Name: synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Forfatterne takke Dr. Sai Kiran Sharma til nyttige samtaler.

1. Sammenfatning af 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Bemærk: På grund af lys-følsomhed af sammensat, holde alle reaktioner i folie-dækket fartøjer.
<ol><li>I en 10 mL rund bund kolbe, 100 mg (0.517 mmol, 1 ækvivalent) af 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol i 3 mL metanol opløses.</li>
	<li>Denne løsning, tilføje 360 μL af diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 mmol; 4 ækvivalenter; vandfri) og en lille magnetiske rør bar. Dække kolben med en gummiprop og om...

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).</li><li>Agarwal, P., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody-drug+conjugates:+the+nexus+of+bioorthogonal+chemistry,+protein+engineering,+and+drug+development.">Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+1:+Cysteine+residues+and+glycans.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+2:+Peptide+tags+and+unnatural+amino+acids.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).</li><li>Alley, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+linker+stability+to+the+activities+of+anticancer+immunoconjugates.">Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+maleimide-thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shen, B. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Jackson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+cysteine+and+site+specific+conjugated+herceptin+antibody-drug+conjugates.">In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates.</a> Plos One. 9 (1), (2014).</li><li>Ponte, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+stability+of+the+thiol-maleimide+linkage+impacts+the+pharmacokinetics+of+lysine-linked+antibody-maytansinoid+conjugates.">Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).</li><li>Stimmel, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+on+serine+-&gt;+cysteine+variant+monoclonal+antibodies.">Site-specific conjugation on serine -&gt; cysteine variant monoclonal antibodies.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+kidney+uptake+in+radiometal+labeled+peptide+linkers+conjugated+to+recombinant+antibody+fragments.+site-specific+conjugation+of+DOTA-peptides+to+a+cys-diabody.">Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).</li><li>Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+bifunctional+chelator+BAT+to+mouse+IgG(1)+Fab'+fragment.">Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).</li><li>Tinianow, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+Zr-89-labeled+monoclonal+antibodies+for+ImmunoPET.">Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET.</a> Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+monodispersed+DOTA-PEGn+to+a+thiolated+diabody+reveals+the+effect+of+increasing+PEG+size+on+kidney+clearance+and+tumor+uptake+with+improved+64-copper+PET+imaging.">Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).</li><li>Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+binding+of+disulfide-bridged+PEG-Fabs.">Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).</li><li>Koniev, O., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+and+recent+advancements+in+the+field+of+endogenous+amino+acid+selective+bond+forming+reactions+for+bioconjugation.">Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation.</a> Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).</li><li>Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+serum+stability+of+site-specific+antibody+conjugates+with+sulfone+linkers.">Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).</li><li>Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+stable,+chemoselective+labeling+of+thiols+with+Julia-Kocienski-like+reagents:+A+serum-stable+alternative+to+maleimide-based+protein+conjugation.">Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Last-step+enzymatic+F-18-fluorination+of+cysteine-tethered+RGD+peptides+using+modified+Barbas+linkers.">Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers.</a> Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).</li><li>Chiotellis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemoselective+F-18-radiolabeling+of+thiol-containing+biomolecules+under+mild+aqueous+conditions.">Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions.</a> Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).</li><li>Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+bifunctional+chelators+for+the+creation+of+site-selectively+modified+radioimmunoconjugates+with+improved+stability.">Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability.</a> Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).</li><li>Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+the+intestinal+epithelium-related+antigen+A33,+a+cell+surface+target+for+antibody-based+imaging+and+treatment+in+gastrointestinal+cancer.">Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).</li><li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+a+cytotoxic+drug+to+an+antibody+improves+the+therapeutic+index.">Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li><li>Pillow, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+trastuzumab+maytansinoid+antibody-drug+conjugates+with+improved+therapeutic+activity+through+linker+and+antibody+engineering.">Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+tumor+retention+of+a+radiohalogen+label+for+site-specific+modification+of+antibodies.">Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+drug+conjugation+on+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+of+anti-STEAP1+antibody-drug+conjugates+in+rats.">Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).</li><li>Alvarez, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+modified+111In+labelled+antibodies+give+low+liver+backgrounds+and+improved+radioimmunoscintigraphy.">Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy.</a> Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).</li><li>Strop, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+matters:+SIte+of+conjugation+modulates+stability+and+pharmacokinetics+of+antibody+drug+conjugates.">Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates.</a> Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).</li><li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugates+with+unnatural+amino+acids.">Antibody conjugates with unnatural amino acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li><li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+site-specific+antibody-drug+conjugates+using+unnatural+amino+acids.">Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodate+oxidation+of+methionine+in+proteines.">Periodate oxidation of methionine in proteines.</a> Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+methionine+oxidation+in+human+IgG1+Fc+on+serum+half-life+of+monoclonal+antibodies.">Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).</li><li>O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+labeling+immunoglobulins+by+conjugation+to+oligosaccharide+moieties.">A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties.</a> Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).</li><li>Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody+drug+conjugates+for+cancer+therapy.">Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy.</a> Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).</li><li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+HIV-1+tat+peptides+to+IgG:+a+potential+route+to+construct+radioimmunoconjugates+for+targeting+intracellular+and+nuclear+epitopes+in+cancer.">Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).</li></ol>

I denne betænkning, har vi valgt ikke at medtage nogen protokoller til radiolabeling eller in vivo forsøg. Vores grunde er ligetil. Med hensyn til tidligere radiolabeling af en BÆLG-baserede immunoconjugate adskiller sig ikke på alle fra af en immunoconjugate, der er syntetiseret ved hjælp af andre bioconjugation strategier, og disse procedurer har blevet grundigt gennemgået andetsteds2 . Hvad angår sidstnævnte, kan detaljerne i prækliniske undersøgelser in vivo forsøg (dvs. musemodelle...

Radioaktive kemikere har længe udnyttet selektivitet og specificitet af antistoffer for biomarkører af sygdom for både nukleare billeddannelse og målrettet strålebehandling1. Langt den mest almindelige metode til radiolabeling af antistoffer er baseret på den vilkårlige fastgørelse af radiolabeled proteser grupper eller radiometal chelatorer aminosyrer — oftest lysines — inden for strukturen af immunglobulin ( Figur 1A)2. Mens denne strategi er helt sikkert effektiv, kan dens tilfældige, ikke-site-specifikke karakter skabe problemer. Specifikt, traditionelle bioconjugation metoder producerer dårligt defineret og heterogene immunoconjugates består af blandinger af tusindvis af forskellige regioisomers, hver med sit eget sæt af biologiske og farmakologiske egenskaber3. Derudover kan tilfældige bioconjugation hæmme immunoreactivity af antistoffer, hvis lasten er føjet til den immunoglobulin antigen-bindende domæner.
Gennem årene er blevet udviklet en række stedspecifikke og site-selektive bioconjugation strategier for at imødegå disse problemer4,5. Den mest almindelige af disse tilgange er baseret på ligatur af maleimide-bærende sonder til sulfhydryl grupper af cysteines (figur 1B). IgG1 antistoffer naturligt indeholder 4 Inter kæde disulfidbroer, forbindelser, der selektivt kan reduceres for at give gratis dithioler kan undergå Michael tilføjelse reaktioner med maleimides at danne succinimidyl thioether obligationer. Brugen af dithioler og maleimides er helt sikkert en forbedring i forhold til traditionelle metoder, og en bred vifte af maleimide-bærende synthons og bifunctional chelatorer er tilgængelige i øjeblikket. Det er dog vigtigt at bemærke, at denne metode har alvorlige begrænsninger samt. Maleimide-baseret immunoconjugates udviser begrænset stabilitet in vivo fordi tilknytningen af thioether kan underkastes en retro-Michael reaktion (figur 2)6,7,8,9, 10. dette, selvfølgelig, kan føre til udgivelsen af det radioaktive nyttelast eller dens udveksling med thiol-bærende biomolekyler i omløb (f.eks glutathion eller serum albumin). Begge af disse processer kan øge aktivitetskoncentrationer i raske organer samt reducere aktivitetskoncentrationer i målvæv, hvilket resulterer i reducerede imaging kontrast og lavere terapeutiske nøgletal. Flere alternative thiol-reaktiv reagenser er blevet udviklet i et forsøg på at omgå disse problemer, herunder tosylates, bromo - og iodo-acetyls, og vinyl sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. men, alle disse tilgange har begrænsninger, der har hæmmet deres udbredte anvendelse.
Omkring fem år siden, banebrydende laboratoriet for den sene Carlos Barbas III på Scripps Research Institute brug af phenyloxadiazolyl methyl sulfones som reagenser for selektiv dannelsen af meget stabile forbindelser med dithioler (figur 1 c og figur 3) 18 , 19. forfatterne ansat en phenyloxadiazolyl methyl sulfon-bærende variant af fluorescein at ændre flere antistoffer manipuleret til at indeholde restkoncentrationer, gratis cystein, i sidste ende producerer immunoconjugates med højere stabilitet end analoge konstruktioner oprettet ved hjælp af maleimide-baseret sonder. Ved at se denne lovende arbejde, var vi noget overrasket over, at denne teknologi havde kun været brugt næppe i radiokemi og havde endnu ikke blevet brugt på alle i syntesen af bifunctional chelatorer eller radioimmunoconjugates20,21 . Denne mangel på ansøgninger, men snart begyndte at være mere fornuftigt: flere forsøg på at skaffe reagenset fra Sigma Aldrich resulterede i modtagelsen af komplekse blandinger af nedbrydningsprodukter med < 15% af den ønskede sammensatte. Derudover syntetisere den rapporterede reagens os heller ikke var en realistisk mulighed, som de offentliggjorte syntesevejen er lidt besværlig og kræver avanceret organisk kemi udstyr som de fleste radiokemi og molekylær billeddannelse laboratorier-herunder vores — simpelthen ikke besidder.
Svar på disse hindringer satte vi sig for at skabe en let tilgængelig og meget stabil phenyloxadiazolyl methyl sulfon reagens, der kan opnås via en robust og rimelig facile syntesevejen. Tidligere i år, rapporterede vi oprettelsen af et modulopbygget, stabil og let tilgængeligt phenyloxadiazolyl methyl sulfon reagens — døbt «BÆLG» — som en platform for thiol-baserede bioconjugations (figur 1 c og figur 3)22. Den vigtigste forskel mellem BÆLG og reagens rapporteret af Barbas, et al. er, at førstnævnte beskæftiger en anilin ring fastgjort til phenyloxadiazolyl methyl sulfon gruppe, mens sidstnævnte har en fenol i den samme position (figur 4). Denne ændring muliggør en mere enkel og tilgængelig syntesevejen samt — hvis vores erfaring med den kommercielt tilgængelige sammensatte er symbolske — en mere stabil endelige reagens. I dette arbejde, vi også syntetiseres et par BÆLG-bærende bifunctional chelatorer — BÆLG-DFO og BÆLG-CHX-A''-DTPA — at lette oprettelsen af 89Zr- og 177Lu-mærket radioimmunoconjugates, henholdsvis. Vi vil diskutere, har vi bevist, at BÆLG-baseret websted-selektive bioconjugations reproducerbar og håndfast oprette homogen, veldefinerede, meget immunoreaktive og meget stabil radioimmunoconjugates. Derudover har prækliniske forsøg i murine modeller af kolorektal cancer vist at disse site-selektivt mærket radioimmunoconjugates udstille overlegen in vivo ydeevne i forhold til radiolabeled antistoffer syntetiseres via maleimide-baserede Bøjning af udsagnsord.
Det overordnede mål for dette arbejde er at lette oprettelsen af veldefinerede, homogen, meget stabilt og højt immunoreaktive immunoconjugates til in vitro- og in vivo applikationer. Den syntetiske metode er enkel nok skal udføres i næsten ethvert laboratorium, og den overordnede BÆLG reagens kan ændres med et væld af forskellige chelatorer, fluorophores eller last. I denne protokol og den ledsagende video, vil vi beskrive den enkle, fire-trins syntese af BÆLG (figur 5); oprettelsen af en BÆLG-bærende variant af DOTA, en meget udbredt chelator for koordinering af 64Cu, 68Ga, 111i 177Lu og 225Ac (figur 6); og bioconjugation af BÆLG-DOTA til en model antistof, HER2-targeting IgG1 trastuzumab (figur 7).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>925000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EN300000141G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C556-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC383780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diisopropylethylamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>150915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-727-5100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E145 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413485000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-chloroperbenzoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>273031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBoc-N&#8242;-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>671401</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#8242;- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10&#215; Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates

Maleimide-bærende bifunctional sonder har været ansat i årtier for site-selektiv ændring af dithioler i biomolekyler, især antistoffer. Endnu vise maleimide-baserede konjugater begrænset stabilitet in vivo fordi succinimidyl thioether kobling kan undergå en retro-Michael reaktion. Dette, selvfølgelig, kan føre til udgivelsen af det radioaktive nyttelast eller dens udveksling med thiol-bærende biomolekyler i omløb. Begge af disse processer kan producere forhøjede aktivitetskoncentrationer i raske organer samt faldt aktivitetskoncentrationer i målvæv, hvilket resulterer i reducerede imaging kontrast og lavere terapeutiske nøgletal. I 2018, rapporterede vi oprettelsen af et modulopbygget, stabil og let tilgængeligt phenyloxadiazolyl methyl sulfon reagens — døbt «BÆLG» — som en platform for thiol-baseret bioconjugations. Vi har klart vist, at BÆLG-baseret websted-selektive bioconjugations reproducerbar og håndfast oprette homogen, veldefinerede, meget immunoreaktive og meget stabil radioimmunoconjugates. Derudover har prækliniske forsøg i murine modeller af kolorektal cancer vist at disse site-selektivt mærket radioimmunoconjugates udstille langt overlegen in vivo ydeevne i forhold til radiolabeled antistoffer syntetiseres via maleimide-baserede Bøjning af udsagnsord. I denne protokol, vil vi beskrive fire-trins syntesen af BÆLG, oprettelsen af en bifunctional BÆLG-bærende variant af den allestedsnærværende chelator DOTA (BÆLG-DOTA) og konjugation af BÆLG-DOTA til målretning af HER2 antistof trastuzumab.

De første fire trin i denne protokol-syntesen af BÆLG — har været designet til at være robust og pålidelig. Deprotonation og substitution af 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol til at danne det ønskede thioether produkt frembyder thioether i > 99% udbytte efter blot 45 minutter. Næste, ligatur mellem 1 og N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine blev opnået via en standard peptid kobling procedure, hvilket resulterer i samlingen af vare (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Syntese og Bioconjugation af Thiol-reaktiv reagenser til oprettelse af hjemmeside-selektivt modificerede Immunoconjugates

I denne protokol, vil vi beskrive syntesen af BÆLG, en phenyoxadiazolyl methyl sulfon-baserede reagens for cargos websted-selektiv tillægger dithioler af biomolekyler, især antistoffer. Derudover vil vi beskrive syntesen og karakterisering af en BÆLG-bærende bifunctional chelator og dets konjugering til en model antistof.

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Denne protokol beskriver syntesen og anvendelsen af PODS, et nyt reagens til stedsspecifik biokonjugation af proteiner og peptider. Denne teknologi repræsenterer en markant forbedring i forhold til traditionelle maleimide-thiol-baserede biokonjugationer. Den største fordel ved denne procedure er den enkelhed, hvormed reagenset er lavet.Metoden gør det muligt at syntetisere reagenset i stort set ethvert laboratorium. I en 10-milliliter rundbundet kolbe opløses 100 mg aminophenyloxadiazol thiol i tre milliliter methanol. Til opløsningen tilsættes 360 mikroliter diisopropylethylamin og en magnetisk rørebar.Kolben forsegles med en gummiprop, og opløsningen omrøres i 10 minutter ved stuetemperatur. Ved hjælp af en en-milliliter glas sprøjte, stikke et hul gennem gummi prop og hurtigt tilføje 32 mikroliter af iodomethan til blandingen. Lad blandingen reagere i 45 minutter ved stuetemperatur.I en 25-milliliter rundbundet kolbe opløses 387 mg boc-beskyttet carboxylsyre i 10 milliliter dichlormethan. Til opløsningen, tilsæt 480 mikroliter af diisopropylethylamin, 264 milligram EDCI, 200 milligram af anilinen, og en magnetisk røre bar. Kolben forsegles med en glasprop, og reaktionen omrøres i fem dage ved stuetemperatur.Når reaktionen er færdig, overføres reaktionsblandingen til en separattragt, og der vaskes tre gange med fem milliliter en molarchlorsyre. Indsamle den organiske fase og overføre den til separatory tragt. Derefter vaskes den organiske fase med en-molar natriumcarbonat efterfulgt af vand.Dernæst indsamle den organiske fase og tilsæt magnesiumsulfat for at fjerne eventuelle spor af vand. Derefter filtreres blandingen ved hjælp af en medium glas frit. Ved hjælp af en roterende fordamper fjernes de flygtige opløsningsmidler under reduceret tryk for at give et off-white fast stof.Herefter genså det isolerede fast stof i 10 milliliter ethylacetat. Derefter udfældes produktet ved gradvis tilsætning af 30 milliliter cyclohexan. Opløsningen filtreres ved hjælp af en medium glas frit for at opnå carbamate produktet som et hvidt pulver.I en 10-milliliter rundbundet kolbe opløses 30 mg carbamat i fire milliliter dichlormethan. Langsomt tilsættes 49 mg 70% m-chloroperbenzoic syre og en magnetisk røre bar til blandingen, og forsegle kolben med et glas prop. Rør opløsningen natten over ved stuetemperatur, i sidste ende giver en gul blanding.Den følgende dag overføres blandingen til en separattragt. Derefter vaskes blandingen med 0,1-molar natriumhydroxid efterfulgt af vand. Opsaml den organiske fase og tilsæt magnesiumsulfat for at fjerne eventuelle spor af vand.Derefter filtreres blandingen ved hjælp af en medium glas frit. I en 25-milliliter rundbundet kolbe opløses 30 mg carbamat i to milliliter dichlormethan. Tilføj en magnetisk røre bar til blandingen.Og 400 mikroliter trifluoretsyre og forsegle kolben med en glasprop. Rør derefter reaktionsblandingen ved stuetemperatur i tre timer. Når reaktionen er færdig, fjernes flygtige stofferne under nedsat tryk ved stuetemperatur ved hjælp af en roterende fordamper for at opnå en olieagtig rest.Opløs de olieolikest i syv milliliter vand. Og overfør til en separattragt. Den vandige opløsning vaskes tre gange med fire milliliter ethylacetat.I et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør opløses 10 mg PODS og 300 mikroliter dimethylsulfoxid. Derefter tilsættes 26 mikroliter N, N-diisopropylethylamin til opløsningen. 15,2 mg DOTA NCS opløses i 100 mikroliter dimethylsulfoxid, og opløsningen med PODS-opløsningen.Forsegl mikrocentrifugerøret, og lad reaktionen inkubere natten over ved stuetemperatur. Dernæst fortyndes 61 mikroliter af en trastuzumab stamopløsning med 859 mikroliter PBS i et lavproteinbindende 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Til denne blanding tilsættes 6,7 mikroliter af en frisklavet 10-millimolar opløsning af TCEP i vand.Der tilsættes 73 mikroliter af en pods-dotaopløsning på en milligram per milliliter til reaktionsblandingen. Endelig forsegles mikrocentrifugerøret og inkuberes opløsningen i to timer ved stuetemperatur. PODS-syntesen er robust og pålidelig.Deproteinering og substitution af aminophenyl oxadiazol thiol gav did en i kvantitativt udbytte. Ligation af did en og boc-beskyttet carboxylsyre gav sammensatte to i 55%udbytte. Oxidation gav sammensatte tre i 90%udbytte.Og fjernelse af bocs-beskyttende gruppe gav PODS i 98% udbytte. Identiteten af hvert produkt blev bekræftet via proton NMR, carbon NMR og højopløsnings-MS. En isothiocyanatbærende variant af chelatoren DOTA blev koblet til pods- pendelmin for at opnå den bifunktionelle chelator i 75%-udbytte. Produktets identitet blev bekræftet via proton NMR, carbon NMR og højopløsnings-MS. Site-selektiv bioconjugation af PODS-DOTA til HER2-målretning antistof trastuzumab er vist her.De disulfid-forbindelser i antistoffets hængselregion blev selektivt reduceret, og antistoffet blev derefter inkuberet med PODS-DOTA for at give den DOTA-bærende immunkonjuger et udbytte på 80 %. MALDI-TOF-analyse afslørede en vis mærkning på 1,8 DOTA pr. antistof. Som forbliver konsekvent på tværs af en række menneskelige, humaniserede, og kimære IgG1 antistoffer.Men de samme betingelser producerer immunkonjugater med en grad af mærkning på 1,5 for murine IgG1 antistoffer. På grund af lysfølsomhed af dette stof, er det vigtigt at holde alle reaktioner i folie-dækket fartøjer. Dette vil øge det samlede udbytte af produktet.Mens denne protokol beskriver syntesen af PODS-DOTA, en lignende procedure kan anvendes på en bred vifte af potentielle laster, herunder fluorophores, toksiner, og andre kelatorer. Denne metode vil lette konstruktionen af veldefinerede, homogene og meget stabile immunkonjuger, der kan anvendes på en lang række områder. Det er vigtigt at huske, at iodomethan tilføjet i trin et af dette eksperiment kan have skadelige virkninger, og bør derfor anvendes i en røghætte.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Syntese af hypervalente iodonium Alkynyl Triflater om anvendelse af Generering Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Split-og pool Syntese og karakterisering af peptid tertiær amid Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Den Bioconjugation og Radiosynthesis af<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-mærkede antistoffer

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protokol til syntese af<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated anilinderivater

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering af supramolekylære Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-1 som en heterogen katalysator til syntese af vanillin

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese af Protein biokonjugater<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Kemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntese af ormelignende Miceller af synligt lys Mediated Dispersion polymerisering Brug Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse af Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Kemisk udfældning metode til syntese af Nb2O5 ændret Bulk nikkel katalysatorer med høje specifikke overfladeareal

We demonstrate a method for the synthesis of NixNb1-xO catalysts with sponge-like and fold-like nanostructures. By varying the Nb:Ni ratio, a series of ...