Name: synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Gli autori ringraziano il Dr. Sai Kiran Sharma per conversazioni utili.

1. la sintesi di 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Nota: A causa della sensibilità alla luce del composto, tenere tutte le reazioni nei vasi coperti di stagnola.
<ol><li>In 10 mL di un pallone, sciogliere 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalente) di 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol in 3 mL di metanolo.</li>
	<li>Per questa soluzione, aggiungere 360 μL di diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 equivalenti; anidro) e una piccola ancoretta magnetica. Coprire il recipi...

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).</li><li>Agarwal, P., Bertozzi, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+2:+Peptide+tags+and+unnatural+amino+acids.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).</li><li>Alley, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+linker+stability+to+the+activities+of+anticancer+immunoconjugates.">Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+maleimide-thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shen, B. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Jackson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+cysteine+and+site+specific+conjugated+herceptin+antibody-drug+conjugates.">In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates.</a> Plos One. 9 (1), (2014).</li><li>Ponte, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+stability+of+the+thiol-maleimide+linkage+impacts+the+pharmacokinetics+of+lysine-linked+antibody-maytansinoid+conjugates.">Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).</li><li>Stimmel, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+on+serine+-&gt;+cysteine+variant+monoclonal+antibodies.">Site-specific conjugation on serine -&gt; cysteine variant monoclonal antibodies.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+kidney+uptake+in+radiometal+labeled+peptide+linkers+conjugated+to+recombinant+antibody+fragments.+site-specific+conjugation+of+DOTA-peptides+to+a+cys-diabody.">Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).</li><li>Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+bifunctional+chelator+BAT+to+mouse+IgG(1)+Fab'+fragment.">Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).</li><li>Tinianow, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+Zr-89-labeled+monoclonal+antibodies+for+ImmunoPET.">Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET.</a> Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+monodispersed+DOTA-PEGn+to+a+thiolated+diabody+reveals+the+effect+of+increasing+PEG+size+on+kidney+clearance+and+tumor+uptake+with+improved+64-copper+PET+imaging.">Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).</li><li>Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+binding+of+disulfide-bridged+PEG-Fabs.">Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).</li><li>Koniev, O., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+and+recent+advancements+in+the+field+of+endogenous+amino+acid+selective+bond+forming+reactions+for+bioconjugation.">Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation.</a> Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).</li><li>Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+serum+stability+of+site-specific+antibody+conjugates+with+sulfone+linkers.">Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).</li><li>Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+stable,+chemoselective+labeling+of+thiols+with+Julia-Kocienski-like+reagents:+A+serum-stable+alternative+to+maleimide-based+protein+conjugation.">Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Last-step+enzymatic+F-18-fluorination+of+cysteine-tethered+RGD+peptides+using+modified+Barbas+linkers.">Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers.</a> Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).</li><li>Chiotellis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemoselective+F-18-radiolabeling+of+thiol-containing+biomolecules+under+mild+aqueous+conditions.">Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions.</a> Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).</li><li>Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+bifunctional+chelators+for+the+creation+of+site-selectively+modified+radioimmunoconjugates+with+improved+stability.">Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability.</a> Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).</li><li>Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+the+intestinal+epithelium-related+antigen+A33,+a+cell+surface+target+for+antibody-based+imaging+and+treatment+in+gastrointestinal+cancer.">Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).</li><li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+a+cytotoxic+drug+to+an+antibody+improves+the+therapeutic+index.">Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li><li>Pillow, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+trastuzumab+maytansinoid+antibody-drug+conjugates+with+improved+therapeutic+activity+through+linker+and+antibody+engineering.">Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).</li><li>Boswell, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+modified+111In+labelled+antibodies+give+low+liver+backgrounds+and+improved+radioimmunoscintigraphy.">Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy.</a> Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).</li><li>Strop, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+matters:+SIte+of+conjugation+modulates+stability+and+pharmacokinetics+of+antibody+drug+conjugates.">Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates.</a> Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).</li><li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+HIV-1+tat+peptides+to+IgG:+a+potential+route+to+construct+radioimmunoconjugates+for+targeting+intracellular+and+nuclear+epitopes+in+cancer.">Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).</li></ol>

In questo rapporto, abbiamo scelto di non includere eventuali protocolli per la sperimentazione radiolabeling o in vivo. Le ragioni sono semplici. Per quanto riguarda i primi, la radiomarcatura di un immunoconjugate basato su cialde non differisce affatto da quella di un immunoconjugate sintetizzati utilizzando altre strategie bioconjugation, e queste procedure sono state completamente recensione altrove2 . Per quanto riguarda quest'ultimo, le specifiche di preclinici esperimenti in vivo (cioè, m...

Radiofarmaci chimici lungo hanno sfruttato la selettività e specificità degli anticorpi per biomarcatori della malattia per entrambi imaging nucleare e mirata radioterapia1. Gran lunga il più comune approccio per la radiomarcatura di anticorpi si basa sull'attacco indiscriminato di radiomarcato gruppi prostetici o radiometal chelatori agli aminoacidi — più spesso lisine — all'interno della struttura dell'immunoglobulina ( Figura 1A)2. Mentre questa strategia è certamente efficace, la sua natura casuale, non sito specifico può creare problemi. In particolare, gli approcci tradizionali bioconjugation producono mal definito ed efattori eterogenei costituiti da miscele di migliaia di regioisomeri differenti, ognuna con un proprio set di proprietà biologiche e farmacologiche3. Inoltre, bioconjugation casuale può ostacolare il immunoreactivity di anticorpi, se il carico viene aggiunto ai domini di antigene-legante di immunoglobulina.
Nel corso degli anni, una varietà di strategie bioconjugation site-specific e sito-selettivi sono stati sviluppati al fine di affrontare questi problemi4,5. Il più comune di questi approcci si basa sulla legatura delle sonde maleimide-cuscinetto ai gruppi solfidrilici di cisteine (Figura 1B). Gli anticorpi IgG1 contengono naturalmente 4 ponti disolfuro di inter-catena, legami che possono essere ridotti in modo selettivo per produrre i tioli gratuiti in grado di subire reazioni di addizione di Michael con le maleimidi per formare legami tioetere succinimidyl. L'uso dei tioli e le maleimidi è certamente un miglioramento rispetto ai metodi tradizionali e un'ampia varietà di maleimide-cuscinetto Sintoni e chelanti bifunzionali attualmente disponibili. Tuttavia, è importante notare che questa metodologia ha seri limiti pure. Basato su maleimide efattori presentano limitata stabilità in vivo, poiché il sollevatore thioether possa subire una reazione di retrò-Michael (Figura 2)6,7,8,9, 10. questo, naturalmente, può portare al rilascio di payload radioattivo o relativo scambio con biomolecole di tiolo-cuscinetto in circolazione (ad es., glutatione o albumina). Entrambi questi processi possono aumentare le concentrazioni di attività in organi sani, nonché diminuire le concentrazioni di attività nei tessuti bersaglio, con conseguente ridotta formazione immagine contrasto e rapporti terapeutici più bassi. Sono stati sviluppati diversi reagenti alternativi tiolo-reattive nel tentativo di eludere questi problemi, tra cui tosylates, bromo - e iodo-acetili e vinile solfoni11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Tuttavia, tutti questi approcci presentano limitazioni che hanno ostacolato la loro applicazione diffusa.
Circa cinque anni fa, il laboratorio di Carlos Barbas III allo Scripps Research Institute ha sperimentato l'uso dei solfoni metil phenyloxadiazolyl come reagenti per la formazione selettiva di legami altamente stabile con tioli (Figura 1 e figura 3) 18 , 19. gli autori hanno impiegato una variante del solfone-cuscinetto di metile phenyloxadiazolyl di fluorescina per modificare parecchi anticorpi ingegnerizzati per contenere residui di cisteina libera, producendo infine efattori con più alta stabilità che analoga costrutti creati utilizzando sonde maleimide-basato. Vedendo questo lavoro promettente, siamo rimasti un po' sorpresi che questa tecnologia era stata utilizzata solo a malapena in radiochimica e non era stato ancora utilizzata affatto nella sintesi di chelanti bifunzionali o radioimmunoconjugates20,21 . Questa scarsità di applicazioni, tuttavia, ben presto cominciò ad avere più senso: parecchi tentativi di procurarsi il reagente da Sigma-Aldrich ha provocato la ricevuta di miscele complesse di prodotti di degradazione con < 15% del composto desiderato. Inoltre, sintetizzando il reagente segnalato noi stessi non era un'opzione realistica, come il percorso sintetico pubblicato è alquanto complesso e richiede attrezzature sofisticate chimica organica che la maggior parte radiochimica e imaging molecolare laboratori — compreso il nostro — semplicemente non possiedono.
In risposta a questi ostacoli, abbiamo deciso di creare un facilmente accessibile e altamente stabile reagente del solfone di metile phenyloxadiazolyl che può essere ottenuto tramite un percorso sintetico robusto e ragionevolmente facile. All'inizio di quest'anno, abbiamo segnalato la creazione di un modulare, stalla e facilmente raggiungibile phenyloxadiazolyl metil solfone reagente — soprannominato 'Baccelli' — come una piattaforma per bioconiugazione tiolo-base (Figura 1 e figura 3)22. La differenza fondamentale tra le cialde e il reagente segnalato da Barbas, et al è che il primo impiega un anello di anilina attaccato nella frazione di phenyloxadiazolyl metil solfone, mentre quest'ultimo dispone di un fenolo nella stessa posizione (Figura 4). Questo cambiamento facilita un percorso sintetico più semplice e accessibile come pure — se la nostra esperienza con il composto commercialmente disponibile è emblematico — un reagente finale più stabile. In questo lavoro, abbiamo sintetizzato anche un paio di chelanti bifunzionali baccelli-cuscinetto — cialde-DFO e cialde-CHX-A cm-DTPA — per facilitare la creazione di 89Zr - e 177radioimmunoconjugates Lu-etichettati, rispettivamente. Come vedremo, abbiamo dimostrato che bioconiugazione sito-selettivo basato su cialde riproducibile e robustamente creare radioimmunoconjugates omogeneo, ben definito, altamente immunoreactive e altamente stabile. Inoltre, esperimenti preclinici in modelli murini di cancro colorettale hanno dimostrato che questi sito-selettivamente etichettato radioimmunoconjugates espositivo superior in vivo delle prestazioni rispetto agli anticorpi radiomarcati sintetizzati tramite maleimide-basato coniugazioni.
L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di facilitare la creazione di ben definito, omogeneo, altamente stabile e altamente immunoreactive efattori per applicazioni in vitro e in vivo. L'approccio sintetico è abbastanza semplice da essere eseguito in quasi tutti i laboratori e il reagente di baccelli del genitore può essere modificato con una pletora di diversi chelatori, fluorofori o carichi. In questo protocollo e il video di accompagnamento, descriveremo la sintesi semplice, quattro fasi di baccelli (Figura 5); la creazione di una variante di baccelli-cuscinetto di DOTA, un chelatore ampiamente usato per il coordinamento di 64Cu, 68Ga, 111a, 177Lu e 225Ac (Figura 6); e il bioconjugation di baccelli-DOTA di un anticorpo di modello, il IgG1 come destinazione HER2 trastuzumab (Figura 7).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>925000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EN300000141G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C556-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC383780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diisopropylethylamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>150915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-727-5100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E145 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413485000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-chloroperbenzoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>273031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBoc-N&#8242;-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>671401</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#8242;- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10&#215; Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates

Sonde bifunzionale maleimide-cuscinetto sono state impiegate per decenni per la modifica sito-selettiva di tioli in biomolecole, soprattutto gli anticorpi. Ancora basato su maleimide coniugati visualizzazione limitata stabilità in vivo perché il sollevatore thioether succinimidyl possa subire una reazione di retrò-Michael. Questo, naturalmente, può portare al rilascio di payload radioattivo o relativo scambio con biomolecole di tiolo-cuscinetto in circolazione. Entrambi questi processi può produrre concentrazioni di attività elevati in organi sani come pure in diminuzione di concentrazioni di attività nei tessuti bersaglio, con conseguente ridotta formazione immagine contrasto e rapporti terapeutici più bassi. Nel 2018, abbiamo segnalato la creazione di un modulare, stalla e facilmente raggiungibile phenyloxadiazolyl metil solfone reagente — soprannominato 'Baccelli' — come una piattaforma per bioconiugazione tiolo-basato. Abbiamo chiaramente dimostrato che bioconiugazione sito-selettivo basato su cialde riproducibile e robustamente creare radioimmunoconjugates omogeneo, ben definito, altamente immunoreactive e altamente stabile. Inoltre, esperimenti preclinici in modelli murini di cancro colorettale hanno dimostrato che questi sito-selettivamente etichettato radioimmunoconjugates espositivo molto superiore in vivo delle prestazioni rispetto agli anticorpi radiomarcati sintetizzati tramite maleimide-basato coniugazioni. In questo protocollo, descriveremo la sintesi di quattro fasi di baccelli, la creazione di una variante di baccelli-cuscinetto bifunzionale dell'onnipresente chelante DOTA (cialde-DOTA) e la coniugazione di baccelli-DOTA per il targeting per HER2 anticorpo trastuzumab.

I primi quattro passaggi del presente protocollo — la sintesi dei baccelli — sono stati progettati per essere robusti ed affidabili. La deprotonazione e sostituzione di 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol per formare il prodotto desiderato thioether permette il thioether in > 99% di rendimento dopo appena 45 minuti. Successivamente, la legatura tra 1 e N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine è stata realizzata via un peptide standard procedura di...

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Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Sintesi e Bioconjugation di tiolo-reattive reagenti per la creazione del sito-selettivamente per volta efattori

In questo protocollo, descriveremo la sintesi di cialde, un reagente basati su solfone metil phenyoxadiazolyl per il fissaggio dei carichi sito selettivo i tioli di biomolecole, in particolare gli anticorpi. Inoltre, descriveremo la sintesi e la caratterizzazione di un chelante bifunzionale baccelli-cuscinetto e la sua coniugazione di un anticorpo di modello.

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Questo protocollo descrive la sintesi e l'applicazione di PODS, un nuovo reagente per la bioconiogazione site-specific di proteine e peptidi. Questa tecnologia rappresenta un netto miglioramento rispetto alle tradizionali biocongiugazioni a base di maleimide-tiolo. Il più grande vantaggio di questa procedura è la semplicità con cui viene realizzato il reagente.Il metodo consente di sintetizzare il reagente praticamente in qualsiasi laboratorio. In un pallone a fondo rotondo da 10 millilitri, sciogliere 100 milligrammi dell'amminofenil oxadiazolo tiolo in tre millilitri di metanolo. Alla soluzione aggiungere 360 microlitri di diisopropiletilammina e una barra di agitazione magnetica.Sigillare il pallone con un tappo di gomma e mescolare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una siringa di vetro da un millilitro, fare un buco attraverso il tappo di gomma e aggiungere rapidamente 32 microlitri di iodometano alla miscela. Lasciare reagire la miscela per 45 minuti a temperatura ambiente.In un pallone a fondo tondo da 25 millilitri, sciogliere 387 milligrammi dell'acido carbossilico protetto dal boc in 10 millilitri di diclorometano. Alla soluzione aggiungere 480 microlitri di diisopropiletilammina, 264 milligrammi di EDCI, 200 milligrammi di anilina e una barra di agitazione magnetica. Sigillare il pallone con un tappo di vetro e lasciare mescolare la reazione per cinque giorni a temperatura ambiente.Una volta completata la reazione, trasferire la miscela di reazione in un imbuto separatore e lavare tre volte con cinque millilitri di acido cloridrico un molare. Raccogliere la fase organica e trasferirla nell'imbuto separatore. Quindi lavare la fase organica con carbonato di sodio un molare seguito da acqua.Successivamente, raccogliere la fase organica e aggiungere solfato di magnesio per rimuovere eventuali tracce di acqua. Quindi filtrare la miscela utilizzando una fritta di vetro media. Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere i solventi volatili a pressione ridotta per permettersi un solido bianco troppo bianco.In seguito, riassolvere il solido isolato in 10 millilitri di acetato di etile. Quindi precipitare il prodotto attraverso l'aggiunta graduale di 30 millilitri di cicloesano. Filtrare la soluzione utilizzando una fritta di vetro media per ottenere il prodotto carbammato come polvere bianca.In un pallone a fondo tondo da 10 millilitri, sciogliere 30 milligrammi del carbammato in quattro millilitri di diclorometano. Aggiungere lentamente 49 milligrammi di acido cloroperbenzoico al 70%m e una barra di agitazione magnetica alla miscela e sigillare il pallone con un tappo di vetro. Mescolare la soluzione durante la notte a temperatura ambiente, producendo infine una miscela gialla.Il giorno seguente, trasferire la miscela in un imbuto separatore. Quindi lavare la miscela con idrossido di sodio 0,1 molare seguito da acqua. Raccogliere la fase organica e aggiungere solfato di magnesio per rimuovere eventuali tracce di acqua.Quindi filtrare la miscela utilizzando una fritta di vetro media. In un pallone a fondo tondo da 25 millilitri, sciogliere 30 milligrammi del carbammato in due millilitri di diclorometano. Aggiungere una barra di agitazione magnetica alla miscela.E 400 microlitri di acido trifluoroacetico e sigillare il pallone con un tappo di vetro. Quindi mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per tre ore. Una volta completata la reazione, rimuovere i volatili a pressione ridotta a temperatura ambiente utilizzando un evaporatore rotante per ottenere un residuo oleoso.Sciogliere il residuo oleoso in sette millilitri di acqua. E trasferimento in un imbuto separatorio. Lavare la soluzione acquosa tre volte con quattro millilitri di acetato di etile.In un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri sciogliere 10 milligrammi di PODS e 300 microlitri di solfossido di dimetile. Quindi aggiungere 26 microlitri di N, N-diisopropiletilammina alla soluzione. Sciogliere 15,2 milligrammi di DOTA NCS in 100 microlitri di solfossido di dimetile e combinare la soluzione con la soluzione PODS.Sigillare il tubo di microcentrifugo e consentire alla reazione di incubare durante la notte a temperatura ambiente. Successivamente, diluire 61 microlitri di una soluzione di stock di trastuzumab con 859 microlitri di PBS in un tubo di microcentrifugo a basso legame proteico da 1,5 millilitri. A questa miscela, aggiungere 6,7 microlitri di una soluzione da 10 millimolare appena fatta di TCEP in acqua.Aggiungere 73 microlitri di una soluzione PODS-DOTA da un milligrammo per millilitro alla miscela di reazione. Infine, sigillare il tubo di microcentrifugo e incubare la soluzione per due ore a temperatura ambiente. La sintesi PODS è robusta e affidabile.La deproteinazione e la sostituzione dell'amminofenil oxadiazolo tiolo ne offriva una in resa quantitativa. La legatura del tioetere uno e dell'acido carbossilico protetto dal boc ha prodotto il composto due nella resa del 55%. L'ossidazione ha offerto al composto tre con una resa del 90%.E la rimozione del gruppo che protegge i bocs ha prodotto PODS con una resa del 98%. L'identità di ogni prodotto è stata confermata tramite NMR protone, NMR in carbonio e SM ad alta risoluzione. Una variante portante di isotiocianato del chelatore DOTA è stata accoppiata all'ammina pendente di PODS per ottenere il chelatore bifunzionale con una resa del 75%. L'identità del prodotto è stata confermata tramite NMR protone, NMR al carbonio e SM ad alta risoluzione. Qui viene mostrata la bioconiogazione selettiva del sito di PODS-DOTA al trastuzumab anticorpale con targeting HER2.I collegamenti disolfuro della regione della cerniera dell'anticorpo sono stati selettivamente ridotti e l'anticorpo è stato quindi incubato con PODS-DOTA per permettersi all'immunoconiuvato dota una resa dell'80%. L'analisi MALDI-TOF ha rivelato un grado di etichettatura di 1,8 DOTA per anticorpo. Che rimane coerente in una serie di anticorpi IgG1 umani, umanizzati e chimerici.Tuttavia, le stesse condizioni producono immunoconiuvati con un grado di etichettatura di 1,5 per gli anticorpi murini IgG1. A causa della sensibilità alla luce di questo composto, è importante mantenere tutte le reazioni nei vasi ricoperti di fogli. Ciò aumenterà la resa complessiva del prodotto.Mentre questo protocollo descrive la sintesi di PODS-DOTA, una procedura simile può essere applicata a una vasta gamma di carichi potenziali, tra cui fluorofori, tossine e altri chelatori. Questo metodo faciliterà la costruzione di immunoconiuvati ben definiti, omogenei e altamente stabili che possono essere utilizzati in un'ampia varietà di campi. È importante ricordare che l'iodometano aggiunto nella prima fase di questo esperimento può avere effetti dannosi e dovrebbe quindi essere usato in una cappa aspirante.

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