Name: a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
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Alexander Horswill Agradecemos o presente da fusão de tdTomato - PsarAP1e Karen Creswell para ajuda com análise de citometria de fluxo. Agradecemos também a Alyssa King para aconselhamento sobre análise estatística. Este trabalho foi financiado em parte por uma NIH exploratório/Developmental Research Award (grant AI123708) e fundos de inicialização da faculdade para SRB. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e interpretação ou a decisão de submeter o trabalho para publicação.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Georgetown e institucional Cuidado Animal.
1. geração da estirpe repórter fluorescentes
<ol><li>Digeri o vetor de pRB4 Integrativa do genoma sequencialmente com enzimas de restrição EcoRI e SmaI. Seguindo o protocolo do fabricante, configurar uma digestão durante a noite com SmaI usando 1 µ g de pRB4 a 25 ° C e então prosseguir com a segunda digestão durante 1h a 37 ° C, adicionando Eco...

Doenças infecciosas bacterianas são um crescente problema de saúde em todo o mundo devido à aquisição de resistência aos antibióticos determinantes46. Porque a adaptação a ambientes de host é essencial para o crescimento e sobrevivência durante a infecção, estratégias visando programas de expressão do gene que aumentam a aptidão do patógeno podem ser útil terapeuticamente. Um desses programas é o conjunto de genes controlados pelo sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS), mo...

Bactérias respondem às novas condições fisiológicas e alterações no estado nutricional de seu ambiente expressando diferencialmente genes necessários para adaptação e sobrevivência. Por exemplo, patógenos oportunistas colonizam o corpo superfícies em relativamente baixa densidades e muitas vezes são inofensivos. No entanto, uma vez que a bactéria penetrou barreiras físicas e químicas, deve lidar com as Counter-defesas de célula imune do hospedeiro e disponibilidade de nutrientes restrita1. Por exemplo, Staphylococcus aureus coloniza aproximadamente um terço da população assintomaticamente, mas é também a causa do devastador de pele e infecções de tecidos moles, osteomielite, endocardite e bacteriemia2. O sucesso de S. aureus como um patógeno é frequentemente atribuído à sua flexibilidade metabólica, bem como um arsenal de fatores de virulência associada a superfície e secretada que permitem que a bactéria escapar na corrente sanguínea e replicar em tecidos periféricos 3,4,5. Porque o anfitrião a morte devido à doença estafilocócica é um beco sem saída evolutivo e transmissão de limites a novos hospedeiros6, o compromisso com a produção de factor de virulência deve ser cuidadosamente controlado.
Uma complexa rede de regulação das proteínas e responde RNA não-codificante para uma variedade de estímulos ambientais, incluindo celular, densidade, fase de crescimento, fatores associados neutrófilos e disponibilidade de nutrientes, para garantir que os genes de virulência são expressos nas hora exacta e localização dentro do hospedeiro, tecidos7,8,9,10,11,12,13. Por exemplo, o sistema de dois componentes de SaeR/S (TCS) regula a expressão de vários fatores de virulência através da quinase do sensor (PEA) e a resposta regulador (SaeR)14. Pea é autophosphorylated em um resíduo de histidina conservada em resposta a sinais (por exemplo,, humana neutrófilos peptídeos [HNPs], calprotectin) de acolhimento a8,15,16. O grupo de fosforilo é então transferido para um resíduos de aspartato na SaeR, ativando-o como uma proteína de ligação a DNA (SaeR ~ P)17. O TCS SaeR/S regula mais de 20 genes que contribuem para a patogênese incluindo fibronectina proteínas (FnBPs) e leucocidinas estafilococos coagulase14,18,19,20. Metas podem ser classificadas em alvos de alta afinidade e baixa afinidade do gene, que possam induzido como o nível de SaeR ~ P levanta-se quando exposto a suas sugestões21. A atividade de SaeR/S é controlada por outros reguladores da expressão gênica, como o sistema de sensoriamento de quórum Agr, repressor de proteína de toxinas (Rot) e a alternativa fator sigma B (SigB)22,23,24.
NUC é um gene de virulência Sae-dependente em Staphylococcus aureus e codifica thermonuclease (Nuc), que é essencial para escapar do neutrophilic extracellular traps (redes) e para divulgação durante o curso de infecção25,26. A expressão do nuc é também fortemente indiretamente reprimida pelo CodY na presença de aminoácidos de cadeia ramificada e GTP27e diretamente reprimida pela proteína estafilocócica regulador acessório SarA28,29 , cuja actividade é influenciada pelo oxigênio (estado de redox) e pH30. Dado que sae e nuc mutantes são atenuados em modelos do rato de infecção, há interesse em desenvolver intervenções químicas que inibem a sua correspondente atividades26,31. Apesar disso, não há nenhuma informação sobre sua regulação durante a infecção.
Repórteres fluorescentes tem sido usados para monitorar e quantificar a expressão do gene no nível da célula única. Neste documento, apresentamos um método para a quantificação dos S. aureus expressão gênica durante a infecção que, quando combinadas com in vitro transcriptome análise e poderosas técnicas de imagem como a ressonância magnética (MRI) e espectroscopia de ressonância magnética (MRS), pode revelar como bacteriana fisiologia está regulamentada no vivo e a abundância relativa de nutrientes em determinados nichos. O método pode ser aplicado a qualquer agente patogénico bacteriano com um sistema genético tractable.
Visão geral do vetor Integrativa do genoma.
O genoma Integrativa vector pRB4 contém 500 pares de bases cada das regiões a montante e a jusante do pseudogene do S. aureus USA300 SAUSA300_0087 para facilitar o recombination homologous. pRB4 é derivado de backbone sensíveis à temperatura pMAD vetor contendo a gaveta de resistência de eritromicina (ermC) e beta-galactosidase thermostable gene bgaB para rastreio de azul/branco, recombinants32. A construção de engenharia repórter também contém um marcador de resistência de cloranfenicol (gato) para a seleção após a integração do genoma e eliminação do plasmídeo, bem como locais de EcoRI e SmaI para fundir a região reguladora de interesse para verde superfolder proteína fluorescente (sGFP) (Figura 1). É conhecido que a escolha do sítio de ligação do ribossomo (RBS) influencia a atividade do repórter e muitas vezes requer otimização empírica33. Assim, um RBS não é fornecido. Aqui, o sítio de ligação do ribossomo nativo é usado para fornecer um padrão mais natural da expressão do gene, mas outros sites podem ser utilizados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">5% sheep blood</td>
			<td style="width:343px;">Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td>
			<td style="width:139px;">A10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:343px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">C57Bl/6 Mice</td>
			<td style="width:343px;">Charles River</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">C-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture, Cap</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D+2:25NA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miniprep, plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaking water bath</td>
			<td>New Brunswick Innova</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR purification</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:343px;">Cellgrow</td>
			<td style="width:139px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:343px;">Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-Kan</td>
			<td>GenScript (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Q5 Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:367px;">Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6300L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sanger Sequencing</td>
			<td>Genewiz (Germantown, MD)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sub Xero clear tissue freezing medium</td>
			<td>Mercedes Medical</td>
			<td style="width:139px;">MER5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superloop</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe, Filter</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto 40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S11351</td>
			<td>Membrane permeant nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:343px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">90000-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter-DU350</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues

Genes de virulência bacteriana frequentemente são regulados a nível transcricional por múltiplos fatores que respondem a sinais ambientais diferentes. Alguns fatores agem diretamente sobre os genes de virulência; outros controlam patogênese ajustando a expressão dos reguladores a jusante ou a acumulação de sinais que afetam a atividade do regulador. Enquanto o regulamento tem sido estudado extensivamente durante o crescimento em vitro , relativamente pouco se sabe sobre como a expressão gênica é ajustada durante a infecção. Tal informação é importante quando um produto do gene específico é um candidato para a intervenção terapêutica. Abordagens transcriptional como RT-PCR em tempo real, quantitativo e RNA-Seq são maneiras poderosas para examinar a expressão do gene em um nível global, mas sofrem muitos desafios técnicos, incluindo baixa abundância de RNA bacteriano comparado ao RNA do hospedeiro e amostra degradação por RNases. Avaliar o Regulamento usando repórteres fluorescentes é relativamente fácil e pode ser multiplexado com proteínas fluorescentes com propriedades espectrais únicas. O método permite a célula única, spatiotemporal análise de expressão gênica em tecidos que apresentam tridimensional arquitetura e physiochemical gradientes complexos que afetam redes de regulação bacterianas. Tais informações são perdidas quando dados são calculados sobre a população em massa. Aqui, descrevemos um método para quantificar a expressão gênica em patógenos bacterianos in situ. O método baseia-se no processamento do tecido simples e observação directa da fluorescência das proteínas de repórter. Vamos demonstrar a utilidade deste sistema, examinando a expressão de Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), cujo produto gênico é necessário para evasão imune e virulência completa ex vivo e in vivo. Mostramos que nuc-gfp é fortemente expressos em abcessos renais e revelar expressão de gene heterogêneo devido em parte à aparente regulação espacial da atividade de promotor nuc em abcessos totalmente engajado com a resposta imune. O método pode ser aplicado a qualquer bactéria com um sistema genético manipulável e qualquer modelo de infecção, fornecendo informações valiosas para o desenvolvimento de drogas e estudos pré-clínicos.

Desenvolvemos um plasmídeo derivado pMAD32 que pode entregar qualquer repórter construção de fusão para o cromossomo por recombinação homóloga de cruzamento duplo (Figura 1). Esta construção permite a análise quantitativa de qualquer região reguladora que suporta a produção de proteína GFP e sinal fluorescente acima do fundo. O plasmídeo confere resistência ampicilina (Apr) para a manutenção e propagação...

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A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Um método baseado em fluorescência para estudar o Regulamento de Gene bacteriano em tecidos infectados

Descrito aqui é um método de análise de expressão gênica bacteriana em tecidos animais em nível celular. Este método fornece um recurso para estudar a diversidade fenotípica ocorrendo dentro de uma população bacteriana em resposta ao ambiente de tecido durante uma infecção.

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Este método pode revelar padrões espaciais de expressão genética bacteriana e estratégias de adaptação fisiológica aos microambientais de tecido hospedeiro que são perdidos quando em média em toda a população em tecidos. Com essa técnica podem ser detectadas potenciais heterogeneidades que devem ser consideradas ao identificar novas vias bacterianas e proteínas a serem alvo de antivirulência ou compostos antibacterianos. Comece por estirpes de S.aureus de interesse em placas de ágar de sangue de um estoque de glicerol congelado e incubando as placas a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas para confirmar seus fenótipos hemollíticos com base em sua capacidade de lise de glóbulos vermelhos e formar zonas transparentes claras.Inocular isolados de uma única colônia de cada cepa em quatro mililitros de caldo de soja tripptic, ou TSB, em tubos de vidro estéreis e girar os tubos a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas em um rolo de tubo em um ângulo de aproximadamente 70 graus e 70 rotações por minuto. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros, ou OD 600, das culturas em um espectógrafo e dilua as células a um OD 600 de 0,05 em 25 mililitros de TSB estéril em um frasco de cinco para um em uma razão de volume em 125 mililitros de frascos Delong. Incubar as culturas em um banho de água de 37 graus Celsius a 280 rotações por minuto e colher as células durante a fase exponencial.Pelotar as células por centrifugação e lavar as células duas vezes em um volume igual de PBS estéril. Em seguida, resuspende as células em PBS fresco para uma vezes 10 a oitava colônia formando unidades por concentração mililitro para sua injeção subsequente em um animal receptor. No ponto final experimental apropriado, colde o rim, coração, fígado, pulmões e baço em tubos de polipropileno de 15 mililitros contendo formalina 10% tamponada para uma incubação de 24 a 48 horas no escuro à temperatura ambiente com agitação suave ou rotação.No final da fixação, incorpore os órgãos em meio de congelamento de tecido claro para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Use um criostat para adquirir seções de tecido de 10 micrômetros de espessura e seque as seções em lâminas de vidro carregadas pré-limpas individuais por 20 minutos no escuro antes de aplicar o meio de montagem dura complementado com DAPI. Em seguida, aplique deslizamentos de cobertura e cure os slides à temperatura ambiente durante a noite antes de transferir as amostras para armazenamento a longo prazo a quatro graus Celsius.Para identificar lesões dentro das amostras, coloque um slide no estágio de um microscópio confocal de varredura a laser e use um objetivo apropriado para visualizar células individuais para adquirir imagens das lesões. Para medir as intensidades de fluorescência dentro das imagens confocal, abra uma imagem no ImageJ e ajuste o brilho e contraste para visualizar adequadamente o sinal de fluorescência da lesão. Defina a região de interesse usando a ferramenta seleções de polígonos e adicione o ROI ao gerenciador de ROI na guia Editar no ImageJ.Selecione Editar, depois Selecionar e, finalmente, Adicionar ao gerente. Em seguida, renomeie o ROI e rotule a respectiva imagem. Para definir o centroid, abra a guia Analisar e selecione Área, Valor Cinza Médio, Centroid e Limite ao Limite.Extrair o valor da intensidade da fluorescência centroide ou medir a intensidade média de fluorescência em uma determinada lesão por área unitária. Isso pode ser alcançado usando a função de limiar para definir os limites de fluorescência inferior e superior, conforme necessário. Exporte os dados para um arquivo Excel e prepare uma coluna indicando a intensidade média de fluorescência por unidade para a periferia e o núcleo.Para calcular as intensidades médias de fluorescência por unidade na periferia e no núcleo, defina manualmente os limites superiores e inferiores do limiar. Staphylococcus aureus thermonuclease GFP fusion fluorescence é, em média, quase nove vezes maior em células que carregam o gene de fusão do que em células que não carregam a fusão repórter. Da mesma forma, a fluorescência de fusão de tomate dimeric tandem é cerca de seis vezes maior do que o controle nulo do repórter.O padrão das atividades dos repórteres pode ser confirmado por citometria de fluxo com homogeneizadores teciduais. Embora as diferenças de dobra na fluorescência sejam tipicamente menores. Variações nas medidas de fluorescência podem ser devido à expressão heterogênea dos repórteres.Por exemplo, nessas amostras representativas observou-se que algumas lesões expressavam uma ou ambas as repórteres dentro de aproximadamente 100 micrômetros de distância na mesma amostra de tecido. Examinar a atividade do repórter para uma resolução de célula única em comunidades estafilocócicas abcess revela uma regulação espacial da expressão estaphylococcus aureus termonuclease em abscessos circunscritos com forte coloração da DAPI, provavelmente associada à formação e liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos. Por exemplo, a fluorescência de fusão de estafilococos aureus termonuclease GFP é observada no núcleo interno da comunidade staphylococcal abcess em comparação com localizada à periferia.Na mesma abcess, o padrão para a fluorescência de fusão de tomate dimeric tandem parece ser invertido. No entanto, o padrão neste experimento não foi estatisticamente significativo. A obtenção de dissecções crio-incorporadas intactas é vital para a análise de imagem da fluorescência e deve ser feita com cuidado.A classificação das células bacterianas para capturar sub-populações expressando a fusão em diferentes extensões, juntamente com a análise de RNA-Seq poderia iluminar grandes mudanças no genoma no transcriptome. Tome cuidado ao trabalhar com formalina, pois é um cancerígeno e pode causar irritação na pele, reações alérgicas ou danos oculares após exposição direta. Gerar derivados mutantes de cepas que transportam repórteres fluorescentes de interesse pode ajudar a revelar a base genética para os padrões regulatórios espaciais observados.

Research

JoVE Journal

Genetics

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Varredura Retroviral: Mapeamento de sites de integração MLV para definir regiões reguladoras específicas de células

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Genética

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

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Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

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Um método de Optogenetic para controlar e analisar os padrões de expressão de Gene em interações de célula para célula

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

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Silenciamento gênico mediado por Lentivirus em Pseudoislet humano preparado em placas de baixo acessório

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