Name: synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

De auteurs bedanken Dr. Sai Kiran Sharma voor nuttig gesprekken.

1. de synthese van 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Opmerking: Als gevolg van de licht-gevoeligheid van de compound, houden alle reacties in folie bedekte vaartuigen.
<ol><li>In een 10 mL ronde onderkant kolf, los 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalent) van 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol in 3 mL methanol.</li>
	<li>Voeg aan deze oplossing, 360 l diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 equivalenten; watervrij) en een kleine magnetische roer bar. Bedek de kolf met e...

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).</li><li>Agarwal, P., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody-drug+conjugates:+the+nexus+of+bioorthogonal+chemistry,+protein+engineering,+and+drug+development.">Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+1:+Cysteine+residues+and+glycans.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+2:+Peptide+tags+and+unnatural+amino+acids.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).</li><li>Alley, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+linker+stability+to+the+activities+of+anticancer+immunoconjugates.">Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+maleimide-thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shen, B. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Jackson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+cysteine+and+site+specific+conjugated+herceptin+antibody-drug+conjugates.">In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates.</a> Plos One. 9 (1), (2014).</li><li>Ponte, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+stability+of+the+thiol-maleimide+linkage+impacts+the+pharmacokinetics+of+lysine-linked+antibody-maytansinoid+conjugates.">Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).</li><li>Stimmel, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+on+serine+-&gt;+cysteine+variant+monoclonal+antibodies.">Site-specific conjugation on serine -&gt; cysteine variant monoclonal antibodies.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+kidney+uptake+in+radiometal+labeled+peptide+linkers+conjugated+to+recombinant+antibody+fragments.+site-specific+conjugation+of+DOTA-peptides+to+a+cys-diabody.">Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).</li><li>Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+bifunctional+chelator+BAT+to+mouse+IgG(1)+Fab'+fragment.">Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).</li><li>Tinianow, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+Zr-89-labeled+monoclonal+antibodies+for+ImmunoPET.">Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET.</a> Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+monodispersed+DOTA-PEGn+to+a+thiolated+diabody+reveals+the+effect+of+increasing+PEG+size+on+kidney+clearance+and+tumor+uptake+with+improved+64-copper+PET+imaging.">Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).</li><li>Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+binding+of+disulfide-bridged+PEG-Fabs.">Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).</li><li>Koniev, O., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+and+recent+advancements+in+the+field+of+endogenous+amino+acid+selective+bond+forming+reactions+for+bioconjugation.">Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation.</a> Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).</li><li>Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+serum+stability+of+site-specific+antibody+conjugates+with+sulfone+linkers.">Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).</li><li>Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+stable,+chemoselective+labeling+of+thiols+with+Julia-Kocienski-like+reagents:+A+serum-stable+alternative+to+maleimide-based+protein+conjugation.">Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Last-step+enzymatic+F-18-fluorination+of+cysteine-tethered+RGD+peptides+using+modified+Barbas+linkers.">Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers.</a> Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).</li><li>Chiotellis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemoselective+F-18-radiolabeling+of+thiol-containing+biomolecules+under+mild+aqueous+conditions.">Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions.</a> Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).</li><li>Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+bifunctional+chelators+for+the+creation+of+site-selectively+modified+radioimmunoconjugates+with+improved+stability.">Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability.</a> Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).</li><li>Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+the+intestinal+epithelium-related+antigen+A33,+a+cell+surface+target+for+antibody-based+imaging+and+treatment+in+gastrointestinal+cancer.">Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).</li><li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+a+cytotoxic+drug+to+an+antibody+improves+the+therapeutic+index.">Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li><li>Pillow, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+trastuzumab+maytansinoid+antibody-drug+conjugates+with+improved+therapeutic+activity+through+linker+and+antibody+engineering.">Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+tumor+retention+of+a+radiohalogen+label+for+site-specific+modification+of+antibodies.">Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+drug+conjugation+on+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+of+anti-STEAP1+antibody-drug+conjugates+in+rats.">Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).</li><li>Alvarez, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+modified+111In+labelled+antibodies+give+low+liver+backgrounds+and+improved+radioimmunoscintigraphy.">Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy.</a> Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).</li><li>Strop, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+matters:+SIte+of+conjugation+modulates+stability+and+pharmacokinetics+of+antibody+drug+conjugates.">Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates.</a> Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).</li><li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugates+with+unnatural+amino+acids.">Antibody conjugates with unnatural amino acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li><li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+site-specific+antibody-drug+conjugates+using+unnatural+amino+acids.">Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodate+oxidation+of+methionine+in+proteines.">Periodate oxidation of methionine in proteines.</a> Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+methionine+oxidation+in+human+IgG1+Fc+on+serum+half-life+of+monoclonal+antibodies.">Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).</li><li>O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+labeling+immunoglobulins+by+conjugation+to+oligosaccharide+moieties.">A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties.</a> Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).</li><li>Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody+drug+conjugates+for+cancer+therapy.">Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy.</a> Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).</li><li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+HIV-1+tat+peptides+to+IgG:+a+potential+route+to+construct+radioimmunoconjugates+for+targeting+intracellular+and+nuclear+epitopes+in+cancer.">Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).</li></ol>

In dit verslag, hebben wij besloten niet op te nemen van de eventuele protocollen voor radiolabeling of in vivo experimenten. Onze redenen zijn eenvoudig. Met betrekking tot de voormalige, de radiolabeling van een immunoconjugate peulen gebaseerde verschilt niet helemaal van die van een immunoconjugate gesynthetiseerd met behulp van andere strategieën van bioconjugation, en deze procedures hebben uitvoerig herzien elders2 . Met betrekking tot de laatste, kunnen de specifieke kenmerken van preklin...

Radiofarmaceutische chemici hebben lang benut de selectiviteit en de specificiteit van antilichamen voor biomarkers voor ziekte voor zowel nucleaire beeldvorming en radiotherapie1gericht. Verreweg de meest voorkomende benadering van de radiolabeling van antilichamen is gebaseerd op de blinde bevestiging van radiolabeled prosthetic groepen of radiometal chelaatvormers aan aminozuren — meestal lysines — binnen de structuur van de immunoglobuline ( Figuur 1A)2. Terwijl deze strategie zeker effectief is, kan het willekeurige, niet-site-specifieke karakter leiden tot problemen. Specifiek, traditionele bioconjugation benaderingen produceren slecht gedefinieerde en heterogene immunoconjugates samengesteld uit mengsels van duizenden verschillende regioisomers, elk met een eigen set van biologische en farmacologische eigenschappen3. Bovendien kan willekeurige bioconjugation de immunoreactivity van antilichamen belemmeren, als de lading wordt toegevoegd aan de immunoglobuline van antigeen-bindende domeinen.
Door de jaren heen, een verscheidenheid van site-specific en site-selectieve bioconjugation strategieën werden ontwikkeld om deze problemen4,5. De meest voorkomende van deze benaderingen is afhankelijk van de afbinding van maleimide-bevattende sondes aan de sulfaatzuurstof groepen van cysteines (figuur 1B). IgG1 antilichamen van nature bevatten 4 Inter keten disulfide bruggen, verbanden die kunnen worden selectief verminderd rendement gratis thiolen staat voor het ondergaan van Michael toevoeging reacties met maleimides te succinimidyl thioether obligaties vormen. Het gebruik van thiolen en maleimides is zeker een verbetering ten opzichte van traditionele methoden, en een breed scala aan maleimide-bevattende synthons en bifunctionele chelaatvormers momenteel beschikbaar zijn. Het is echter belangrijk op te merken dat deze methode ernstige beperkingen zo goed heeft. Maleimide gebaseerde immunoconjugates vertonen beperkte stabiliteit in vivo omdat de koppeling van de thioether kan het ondergaan van een retro-Michael reactie (Figuur 2)6,7,8,9, 10. dit, natuurlijk, kan leiden tot het vrijgeven van de radioactieve lading of de uitwisseling met thiol-bevattende biomoleculen in omloop (bijvoorbeeld glutathion of serum albumine). Beide processen kunnen verhogen activiteit concentraties in gezonde organen evenals activiteit concentraties in target weefsel, wat resulteert in verminderde imaging contrast en lagere therapeutische verhoudingsgetallen verlagen. Verschillende alternatieve thiol-reactieve reagentia zijn ontwikkeld in een poging om het omzeilen van deze kwesties, met inbegrip van tosylates, bromo - en jood-acetyls, en vinyl sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. echter, al deze benaderingen hebben beperkingen die hun wijdverbreide toepassing hebben gehinderd.
Ongeveer vijf jaar geleden, pionier het laboratorium van de late Carlos Barbas III at The Scripps Research Institute het gebruik van phenyloxadiazolyl methyl sulfones als reagentia voor de selectieve vorming van zeer stabiele verbanden met thiolen (Figuur 1 c en figuur 3) 18 , 19. de auteurs werkzaam een phenyloxadiazolyl methyl-sulfon dragende variant van fluoresceïne wijzigen van verschillende antilichamen ontworpen om vrije cysteïne residuen, uiteindelijk het produceren van immunoconjugates met hogere stabiliteit dan analoog constructies gemaakt met behulp van de maleimide gebaseerde sondes. Bij het zien van dit veelbelovende werk, waren we enigszins verrast dat deze technologie alleen nauwelijks in de radiochemie gebruikt was en nog al helemaal niet in de synthese van bifunctionele chelaatvormers of radioimmunoconjugaten20,21 gebruikt had . Dit gebrek aan toepassingen, maar al snel begon te meer zin te maken: verschillende pogingen tot aanschaf van de reagens van Sigma-Aldrich resulteerde in de ontvangst van complexe mengsels van afbraakproducten daarvan met < 15% van de gewenste stof. Bovendien, synthese van het gerapporteerde reagens onszelf was niet een realistische optie hetzij, als de gepubliceerde synthetische route enigszins omslachtig is en verfijnde organische chemie apparatuur vereist dat de meeste radio-chemie en moleculaire beeldvorming laboratoria — met inbegrip van onze — gewoon doen niet bezitten.
In reactie op deze belemmeringen zetten we uit te maken van een gemakkelijk toegankelijk en zeer stabiele phenyloxadiazolyl-methyl-sulfon reagens dat kan worden verkregen via een robuust en redelijk facile synthetische route. Eerder dit jaar, berichtten we de oprichting van een modulair, stabiel en gemakkelijk toegankelijk phenyloxadiazolyl methyl-sulfon reagens — genaamd 'Peulen' — als een platform voor thiol gebaseerde bioconjugations (Figuur 1 c en figuur 3)22. Het belangrijkste verschil tussen peulen en het reagens gerapporteerd door Barbas, et al. is dat de voormalige maakt gebruik van een aniline ring gehecht aan de phenyloxadiazolyl-methyl-sulfon groep, terwijl de laatste beschikt over een fenol in dezelfde positie (Figuur 4). Deze wijziging vereenvoudigt een meer eenvoudige en toegankelijke synthetische route, evenals — als onze ervaring met de verkrijgbare compound emblematisch is — een stabieler definitieve reagens. In dit werk, we ook een paar peulen dragende bifunctionele chelaatvormers gesynthetiseerd — PODS-DFO en peulen-CHX-A''-DTPA — ter vergemakkelijking van de oprichting van 89Zr- en 177Lu-label radioimmunoconjugaten, respectievelijk. Zoals we bespreken zullen, hebben we aangetoond dat site-selectieve bioconjugations peulen gebaseerde reproducibly en krachtig homogene, duidelijk omschreven, zeer immunoreactive en zeer stabiele radioimmunoconjugaten maken. Bovendien hebben preklinische experimenten in lymfkliertest modellen van colorectal kanker aangetoond dat deze site-selectief met het label radioimmunoconjugaten tentoonstelling superieur in vivo prestaties in vergelijking met radiolabeled antilichamen gesynthetiseerd via maleimide gebaseerde vervoegingen.
Het overkoepelende doel van dit werk is het maken van duidelijke, homogene, zeer stabiele en zeer immunoreactive immunoconjugates voor in vitro en in vivo toepassingen vereenvoudigen. De synthetische benadering is eenvoudig genoeg om te worden uitgevoerd in bijna elk laboratorium, en de bovenliggende PODS-reagens kan worden aangepast met een overvloed aan verschillende chelaatvormers, fluorophores of lading. In dit protocol en de begeleidende video beschrijven we de eenvoudige, vier-stappen synthese van peulen (Figuur 5); de oprichting van een variant van de peulen-invloed van DOTA, een veel gebruikte complexvormer voor de coördinatie van 64Cu, 68Ga 111In, 177Lu en 225Ac (Figuur 6); en de bioconjugation van PODS-DOTA aan een model antilichaam, de HER2-targeting IgG1-trastuzumab (Figuur 7).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>925000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EN300000141G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C556-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC383780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diisopropylethylamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>150915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-727-5100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E145 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413485000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-chloroperbenzoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>273031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBoc-N&#8242;-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>671401</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#8242;- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10&#215; Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates

Maleimide-bevattende bifunctionele sondes zijn tewerkgesteld voor decennia voor de site-selectieve wijziging van thiolen in biomoleculen, vooral antilichamen. Maleimide gebaseerde geconjugeerde weergeven nog beperkte stabiliteit in vivo omdat de koppeling van de thioether succinimidyl een retro-Michael reactie kan ondergaan. Dit, natuurlijk, kan leiden tot het vrijgeven van de radioactieve lading of de uitwisseling met thiol-bevattende biomoleculen in omloop. Beide processen kunnen produceren verhoogde activiteit concentraties in gezonde organen evenals activiteit concentraties in target weefsel, wat resulteert in verminderde imaging contrast en lagere therapeutische ratio daalde. In 2018, meldden we de oprichting van een modulair, stabiel en gemakkelijk toegankelijk phenyloxadiazolyl methyl-sulfon reagens — genaamd 'Peulen' — als een platform voor thiol gebaseerde bioconjugations. We hebben duidelijk aangetoond dat site-selectieve bioconjugations peulen gebaseerde reproducibly en krachtig homogene, duidelijk omschreven, zeer immunoreactive en zeer stabiele radioimmunoconjugaten maken. Bovendien hebben preklinische experimenten in lymfkliertest modellen van colorectal kanker aangetoond dat deze site-selectief met het label radioimmunoconjugaten tentoonstelling veruit superieur in vivo prestaties in vergelijking met radiolabeled antilichamen gesynthetiseerd via maleimide gebaseerde vervoegingen. In dit protocol beschrijven we de synthese van de vier stappen van PODS, de oprichting van een bifunctionele peulen dragende variant van de alomtegenwoordige complexvormer DOTA (PODS-DOTA), en de vervoeging van PODS-DOTA aan de HER2-targeting antilichaam trastuzumab.

De eerste vier fasen van dit protocol — de synthese van PODS — zijn ontworpen om robuust en betrouwbaar. De deprotonering en vervanging van 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol om te vormen van de gewenste thioether-product biedt de thioether in > 99% rendement na slechts 45 minuten. Vervolgens werd de afbinding tussen 1 en N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine bereikt via een standaard peptide koppeling procedure, wat resulteert in de collectie ...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Synthese en Bioconjugation van Thiol-reactieve reagentia voor de oprichting van Site-selectief bewerkt Immunoconjugates

In dit protocol beschrijven we de synthese van PODS, een phenyoxadiazolyl methyl-sulfon gebaseerde reagens voor de site-selectieve bevestiging van cargos aan de thiolen van biomoleculen, met name antilichamen. Daarnaast beschrijven we de synthese en de karakterisering van een Peul-bevattende bifunctionele complexvormer en zijn geconjugeerde aan een model antilichaam.

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Dit protocol beschrijft de synthese en toepassing van PODS, een nieuw reagens voor de locatiespecifieke bioconjugatie van eiwitten en peptiden. Deze technologie is een duidelijke verbetering ten opzichte van traditionele maleimide-thiol-gebaseerde bioconjugations. Het grootste voordeel van deze procedure is de eenvoud waarmee het reagens wordt gemaakt.De methode maakt het mogelijk het reagens te synthetiseerd in vrijwel elk laboratorium. Los in een kolf van 10 milliliter ronde bodem 100 milligram van de aminophenyloxadiazool thiol op in drie milliliter methanol. Voeg aan de oplossing 360 microliters diisopropylethylamine en een magnetische roerstang toe.Sluit de kolf af met een rubberen stop en roer de oplossing gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Met behulp van een glazen spuit van één milliliter, steek een gat door de rubberen stop en voeg snel 32 microliter iodomethaan toe aan het mengsel. Laat het mengsel 45 minuten reageren bij kamertemperatuur.Los in een kolf van 25 milliliter ronde bodem 387 milligram van het door boc beschermde carboxylzuur op in 10 milliliter dichloormethaan. Voeg aan de oplossing 480 microliter diisopropylethylamine, 264 milligram EDCI, 200 milligram aniline en een magnetische roerstaaf toe. Verzegel de kolf met een glazen stop en laat de reactie vijf dagen roeren bij kamertemperatuur.Zodra de reactie is voltooid, breng het reactiemengsel over op een separatoire trechter en was drie keer met vijf milliliter zoutzuur van één mol. Verzamel de organische fase en breng deze over naar de separatory funnel. Was vervolgens de organische fase met een-molaire natriumcarbonaat, gevolgd door water.Verzamel vervolgens de organische fase en voeg magnesiumsulfaat toe om eventuele sporen van water te verwijderen. Vervolgens filter het mengsel met behulp van een medium glas frit. Verwijder met behulp van een roterende verdamper de vluchtige oplosmiddelen onder verminderde druk om een off-white vaste stof te betalen.Daarna redissolve de geïsoleerde vaste stof in 10 milliliter ethylacetaat. Dan neerslaan het product via de geleidelijke toevoeging van 30 milliliter cyclohexaan. Filter de oplossing met behulp van een medium glazen frit om het carbamaatproduct als wit poeder te verkrijgen.Los in een kolf van 10 milliliter ronde bodem 30 milligram carbamaat op in vier milliliter dichloormethaan. Voeg langzaam 49 milligram van 70%m-chloroperbenzoëzuur en een magnetische roerstaaf toe aan het mengsel en sluit de kolf af met een glazen stop. Roer de oplossing 's nachts bij kamertemperatuur, uiteindelijk levert een geel mengsel.Breng het mengsel de volgende dag over naar een separatory trechter. Was vervolgens het mengsel met 0,1-molaire natriumhydroxide, gevolgd door water. Verzamel de organische fase en voeg magnesiumsulfaat toe om eventuele sporen van water te verwijderen.Vervolgens filter het mengsel met behulp van een medium glas frit. Los in een kolf van 25 milliliter ronde bodem 30 milligram carbamaat op in twee milliliter dichloormethaan. Voeg een magnetische roerstaaf toe aan het mengsel.En 400 microliters trifluoroacetisch zuur en verzegelen de kolf met een glazen stop. Roer vervolgens het reactiemengsel drie uur op kamertemperatuur. Zodra de reactie is voltooid, verwijder de vluchtige stoffen onder verminderde druk bij kamertemperatuur met behulp van een roterende verdamper om een olieachtige residu te verkrijgen.Los het olieachtige residu op in zeven milliliter water. En over te dragen aan een separatory trechter. Was de waterige oplossing drie keer met vier milliliter ethylacetaat.Los in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter 10 milligram PODS en 300 microliter dimethylsulfoxide op. Voeg vervolgens 26 microliter N, N-diisopropylethylamine toe aan de oplossing. Los 15,2 milligram DOTA NCS op in 100 microliter dimethylsulfoxide en combineer de oplossing met de PODS-oplossing.Verzegel de microcentrifugebuis en laat de reactie 's nachts uitbroeden bij kamertemperatuur. Vervolgens verdun 61 microliter van een trastuzumab-voorraadoplossing met 859 microliter PBS in een eiwitarme microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg aan dit mengsel 6,7 microliter van een vers gemaakte 10-millimolaroplossing van TCEP in water toe.Voeg 73 microliter van een 1-milligram-per-milliliter PODS-DOTA-oplossing toe aan het reactiemengsel. Sluit ten slotte de microcentrifugebuis af en broed de oplossing twee uur bij kamertemperatuur. De PODS synthese is robuust en betrouwbaar.Deproteination en substitutie van de aminofenyl oxadiazole thiol bood thioether een in kwantitatieve opbrengst. Ligatie van thioether een en de boc-beschermde carboxylzuur leverde samengestelde twee in 55%opbrengst. Oxidatie bood samengestelde drie op 90%-opbrengst.En verwijdering van de bocs-beschermende groep leverde PODS op in een rendement van 98%. De identiteit van elk product werd bevestigd via proton NMR, carbon NMR en hoge resolutie MS. Een isothiocyanaat-dragende variant van de chelator DOTA werd gekoppeld aan de hanger amine van PODS om de tweefunctionele chelator in 75% opbrengst te verkrijgen. De identiteit van het product werd bevestigd via proton NMR, carbon NMR en hoge resolutie MS. Site-selectieve bioconjugatie van PODS-DOTA aan de HER2-targeting antilichaam trastuzumab wordt hier getoond.De disulfide koppelingen van het scharniergebied van het antilichaam werden selectief verminderd, en het antilichaam werd vervolgens geïncubeerd met PODS-DOTA om de DOTA-dragende immunoconjucatie een opbrengst van 80% te veroorloven. MALDI-TOF analyse toonde een zekere mate van etikettering van 1,8 DOTA per antilichaam. Die consistent blijft in een reeks van menselijke, gehumaniseerde en chimeric IgG1 antilichamen.Dezelfde voorwaarden produceren echter immunoconjugaaten met een mate van etikettering van 1,5 voor murine IgG1-antilichamen. Vanwege de lichtgevoeligheid van deze verbinding is het belangrijk om alle reacties in met folie bedekte vaten te houden. Dit verhoogt de totale opbrengst van het product.Hoewel dit protocol de synthese van PODS-DOTA beschrijft, kan een soortgelijke procedure worden toegepast op een breed scala aan potentiële ladingen, waaronder fluoroforen, toxines en andere chelators. Deze methode zal de bouw vergemakkelijken van goed gedefinieerde, homogene en zeer stabiele immunoconjugates die in een breed scala aan gebieden kunnen worden gebruikt. Het is belangrijk om te onthouden dat de iodomethaan toegevoegd in stap een van dit experiment kan schadelijke effecten hebben, en moet daarom worden gebruikt in een rookkap.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Synthese van Hypervalente jodonium Alkynyl triflaten voor de toepassing van genereren Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Split-en-zwembad Synthese en karakterisatie van peptide Tertiaire amide Bibliotheek

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

De bioconjugatie en radiosynthese van<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-gemerkte antilichamen

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol voor de synthese van<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated anilinederivaten

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Synthese en karakterisering van Supramoleculaire colloïden

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-1 als heterogene katalysator voor de synthese van vanilline

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Eiwitsynthese Bioconjugaten<em&gt; via</em&gt; Cysteïne-maleïmide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthese van Worm-micellen door het zichtbare licht Mediated Dispersion polymerisatie onder toepassing van Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Synthese en analyse van de Spectrometrie van de massa van Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Chemische neerslag methode voor de synthese van Nb2O5 bewerkt Bulk nikkel katalysatoren met hoge specifieke oppervlakte

We demonstrate a method for the synthesis of NixNb1-xO catalysts with sponge-like and fold-like nanostructures. By varying the Nb:Ni ratio, a series of ...