Name: synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Sai Kiran Sharma für hilfreiche Gespräche.

(1) die Synthese von 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Hinweis: Aufgrund der Lichtempfindlichkeit der Verbindung, halten Sie alle Reaktionen in Gefäßen mit Folie abgedeckt.
<ol><li>In einer 10 mL Runde untere Kolben, 100 mg (0.517 Mmol, 1 Äquivalent) 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol in 3 mL Methanol auflösen.</li>
	<li>Diese Projektmappe hinzufügen 360 μL der Diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 Mmol; 4 Entsprechungen; wasserfrei) und eine kleine magnetische S...

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).</li><li>Agarwal, P., Bertozzi, C. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+on+serine+-&gt;+cysteine+variant+monoclonal+antibodies.">Site-specific conjugation on serine -&gt; cysteine variant monoclonal antibodies.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+kidney+uptake+in+radiometal+labeled+peptide+linkers+conjugated+to+recombinant+antibody+fragments.+site-specific+conjugation+of+DOTA-peptides+to+a+cys-diabody.">Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).</li><li>Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+bifunctional+chelator+BAT+to+mouse+IgG(1)+Fab'+fragment.">Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).</li><li>Tinianow, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+Zr-89-labeled+monoclonal+antibodies+for+ImmunoPET.">Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET.</a> Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+monodispersed+DOTA-PEGn+to+a+thiolated+diabody+reveals+the+effect+of+increasing+PEG+size+on+kidney+clearance+and+tumor+uptake+with+improved+64-copper+PET+imaging.">Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).</li><li>Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+binding+of+disulfide-bridged+PEG-Fabs.">Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).</li><li>Koniev, O., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+and+recent+advancements+in+the+field+of+endogenous+amino+acid+selective+bond+forming+reactions+for+bioconjugation.">Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation.</a> Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).</li><li>Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+serum+stability+of+site-specific+antibody+conjugates+with+sulfone+linkers.">Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).</li><li>Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+stable,+chemoselective+labeling+of+thiols+with+Julia-Kocienski-like+reagents:+A+serum-stable+alternative+to+maleimide-based+protein+conjugation.">Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Last-step+enzymatic+F-18-fluorination+of+cysteine-tethered+RGD+peptides+using+modified+Barbas+linkers.">Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers.</a> Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).</li><li>Chiotellis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemoselective+F-18-radiolabeling+of+thiol-containing+biomolecules+under+mild+aqueous+conditions.">Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions.</a> Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).</li><li>Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+bifunctional+chelators+for+the+creation+of+site-selectively+modified+radioimmunoconjugates+with+improved+stability.">Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability.</a> Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).</li><li>Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+the+intestinal+epithelium-related+antigen+A33,+a+cell+surface+target+for+antibody-based+imaging+and+treatment+in+gastrointestinal+cancer.">Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).</li><li>Junutula, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+modified+111In+labelled+antibodies+give+low+liver+backgrounds+and+improved+radioimmunoscintigraphy.">Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy.</a> Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).</li><li>Strop, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+matters:+SIte+of+conjugation+modulates+stability+and+pharmacokinetics+of+antibody+drug+conjugates.">Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates.</a> Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).</li><li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugates+with+unnatural+amino+acids.">Antibody conjugates with unnatural amino acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li><li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+site-specific+antibody-drug+conjugates+using+unnatural+amino+acids.">Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li><li>Lang, K., Chin, J. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+HIV-1+tat+peptides+to+IgG:+a+potential+route+to+construct+radioimmunoconjugates+for+targeting+intracellular+and+nuclear+epitopes+in+cancer.">Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).</li></ol>

In diesem Bericht haben wir uns entschieden, keine Protokolle für enzymatische oder in vivo Experimente beinhalten. Unsere Gründe sind einfach. In Bezug auf erstere, die enzymatische ein PODS-basierte Immunoconjugate unterscheidet sich nicht überhaupt von derjenigen einer Immunoconjugate synthetisiert, mit anderen Biokonjugaten-Strategien, und diese Verfahren wurden umfassend überprüft anderswo2 . In Bezug auf Letzteres können die Besonderheiten der präklinischen in-vivo-Experimente (d. h. ...

Radiopharmazeutischen Chemiker haben lange ausgenutzt, die Selektivität und Spezifität der Antikörper nach Biomarkern der Krankheit für die beiden nuklearen Bildgebung und gezielte Strahlentherapie1. Abstand der häufigste Ansatz für die enzymatische Antikörper gründet sich auf die wahllose Befestigung des radioaktiven prosthetischen Gruppen oder Radiometal Chelatoren an Aminosäuren – meist Lysines – innerhalb der Struktur von Immunglobulin ( Abbildung 1A)2. Während diese Strategie sicherlich wirksam ist, kann naturgemäß zufällige, nicht-Site-spezifische Probleme verursachen. Insbesondere traditionelle Biokonjugaten Ansätze zu produzieren, schlecht definiert und heterogenen Immunokonjugate bestehend aus Mischungen von Tausenden von verschiedenen Regioisomeren, jeweils mit einem eigenen Satz von biologischen und pharmakologischen Eigenschaften3. Darüber hinaus kann zufällige Biokonjugaten Immunoreactivity von Antikörpern behindern, wenn die Ladung an der Immunglobulin Antigen-bindenden Domänen angehängt wird.
Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von standortspezifischen und Website-selektive Biokonjugaten Strategien wurden entwickelt, um diese Probleme4,5ansprechen. Die häufigste dieser Ansätze stützt sich auf die Unterbindung der Maleimide tragenden Sonden, um die Sulfhydryl-Gruppen von Cysteine (Abbildung 1 b). IgG1-Antikörper enthalten von Natur aus 4 Inter Kette Disulfidbrücken, Verbindungen, die gezielt reduziert werden können, um in der Lage, Michael Hinzufügung Reaktionen mit Maleimides Succinimidyl Thioether Anleihen bilden derzeit kostenlos Thiole zu erbringen. Die Verwendung von Thiole und Maleimides ist sicherlich eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden und eine Vielzahl von Maleimide tragenden Synthone und bifunktionelle Chelatoren sind derzeit verfügbar. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Methode auch gravierende Einschränkungen hat. Maleimide-basierte Immunokonjugate aufweisen begrenzten Stabilität in-vivo, da Thioether Gestänge ein Retro-Michael-Reaktion (Abbildung 2)6,7,8,9, unterziehen kann 10., natürlich kann dies zur Freisetzung von radioaktiven Nutzlast oder deren Austausch mit Thiol-Lager Biomoleküle im Umlauf (z. B. Glutathion oder Serum-Albumin). Beide Prozesse können die Aktivitätskonzentrationen in gesunde Organe zu erhöhen sowie die Aktivitätskonzentrationen in Zielgeweben, was zu reduzierten bildgebenden Kontrast und niedrigere therapeutische Werte zu verringern. Mehrere alternative Thiol-reaktive Reagenzien sind entwickelt worden, in dem Bemühen, diese Fragen, namentlich Tosylates, Bromo und Iodo-Acetyl- und Vinyl Sulfonen11,12,13, zu umgehen 14 , 15 , 16 , 17. all diese Ansätze haben jedoch Einschränkungen, die ihre breite Anwendung behindert haben.
Vor fünf Jahren Pionier das Labor des späten Carlos Barbas III am Scripps Research Institute im Einsatz von Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfonen als Reagenzien für die selektive Bildung von sehr stabile Verbindungen mit Thiole (Abbildung 1 und Abbildung 3) 18 , 19. die Autoren beschäftigt eine Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon-Lager Variante von Fluorescein, mehrere Antikörper entwickelt, um kostenlose Cystein Rückstände zu ändern Immunokonjugate letztlich höhere Stabilität als analog zu produzieren Konstruktionen mit Maleimide-basierte Sonden erstellt. Beim Anblick dieses vielversprechende Arbeit, waren wir etwas überrascht, dass diese Technologie nur kaum in Radiochemie verwendet worden hatte und noch nicht wurde überhaupt in der Synthese von bifunktionelle Chelatoren oder Radioimmunoconjugates20,21 verwendet hatte . Dieser Mangel an Anwendungen, jedoch bald fing an, mehr Sinn machen: mehrere Versuche zur Beschaffung von Reagenz von Sigma-Aldrich führte bei der Auszahlung der komplexe Mischungen von Zersetzungsprodukten mit < 15 % der gewünschten Verbindung. Darüber hinaus Synthese der gemeldeten Reagenz selbst war keine realistische Option, da die veröffentlichten Syntheseweg etwas umständlich ist und anspruchsvolle organische Chemie Geräte erfordert, die meisten Radiochemie und molekulare Bildgebung Labors – einschließlich der unsrigen — einfach nicht besitzen.
In Reaktion auf diese Hindernisse brachen wir erstellen eine leicht zugängliche und hochstabiles Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon Reagenz, der über einen robusten und relativ einfache Syntheseweg erzielt werden kann. Anfang des Jahres berichteten wir die Schaffung eines Modular, stabil und leicht zugängliche Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon Reagenz – genannt "PODS" – als Plattform für Thiol-basierte Bioconjugations (Abbildung 1 und Abbildung 3)22. Der wesentliche Unterschied zwischen Hülsen und das Reagenz von Barbas, berichtet ist Et Al., dass ersteres einen Anilin Ring befestigt Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon glyko-beschäftigt, während letztere verfügt über ein Phenol in der gleichen Position (Abbildung 4). Diese Änderung ermöglicht eine einfache und zugängliche Syntheseweg sowie – wenn unsere Erfahrung mit den im Handel erhältlichen Verbindung emblematischen ist — ein stabiler endgültige Reagenz. In dieser Arbeit haben wir auch ein paar Hülsen tragenden bifunktionelle Chelatoren synthetisiert — Hülsen-DFO und Hülsen-CHX-A''-DTPA – die Schaffung von 89Zr- und 177Lu-mit der Bezeichnung Radioimmunoconjugates bzw. zu erleichtern. Wie wir diskutieren werden, haben wir bewiesen, dass PODS-basierte Website-selektive Bioconjugations reproduzierbar und robust homogen, klar definierte hoch immunreaktiven und hochstabiler Radioimmunoconjugates erstellen. Darüber hinaus haben präklinische Experimenten in murinen Modellen von kolorektalen Karzinomen gezeigt, dass diese Website selektiv Radioimmunoconjugates Ausstellung in-vivo Höchstleistungen im Vergleich zu radioaktiven Antikörper synthetisiert über Maleimide-basierte beschriftet Konjugationen.
Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist die Erstellung von klar definierten, homogene, hochstabile und hoch immunreaktiven Immunokonjugate für in-vitro- und in-vivo Anwendungen zu erleichtern. Der synthetischen Ansatz ist einfach genug, um in fast jedem Labor durchgeführt werden, und das übergeordnete PODS Reagenz kann mit einer Vielzahl von verschiedenen Chelatoren, Fluorophore oder Ladungen geändert werden. In diesem Protokoll und das dazugehörige Video beschreiben wir die einfache, vierstufiges Synthese von Hülsen (Abbildung 5); die Schaffung einer Hülsen tragenden Variante von DOTA, eine weit verbreitete Chelator für die Koordinierung der 64Cu, 68Ga 111In 177Lu und 225Ac (Abbildung 6); und die Biokonjugaten von Hülsen-DOTA an einem Modell Antikörper, die HER2-targeting IgG1 Trastuzumab (Abbildung 7).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>925000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EN300000141G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C556-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC383780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diisopropylethylamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>150915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-727-5100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E145 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413485000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-chloroperbenzoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>273031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBoc-N&#8242;-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>671401</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#8242;- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10&#215; Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates

Maleimide-Lager bifunktionelle Sonden sind seit Jahrzehnten für die Website-gezielte Modifizierung der Thiole in Biomolekülen, insbesondere Antikörper eingesetzt worden. Noch angezeigt Maleimide-basierte Konjugate begrenzten Stabilität in-vivo, da Succinimidyl-Thioether-Gestänge eine Retro-Michael-Reaktion unterzogen werden kann. Dies, führt natürlich zur Freisetzung von radioaktiven Nutzlast oder deren Austausch mit Thiol-Lager Biomoleküle im Umlauf. Beide Prozesse können erhöhte Aktivitätskonzentrationen in gesunde Organe produzieren sowie Aktivitätskonzentrationen in Zielgeweben, was zu reduzierten bildgebenden Kontrast und niedrigere therapeutische Werte gesunken. Wir berichteten im Jahr 2018, die Schaffung eines Modular, stabil und leicht zugängliche Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon Reagenz – genannt "PODS" – als Plattform für Thiol-basierten Bioconjugations. Wir haben klar gezeigt, dass PODS-basierte Website-selektive Bioconjugations reproduzierbar und robust homogen, klar definierte hoch immunreaktiven und hochstabiler Radioimmunoconjugates erstellen. Darüber hinaus haben präklinische Experimenten in murinen Modellen von kolorektalen Karzinomen gezeigt, dass diese Website selektiv Radioimmunoconjugates Ausstellung weit überlegen in-vivo-Leistung im Vergleich zu radioaktiven Antikörper synthetisiert über Maleimide-basierte beschriftet Konjugationen. In diesem Protokoll werden wir die vier-Stufen-Synthese von Hülsen, die Schaffung einer bifunktionelle Hülsen tragenden Variante des allgegenwärtigen Chelator DOTA (PODS-DOTA) und die Konjugation des PODS-DOTA, die HER2-targeting Antikörper Trastuzumab beschreiben.

Die ersten vier Schritte dieses Protokolls – die Synthese der Hülsen – wurden entwickelt, um robust und zuverlässig. Die Deprotonierung und Substitution von 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol bilden die gewünschte Thioether-Produkt bietet die Thioether in > 99 % Ausbeute nach nur 45 Minuten. Als nächstes wurde der Ligatur zwischen 1 und N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine über ein standard-Peptid Kupplung Verfahren, mit dem Ergebnis in d...

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Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

In diesem Protokoll wird die Synthese von Hülsen, ein Phenyoxadiazolyl Methyl Sulfon-basierte Reagenz für die Website-selektive Befestigung der Ladungen an die Thiole von Biomolekülen, insbesondere Antikörper beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir die Synthese und Charakterisierung von eine Hülsen tragenden bifunktionelle Chelator und die Konjugation zu einem Modell-Antikörper.

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Anwendung von PODS, einem neuen Reagenz für die standortspezifische Biokonjugation von Proteinen und Peptiden. Diese Technologie stellt eine deutliche Verbesserung gegenüber traditionellen Maleimid-Thiol-basierten Biokonjugationen dar. Der größte Vorteil dieses Verfahrens ist die Einfachheit, mit der das Reagenz hergestellt wird.Das Verfahren ermöglicht die Synthese des Reagenzes in praktisch jedem Labor. In einem 10-Milliliter-Rundbodenkolben 100 Milligramm des Aminophenyloxadiazeols in drei Milliliter Methanol auflösen. Zur Lösung 360 Mikroliter Diisopropylethylamin und einen magnetischen Rührstab hinzufügen.Versiegeln Sie den Kolben mit einem Gummistopfen und rühren Sie die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur. Mit einer Ein-Milliliter-Glasspritze ein Loch durch den Gummistopfen stopfen und schnell 32 Mikroliter Jodomeme in die Mischung geben. Lassen Sie die Mischung 45 Minuten bei Raumtemperatur reagieren.In einem 25-Milliliter-Rundbodenkolben 387 Milligramm der boc-geschützten Carbonsäure in 10 Milliliter Dichlormethan auflösen. Zur Lösung 480 Mikroliter Diisopropylethylamin, 264 Milligramm EDCI, 200 Milligramm Aniline und einen magnetischen Rührstab hinzufügen. Versiegeln Sie den Kolben mit einem Glasstopfen und lassen Sie die Reaktion fünf Tage bei Raumtemperatur rühren.Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, übertragen Sie das Reaktionsgemisch auf einen Trenntrichter und waschen Sie dreimal mit fünf Millilitern einmollaren Salzsäure. Sammeln Sie die organische Phase und übertragen Sie sie auf den Trenntrichter. Dann die organische Phase mit einem molaren Natriumcarbonat mit anschließendem Wasser waschen.Als nächstes sammeln Sie die organische Phase und fügen Sie Magnesiumsulfat hinzu, um jegliche Wasserspuren zu entfernen. Dann filtern Sie die Mischung mit einem medium Glas frit. Entfernen Sie die flüchtigen Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck, um sich einen off-white-Feststoff leisten zu können.Anschließend den isolierten Feststoff in 10 Milliliter Ethylacetat wieder auflösen. Dann das Produkt über die allmähliche Zugabe von 30 Milliliter Cyclohexan ausbrechen. Filtern Sie die Lösung mit einem mittleren Glasfrites, um das Carbamatprodukt als weißes Pulver zu erhalten.In einem 10-Milliliter-Rundbodenkolben 30 Milligramm des Carbamats in vier Milliliter Dichlormethan auflösen. 49 Milligramm 70%m-Chloroperbenzoesäure und einen magnetischen Rührstab langsam in die Mischung geben und den Kolben mit einem Glasstopfen versiegeln. Rühren Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur, was schließlich zu einer gelben Mischung führt.Am nächsten Tag die Mischung in einen Trenntrichter geben. Dann waschen Sie die Mischung mit 0,1-Molar-Natriumhydroxid gefolgt von Wasser. Sammeln Sie die organische Phase und fügen Sie Magnesiumsulfat hinzu, um jegliche Wasserspuren zu entfernen.Dann filtern Sie die Mischung mit einem medium Glas frit. In einem 25-Milliliter-Rundbodenkolben 30 Milligramm des Carbamats in zwei Milliliter Dichlormethan auflösen. Fügen Sie der Mischung einen magnetischen Rührbalken hinzu.Und 400 Mikroliter Trifluoressigsäure und versiegeln den Kolben mit einem Glasstopfen. Dann rühren Sie das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für drei Stunden. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Flüchtigen unter reduziertem Druck bei Raumtemperatur mit einem Rotationsverdampfer, um einen öligen Rückstand zu erhalten.Lösen Sie den öligen Rückstand in sieben Milliliter Wasser auf. Und auf einen Separatorentrichter übertragen. Waschen Sie die wässrige Lösung dreimal mit vier MilliliterEthylacetat.In einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr 10 Milligramm PODS und 300 Mikroliter Dimethylsulfoxid auflösen. Dann 26 Mikroliter N, N-Diisopropylethylamin in die Lösung geben. 15,2 Milligramm DOTA NCS in 100 Mikroliter Dimethylsulfoxid auflösen und die Lösung mit der PODS-Lösung kombinieren.Versiegeln Sie das Mikrozentrifugenrohr und lassen Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes 61 Mikroliter einer Trastuzumab-Stammlösung mit 859 Mikroliter PBS in einem proteinarmen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr verdünnen. Zu dieser Mischung 6,7 Mikroliter einer frisch hergestellten 10-Millimolar-Lösung von TCEP in Wasser geben.73 Mikroliter einer EIN Milligramm pro Milliliter PODS-DOTA-Lösung in das Reaktionsgemisch geben. Schließlich das Mikrozentrifugenrohr versiegeln und die Lösung zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Die PODS-Synthese ist robust und zuverlässig.Deproteinierung und Substitution des Aminophenyloxadiazols Thiol servierte Thioether eins in quantitativer Ausbeute. Ligation von Thioether eins und die boc-geschützte Carbonsäure ergab Verbindung zwei in 55%Yield. Oxidation gewährt eige Verbindung drei in 90%Yield.Und die Entfernung der Bocs-Schutzgruppe brachte PODS zu 98% Rendite. Die Identität jedes Produkts wurde über Proton NMR, Kohlenstoff-NMR und hochauflösende MS bestätigt. Eine Isothiocyanat-tragende Variante des Chelators DOTA wurde an das Pendantamin von PODS gekoppelt, um den bifunktionellen Chelator in 75% Ausbeute zu erhalten. Die Identität des Produkts wurde über Proton NMR, Kohlenstoff-NMR und hochauflösende MS bestätigt. Hier wird die standortselektive Biokonjugation von PODS-DOTA an den HER2-targeting Antikörper Trastuzumab gezeigt.Die Disulfidverbindungen der Scharnierregion des Antikörpers wurden selektiv reduziert, und der Antikörper wurde dann mit PODS-DOTA inkubiert, um dem DOTA-tragenden Immunkonjugat eine Ausbeute von 80% zu ermöglichen. Die MALDI-TOF-Analyse ergab einen Grad der Kennzeichnung von 1,8 DOTA pro Antikörper. Was in einer Reihe von menschlichen, humanisierten und chimeren IgG1-Antikörpern konsistent bleibt.Die gleichen Bedingungen erzeugen jedoch Immunkonjugate mit einem Etikettierungsgrad von 1,5 für murine IgG1-Antikörper. Aufgrund der Lichtempfindlichkeit dieser Verbindung ist es wichtig, alle Reaktionen in folienbedeckten Gefäßen zu halten. Dies erhöht den Gesamtertrag des Produkts.Während dieses Protokoll die Synthese von PODS-DOTA beschreibt, kann ein ähnliches Verfahren auf eine Vielzahl potenzieller Ladungen angewendet werden, einschließlich Fluorophoren, Toxine und andere Chelatoren. Diese Methode erleichtert den Aufbau klar definierter, homogener und hochstabiler Immunkonjugate, die in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt werden können. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass das in Schritt eins dieses Experiments hinzugefügte Jodome schädliche Auswirkungen haben kann und daher in einer Dunstabzugshaube verwendet werden sollte.

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Synthese von hypervalenten Iodonium Alkinyl triflaten für die Anwendung der Gene Cyanocarbenes

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Split-and-Pool-Synthese und Charakterisierung von Peptid-Amid-Tertiär-Bibliothek

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