Name: a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues
Uploaded: 2019-02-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

Alexander Horswill PsarAP1- tdTomato füzyon ve Karen Creswell hediye Akış Sitometresi Analizi ile ilgili yardım için teşekkür ediyoruz. Biz Ayrıca Alyssa King istatistiksel analiz tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen bir NIH Exploratory/gelişim Araştırma Ödülü (grant AI123708) ve SRB fakülte başlangıç fonlar tarafından finanse edildi. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve yorumu veya iş yayını için göndermek için karar herhangi bir rolü yoktu.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Georgetown Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. nesil floresan muhabir zorlanma
<ol><li>Sırayla EcoRI ve SmaI enzimleri ile genom bütünleştirici pRB4 vektör sindirmek. Üreticinin protokolüne pRB4 1 µg 25 ° C'de kullanarak SmaI ile bir gecede sindirim ayarlayın ve sonra ikinci sindirim 37 ° C'de 1 h için EcoRI reaksiyon karışıma ekleyerek devam. Enzimler için 20 dk 65 ° C'de kuluçk...

Bakteriyel enfeksiyon hastalıkları antibiyotik direnci belirleyicileri46edinimi nedeniyle Dünya çapında bir artan sağlık sorunu vardır. Ana bilgisayar ortamları uyum gelişim ve hayatta kalma sırasında enfeksiyon için gerekli olduğundan, patojen fitness artırmak gen ifade programları hedefleme stratejileri tedavi amaçlı işe yarayabilir. Böyle bir programı bağışıklık kaçırma47yılında önemli bir rol oynamak için daha önce gösterilen SaeR/S iki...

Bakteri differentially adaptasyon ve hayatta kalmak için gerekli genler ifade ederek değişiklik çevreleri beslenme durumu ve fizyolojik şartlarda değişen cevap. Örneğin, fırsatçı patojenler yüzeyler, nispeten düşük yoğunlukları ve çoğu kez zararsız vücut kolonize. Bir kez bakteri fiziksel ve kimyasal bariyerler nüfuz, ancak, bu ana bilgisayar bağışıklık hücre karşı savunma ve sınırlı besin kullanılabilirlik1ile uğraşmak zorundadır. Örnek olarak, Staphylococcus aureus nüfusun yaklaşık üçte biri asymptomatically colonizes ama aynı zamanda yıkıcı deri ve yumuşak doku enfeksiyonları, osteomiyelit, endokardit ve bakteriyemi2nedeni. S. aureus bir patojen olarak başarısı kez metabolik olarak esneklik yanı sıra kan dolaşımına kaçmak ve periferik dokularda çoğaltmak bakteri etkinleştirmek yüzey ilişkili ve salgılanan virülans faktörleri bir cephanelik atfedilir 3,4,5. Stafilokokal hastalığı nedeniyle ana ölüm bir evrimsel çıkmaz ve yeni ev sahibi6sınırları iletim olduğundan, virülans faktörü üretime bağlılık dikkatle denetlenmelidir.
Karmaşık bir düzenleyici ağı kodlamayan RNA'ların yanıt için a değişiklik-in çevre uyaranlara ve proteinler de dahil olmak üzere hücre yoğunluğu, büyüme aşaması, nötrofil ilişkili faktörler ve besin durumu virülans genler, ifade edilir emin olmak için kesin zaman ve yer içinde ana bilgisayar doku7,8,9,10,11,12,13. Örneğin, SaeR/S iki bileşen sistemi (TCS) sensör kinaz (SaeS) ve yanıt regülatörü (SaeR)14üzerinden birkaç virülans faktörleri ifade düzenlemektedir. SaeS autophosphorylated ana bilgisayar sinyalleri (örneğin, insan nötrofil peptidler [HNPs], calprotectin)8,15,16yanıt olarak korunmuş histidin kalıntısı üzerinde olduğunu. Phosphoryl grubu sonra SaeR, harekete geçirmek o DNA'ya bağlanıcı protein üzerinde bir aspartat kalıntı aktarılır (SaeR ~ P)17. SaeR/S TCS fibronektin proteinler (FnBPs), leukocidins ve koagülaz14,18,19,20gibi patogenezinde katkıda 20'den fazla gen düzenlemektedir. Hedefleri SaeR düzeyi olarak indüklenen olasılığı yüksek benzeşme ve düşük-benzeşme gen hedefleri içine gizli ~ P onun ipuçlarını21' e maruz kaldığında yükselir. SaeR/S etkinlik gen ekspresyonu Agr çekirdek algılama sistemi gibi diğer düzenleyiciler, önleyici toksinler protein (Rot) ve alternatif sigma faktörü B (SigB)22,23,24tarafından kontrol edilir.
nuc Staphylococcus aureus bir Sae-bağımlı virülans gen ve thermonuclease (Nuc), neutrophilic extracellular trap (ağlar) kaçan ve dağıtımı sırasında için gerekli olan kodlar Tabii ki enfeksiyon25,26. Nuc ifade tarafından CodY dallı zincirli amino asitler ve GTP27varlığında da şiddetle dolaylı olarak bastırılmış ve doğrudan Stafilokokal aksesuar regülatör protein SarA28,29 tarafından bastırılmış , olan faaliyet oksijen (redoks devlet) ve pH30tarafından etkiledi. SAE ve nuc mutantlar enfeksiyon fare modellerinde zayıflatılmış verilen bu, onların ilgili etkinlikleri26,31inhibe kimyasal müdahaleler gelişmekte olan ilgi olduğunu. Buna rağmen onların düzenleme sırasında enfeksiyon ile ilgili hiçbir bilgi yoktur.
Floresan gazetecilere Gen ifadesinin tek hücre düzeyinde ölçmek ve izlemek için kullanılmaktadır. Burada, biz Smiktarının bir yöntem mevcut. aureus gen ekspresyonu enfeksiyon sırasında ne zaman çifte ile tüp bebek transcriptome Analizi ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve manyetik rezonans spektroskopi (MRS), gibi güçlü görüntüleme teknikleri ortaya nasıl bakteriyel Fizyoloji vivo ve belirli niş içinde besin göreli zenginliği düzenlenmiştir. Yöntem bakteriyel herhangi bir patojen uysal bir genetik sistemi ile uygulanabilir.
Genom bütünleştirici vektör genel bakış.
Genom bütünleştirici vektör pRB4 500 baz çifti her S. aureus USA300 SAUSA300_0087 pseudogene Homolog rekombinasyon kolaylaştırmak için akış yukarı ve aşağı akım bölgelerinden içerir. pRB4 eritromisin direnç kaset (ermC) ve opsonins beta galaktozidaz gen bgaB mavi/beyaz tarama rekombinasyonlar32içeren sıcaklığa duyarlı pMAD vektör omurga türetilir. Mühendislik muhabir yapı da seçimden sonra genom entegrasyon ve plazmid eleme yanı sıra ilgi superfolder yeşil düzenleyici bölgesi sigorta için EcoRI ve SmaI siteleri için kloramfenikol direnç işaretçisi (kedi) içeren Floresan protein (sGFP) (Şekil 1). Seçtiğiniz ribozom bağlama Makinası (KÇY) bir muhabir aktivitesini etkiler ve ampirik optimizasyonu33kez gerektirir bilinir. Böylece, bir KÇY sağlanan. Burada, yerel ribozom bağlama sitesi gen ekspresyonu daha doğal bir desen için sağlamak için kullanılır, ancak diğer sitelerde kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1015px;" width="1014">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">5% sheep blood</td>
			<td style="width:343px;">Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td>
			<td style="width:139px;">A10</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:367px;">5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranoside (X-Gal)</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>R0402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:343px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">BP1760-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">C57Bl/6 Mice</td>
			<td style="width:343px;">Charles River</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">C-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat microtome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture, Cap</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>2005-02512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">D+2:25NA Oligo</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Erythromycin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E5389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Analyzer</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z273627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Miniprep, plasmid</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaking water bath</td>
			<td>New Brunswick Innova</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR purification</td>
			<td>QIagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td style="width:343px;">Cellgrow</td>
			<td style="width:139px;">46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td style="width:343px;">Tecan</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Laboratories</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pUC57-Kan</td>
			<td>GenScript (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Q5 Taq DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:367px;">Restriction Enzymes</td>
			<td>New England Biolabs (Ipswich, MA)</td>
			<td style="width:139px;">R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse transcriptase</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E6300L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Sanger Sequencing</td>
			<td>Genewiz (Germantown, MD)</td>
			<td style="width:139px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sub Xero clear tissue freezing medium</td>
			<td>Mercedes Medical</td>
			<td style="width:139px;">MER5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">superloop</td>
			<td>GE Lifesciences</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe, Filter</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>28145-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syto 40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">S11351</td>
			<td>Membrane permeant nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tetracycline</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:367px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:343px;">VWR</td>
			<td style="width:139px;">90000-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-visible spectrophotometer</td>
			<td>Beckman Coulter-DU350</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield Antifade Mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based method to study bacterial gene regulation in infected tissues

Bakteriyel virülans genler kez transkripsiyon düzeyinde farklı çevresel sinyallere yanıt multipl faktörler tarafından düzenlenmektedir. Bazı faktörler doğrudan virülans genler üzerinde hareket; diğerleri Patogenez aşağı akım düzenleyiciler ifade veya regülatör etkinlik etkileyen sinyalleri birikimi ayarlayarak kontrol. Yönetmelik kapsamlı vitro büyüme sırasında okudu iken, nispeten az nasıl gen ekspresyonu enfeksiyon sırasında ayarlanır bilinir. Belirli gen ürünü terapötik müdahale için bir aday olduğunda böyle önemli bir bilgidir. Transkripsiyon yaklaşımlar gibi nicel, gerçek zamanlı RT-PCR ve RNA-Seq gen ekspresyonu küresel düzeyde incelemek ama bakteriyel RNA ana bilgisayar RNA ve örnek ile karşılaştırıldığında düşük bolluk dahil olmak üzere birçok teknik sorunlar muzdarip için güçlü yolu vardır RNases tarafından bozulması. Floresan gazetecilere kullanarak düzenleme değerlendirmek nispeten kolaydır ve benzersiz spektral özellikleri ile floresan proteinler ile multiplexed. Yöntemi gen ekspresyonu bakteriyel düzenleyici ağları etkileyen karmaşık üç boyutlu mimari ve physiochemical degradeler sergi dokularda tek hücreli, kronolojik zamanmekansal analizine olanak sağlar. Veri toplu Nüfus ortalaması bu tür bilgileri kaybolur. Burada, bakteriyel patojenler içinde in situgen ifadesinde miktarının bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem basit doku işleme ve floresan muhabir proteinler üzerinden doğrudan gözlem dayanır. Biz bu sistem yardımcı programı olan gen ürünü bağışıklık kaçırma ve ex vivo ve içinde vivo tam virülans için gereklidir Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), ifade inceleyerek göstermek. Biz o nük-gfp şiddetle renal apse ifade edilir ve türdeş olmayan gen ekspresyonu nedeniyle kısmen tamamen meşgul bağışıklık yanıtıyla apse nuc organizatörü faaliyete belirgin mekansal düzenleme için ortaya çıkarmak göstermek. Yöntem manipulatable bir genetik sistemi ile herhangi bir bakteri ve preklinik çalışmalar ve ilaç geliştirme için değerli bilgi veren herhangi bir enfeksiyon modeli uygulanır.

Herhangi bir muhabir sunabilirsiniz pMAD32 türetilmiş bir plazmid geliştirdiğimiz füzyon yapı tarafından çift crossover Homolog rekombinasyon (Şekil 1) kromozom içine. Kantitatif analiz GFP protein ve arka plan üzerinde floresan sinyal üretimini destekleyen herhangi bir düzenleyici bölgesi için bu yapıyı sağlar. Plazmid ampisilin direnç (Apr) bakım ve E. coli yayılmasında confers ve eritromisin...

Watch this Scientific Journal Video about A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues at JoVE.com

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bakteriyel gen düzenlemesi enfekte dokularda çalışmaya bir floresan tabanlı yöntemi

Burada açıklanan bakteri gen ekspresyonu hayvan dokularında hücresel düzeyde analiz etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem ve doku ortamındaki bakteriyel bir nüfus enfeksiyon sırasında içinde meydana gelen fenotipik çeşitlilik eğitimi için bir kaynak sağlar.

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Bu yöntem, bakterigen ekspresyonunun uzamsal desenlerini ve dokularda ortalama olarak tüm popülasyonda kaybolan doku mikro ortamlarına fizyolojik adaptasyon stratejilerini ortaya çıkarabilir. Bu teknik ile antivirülans veya antibakteriyel bileşikler tarafından hedef alınacak yeni bakteriyel yollar ve proteinler belirlenirken göz önünde bulundurulması gereken potansiyel heterojeniteler tespit edilebilir. Dondurulmuş bir gliserol stokundan kan agar plakaları üzerinde ilgi S.aureus suşları çizgili ve kırmızı kan hücreleri lyse ve net şeffaf bölgeler oluşturmak için yeteneklerini dayalı hemolitik fenotipleri onaylamak için 16 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derece plakaları kuluçka ile başlayın.Tek bir koloni, her bir suştan dört mililitre triptik soya suyu veya TSB'yi steril cam tüplerde izole edin ve tüpleri 37 derecede 16 ila 24 saat boyunca yaklaşık 70 derecelik bir açıve dakikada 70 dönüşle bir tüp silindirinde döndürün. Ertesi sabah bir spektrofotometre üzerinde kültürlerin 600 nanometre, ya da OD 600 optik yoğunluğu ölçmek ve 125 mililitre Delong şişelerde hacim oranına beş ila bir şişe de steril TSB 25 mililitre 0,05 bir OD 600 hücreleri seyreltmek. Dakikada 280 rotasyonlar 37 derece santigrat su banyosu kültürleri kuluçka ve üstel faz sırasında hücreleri hasat.Santrifüj ile hücreleri pelet ve steril PBS eşit hacimde iki kez hücreleri yıkayın. Daha sonra taze PBS'deki hücreleri bir kere 10'dan sekizinci koloninin mililitre konsantrasyonu başına bir sonraki enjeksiyonu için alıcı bir hayvana yeniden attırın. Uygun deneysel bitiş noktasında, böbrek, kalp, karaciğer, akciğerler ve dalak hasat 15 mililitre polipropilen tüpler içeren 10% tamponlu formalin için 24-48 saat karanlıkta oda sıcaklığında nazik sallayarak veya rotasyon ile kuluçka.Fiksasyon sonunda, eksi 80 santigrat derece depolama için açık doku dondurma ortamı na organları gömmek. 10 mikrometre kalınlığında doku bölümleri elde etmek ve DAPI ile takviye sert montaj ortamı uygulamadan önce karanlıkta 20 dakika boyunca ayrı önceden temizlenmiş şarjlı cam slaytlar üzerinde bölümleri kuru bir kriyostat kullanın. Daha sonra kapak fişleri uygulayın ve numuneleri dört santigrat derecede uzun süreli depolamaya aktarmadan önce slaytları bir gecede oda sıcaklığında iyileştirin.Örneklerin içindeki lezyonları belirlemek için, lazer tarama konfokal mikroskobu n evresine bir slayt yerleştirin ve lezyonların görüntülerini elde etmek için tek tek hücreleri görselleştirmek için uygun bir amaç kullanın. Konfokal görüntülerdeki floresan yoğunlukları ölçmek için ImageJ'de bir görüntü açın ve lezyonun floresan sinyalini düzgün bir şekilde görselleştirmek için parlaklığı ve kontrastı ayarlayın. Çokgen seçim aracını kullanarak ilgi çekici bölge tanımlayın ve ImageJ'deki Düzenleme sekmesi altındaki YG yöneticisine YG'yi ekleyin.Edit'i, ardından Seç'i ve son olarak Yöneticiye Ekle'yi seçin. Ardından, YG'yi yeniden adlandırın ve ilgili görüntüyü etiketleyin. Merkezim belirlemek için Analiz sekmesini açın ve Alan, Ortalama Gri Değeri, Centroid ve Eşik sınırı'nı seçin.Centroid floresan yoğunluk değerini ayıklayın veya birim alan başına belirli bir lezyondaki ortalama floresan yoğunluğunu ölçün. Bu, alt ve üst floresan limitlerini gerektiği gibi ayarlamak için eşik işlevi kullanılarak elde edilebilir. Verileri bir Excel dosyasına dışa aktarın ve çevre ve çekirdek için birim alan başına ortalama floresan yoğunluğunu gösteren bir sütun hazırlayın.Çevre ve çekirdekteki birim alan başına ortalama floresan yoğunluklarını hesaplamak için, eşik alt ve üst sınırlarını el ile tanımlayın. Staphylococcus aureus thermonuclease GFP füzyon floresan, füzyon genini taşıyan hücrelerde muhabir füzyonu taşımayan hücrelere göre ortalama olarak yaklaşık dokuz kat daha yüksektir. Benzer şekilde, tandem dimeric Domates füzyon floresan yaklaşık altı kat daha yüksek null muhabir kontrolü daha.Muhabir faaliyetlerinin paterni doku homojenatları ile akış sitometrisi ile doğrulanabilir. Floresan kıvrım farklılıkları genellikle daha düşük olmasına rağmen. Floresan ölçümlerinde varyasyonlar muhabirlerin heterojen ifade nedeniyle olabilir.Örneğin, bu temsili örneklerde bazı lezyonların aynı doku örneğinde yaklaşık 100 mikrometre mesafede ki muhabirlerden birini veya her ikisini ifade ettiği gözlenmiştir. Stafilokok alçaltMa topluluklarında tek bir hücre çözünürlüğü için muhabir aktivitesi incelenmesi güçlü DAPI boyama ile sınırlanmış apselerde staphylococcus aureus thermonuclease ekspresyonunun mekansal bir düzenleme ortaya koymaktadır, muhtemelen nötrofil ekstrasellüler tuzakların oluşumu ve salınımı ile ilişkili. Örneğin, stafilokok aurenükleaz GFP füzyon floresans stafilokok abcess topluluğunun iç çekirdeğinde, çevreye lokalize göre anlamlı olarak daha yüksek staphylococcus aureus thermonuclease gözlenmektedir.Aynı abcess, tandem dimeric Domates füzyon floresan için desen ters gibi görünüyor. Ancak, bu deneydeki desen istatistiksel olarak anlamlı değildi. Bozulmamış kriyo gömülü diseksiyonlar elde floresan görüntü analizi için hayati önem taşımaktadır ve dikkatle yapılmalıdır.RNA-Seq analizi ile birleştiğinde, füzyonu farklı boyutlara kadar ifade eden alt popülasyonları yakalamak için bakteri hücrelerinin sıralanması transkripsiyondaki genom geniş değişikliklerini aydınlatabilir. Bir karsin ve doğrudan maruz kalma üzerine cilt tahrişine neden olabilir gibi formalin ile çalışırken dikkat edin. Floresan muhabirleri taşıyan suşların mutant türevleri üretmek, gözlemlenen mekansal düzenleyici desenlerin genetik temelini ortaya çıkartabilir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Retroviral Tarama: Hücreye Özel Düzenleyici Bölgeleri Tanımlamak İçin MLV Entegrasyon Konumlarının Haritalandırılması

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

En iyi kromozom Location(s) belirlenmesi için yeni bir Transposon-aracılı yaklaşımın kullanarak Escherichia coli DNA öğesinde

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Thromboxane A2 reseptör gen C924T polimorfizmi çalışmak için bir yöntem

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...