD)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sub Xero clear tissue freezing medium</td>
			<td>Mercedes Medical</td>
			<td style="width:139px;">MER5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superloop</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe, Filter</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto 40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S11351</td>
			<td>Membrane permeant nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:343px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">90000-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter-DU350</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues

Geni di virulenza batterica sono spesso regolati a livello trascrizionale da diversi fattori, che rispondono a differenti segnali ambientali. Alcuni fattori agiscono direttamente sui geni di virulenza; altri controllano patogenesi regolando l'espressione di regolatori a valle o l'accumulo di segnali che influiscono sull'attività del regolatore. Mentre il regolamento è stato studiato estesamente durante la crescita in vitro , relativamente piccolo è conosciuto circa come espressione genica è regolata durante l'infezione. Tali informazioni sono importanti quando il prodotto di un particolare gene è un candidato per l'intervento terapeutico. Trascrizionali approcci come RT-PCR quantitativa, in tempo reale e RNA-Seq sono potenti modi per esaminare l'espressione genica a livello globale, ma soffrono di molte sfide tecniche, tra cui scarsa abbondanza di RNA batterico rispetto al host RNA e campione degradazione di RNAsi. Valutazione regolamento utilizzando reporter fluorescenti è relativamente facile ed è canalizzabile con proteine fluorescenti con proprietà spettrali uniche. Il metodo consente analisi unicellulare, spazio-temporale dell'espressione genica in tessuti che presentano complessi gradienti di architettura e chimico-fisico tridimensionale che influiscono sulle reti di regolazione batteriche. Tali informazioni vengono perse quando i dati sono una media sopra la popolazione di massa. Qui, descriviamo un metodo per quantificare l'espressione genica in batteri patogeni in situ. Il metodo si basa sull'elaborazione di tessuto semplice e diretta osservazione della fluorescenza da proteine reporter. Dimostriamo l'utilità di questo sistema esaminando l'espressione di Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), prodotto del gene di cui è necessario per evasione immune e virulenza completo ex vivo e in vivo. Vi mostriamo quello nuc-gfp è fortemente espresso in Ascessi renali e rivelare espressione genica eterogenei dovuti in parte al regolamento apparente spaziale dell'attività del promotore nuc in ascessi pienamente impegnata con la risposta immunitaria. Il metodo può essere applicato a qualsiasi batterio con un sistema genetico manipolabile e qualsiasi modello di infezione, fornendo informazioni preziose per gli studi preclinici e lo sviluppo di farmaci.

Abbiamo sviluppato un plasmide derivato da pMAD32 in grado di fornire qualsiasi giornalista fusione costrutto nel cromosoma di ricombinazione omologa doppio crossover (Figura 1). Questo costrutto consente analisi quantitativa di qualsiasi regione regolatrice che sostiene la produzione di proteina GFP e segnale fluorescente sopra priorità bassa. Il plasmide conferisce resistenza all'ampicillina (Apr) per la manutenzione e la...

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A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Qui descritto è un metodo per l'analisi di espressione genica batterica nei tessuti animali ad un livello cellulare. Questo metodo fornisce una risorsa per studiare la diversità fenotipica che si verificano all'interno di una popolazione batterica in risposta all'ambiente del tessuto durante l'infezione.

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Questo metodo può rivelare modelli spaziali di espressione genica batterica e strategie per l'adattamento fisiologico ai micro-ambienti del tessuto ospite che si perdono se mediati su tutta la popolazione nei tessuti. Con questa tecnica possono essere rilevate potenziali eterogeneità che devono essere prese in considerazione quando si identificano nuove vie batteriche e proteine da prendere di mira da antivirulenza o composti antibatterici. Inizia striando ceppi di S.aureus di interesse sulle placche di agar del sangue da uno stock di glicerolo congelato e incubando le piastre a 37 gradi Celsius per 16-24 ore per confermare i loro fenotipi emolitici in base alla loro capacità di lisciviare i globuli rossi e formare zone trasparenti chiare.Inoculare gli isolati a singola colonia di ogni ceppo in quattro millilitri di brodo di soia triptico, o TSB, in tubi di vetro sterili e ruotare i tubi a 37 gradi Celsius per 16-24 ore in un rullo tubolare con un angolo di circa 70 gradi e 70 rotazioni al minuto. La mattina seguente misurare la densità ottica a 600 nanometri, o OD 600, delle colture su uno spettrofotometro e diluire le cellule a un OD 600 di 0,05 in 25 millilitri di TSB sterile con un rapporto tra cinque e uno pallone/volume in flaconi Delong da 125 millilitri. Incubare le colture in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius a 280 rotazioni al minuto e raccogliere le cellule durante la fase esponenziale.Pellet le cellule per centrifugazione e lavare le cellule due volte in un volume uguale di PBS sterile. Quindi resuspend le cellule in PBS fresco a una per 10 all'ottava colonia formando unità per concentrazione di millilitro per la loro successiva iniezione in un animale ricevente. Nel punto finale sperimentale appropriato, raccogliere il rene, il cuore, il fegato, i polmoni e la milza in tubi di polipropilene da 15 millilitri contenenti formalina tamponata al 10% per un'incubazione da 24 a 48 ore al buio a temperatura ambiente con delicati scuotimenti o rotazioni.Alla fine della fissazione, incorporare gli organi in un mezzo di congelamento dei tessuti chiari per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare un criostato per acquisire sezioni di tessuto spesse 10 micrometri e asciugare le sezioni su singoli vetri carichi pre-puliti per 20 minuti al buio prima di applicare un supporto di montaggio duro integrato con DAPI. Quindi applicare le scivolate di copertura e polimerizzarle a temperatura ambiente durante la notte prima di trasferire i campioni in conservazione a lungo termine a quattro gradi Celsius.Per identificare le lesioni all'interno dei campioni, posizionare una diapositiva sullo stadio di un microscopio confocale a scansione laser e utilizzare un obiettivo appropriato per visualizzare le singole cellule per acquisire immagini delle lesioni. Per misurare le intensità di fluorescenza all'interno delle immagini confocali, aprire un'immagine in ImageJ e regolare la luminosità e il contrasto per visualizzare correttamente il segnale di fluorescenza della lesione. Definire l'area di interesse utilizzando lo strumento selezioni poligonale e aggiungere il ROI al gestore del ROI nella scheda Modifica in ImageJ.Selezionare Modifica, quindi Selezione e infine Aggiungi a Manager. Rinominare quindi il ROI ed etichettare la rispettiva immagine. Per definire il baricentro, aprite la scheda Analizza (Analyze) e selezionate Area, Valore grigio medio (Mean Gray Value), Baricentro (Centroid) e Limite a soglia (Limit to Threshold).Estrarre il valore di intensità della fluorescenza centroide o misurare l'intensità media della fluorescenza in una data lesione per unità di area. Ciò può essere ottenuto utilizzando la funzione di soglia per impostare i limiti di fluorescenza inferiore e superiore, se necessario. Esportare i dati in un file excel e preparare una colonna che indichi l'intensità media della fluorescenza per unità di area per la periferia e il nucleo.Per calcolare le intensità di fluorescenza media per unità di area nella periferia e nel nucleo, definire manualmente i limiti superiore e inferiore della soglia. Staphylococcus aureus termonucleasi GFP la fluorescenza di fusione è in media quasi nove volte superiore nelle cellule che trasportano il gene di fusione rispetto alle cellule che non trasportano la fusione reporter. Allo stesso modo, la fluorescenza a fusione di pomodoro dimerica tandem è circa sei volte superiore al controllo nullo del reporter.Il modello delle attività dei reporter può essere confermato dalla citometria a flusso con omogeneati tissutali. Sebbene le differenze di piegatura nella fluorescenza siano tipicamente inferiori. Le variazioni nelle misurazioni della fluorescenza possono essere dovute all'espressione eterogenea dei giornalisti.Ad esempio, in questi campioni rappresentativi è stato osservato che alcune lesioni hanno espresso uno o entrambi i giornalisti entro circa 100 micrometri di distanza nello stesso campione di tessuto. Esaminando l'attività del reporter a una risoluzione a singola cellula nelle comunità di acesso stafilococco rivela una regolazione spaziale dell'espressione della termonucleasi stafilococco aureo negli ascessi circoscritti con forte colorazione DAPI, probabilmente associata alla formazione e al rilascio di trappole extracellulari neutrofile. Ad esempio, nel nucleo interno della comunità dell'acesso stafilococco aureo si osserva una fluorescenza di fusione GFP significativamente più elevata rispetto alla localizzata alla periferia.Nello stesso acesso, il modello per la fluorescenza a fusione di pomodoro dimerica tandem sembra essere invertito. Tuttavia, il modello di questo esperimento non era statisticamente significativo. Ottenere dissezioni crio-incorporate intatte è vitale per l'analisi dell'immagine a fluorescenza e deve essere fatto con attenzione.Lo smistamento delle cellule batteriche per catturare sotto-popolazioni che esprimono la fusione in varia misura, insieme all'analisi RNA-Seq potrebbe illuminare i cambiamenti a livello genomico nel trascrittame. Prestare attenzione quando si lavora con la formalina in quanto cancerogena e può causare irritazione cutanea, reazioni allergiche o danni agli occhi all'esposizione diretta. Generare derivati mutanti di ceppi che trasportano reporter fluorescenti di interesse può aiutare a rivelare le basi genetiche per i modelli regolatori spaziali osservati.

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