Name: synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Sai Kiran Sharma for nyttig samtaler.

1. syntese av 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Merk: På grunn av lys-følsomheten av sammensatt, holde alle reaksjoner i folie-dekket fartøyer.
<ol><li>I en 10 mL runde bunnen kolbe, oppløse 100 mg (0.517 mmol, 1 tilsvarende) av 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol i 3 mL av metanol.</li>
	<li>Denne løsningen, legge til 360 μL diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 ekvivalenter; vannfri) og en liten magnetic røre bar. Dekke en gummipropp flasken og rør lø...

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).</li><li>Agarwal, P., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody-drug+conjugates:+the+nexus+of+bioorthogonal+chemistry,+protein+engineering,+and+drug+development.">Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+1:+Cysteine+residues+and+glycans.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+2:+Peptide+tags+and+unnatural+amino+acids.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).</li><li>Alley, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+linker+stability+to+the+activities+of+anticancer+immunoconjugates.">Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+maleimide-thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shen, B. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Jackson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+cysteine+and+site+specific+conjugated+herceptin+antibody-drug+conjugates.">In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates.</a> Plos One. 9 (1), (2014).</li><li>Ponte, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+stability+of+the+thiol-maleimide+linkage+impacts+the+pharmacokinetics+of+lysine-linked+antibody-maytansinoid+conjugates.">Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).</li><li>Stimmel, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+on+serine+-&gt;+cysteine+variant+monoclonal+antibodies.">Site-specific conjugation on serine -&gt; cysteine variant monoclonal antibodies.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+kidney+uptake+in+radiometal+labeled+peptide+linkers+conjugated+to+recombinant+antibody+fragments.+site-specific+conjugation+of+DOTA-peptides+to+a+cys-diabody.">Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).</li><li>Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+bifunctional+chelator+BAT+to+mouse+IgG(1)+Fab'+fragment.">Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).</li><li>Tinianow, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+Zr-89-labeled+monoclonal+antibodies+for+ImmunoPET.">Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET.</a> Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+monodispersed+DOTA-PEGn+to+a+thiolated+diabody+reveals+the+effect+of+increasing+PEG+size+on+kidney+clearance+and+tumor+uptake+with+improved+64-copper+PET+imaging.">Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).</li><li>Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+binding+of+disulfide-bridged+PEG-Fabs.">Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).</li><li>Koniev, O., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+and+recent+advancements+in+the+field+of+endogenous+amino+acid+selective+bond+forming+reactions+for+bioconjugation.">Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation.</a> Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).</li><li>Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+serum+stability+of+site-specific+antibody+conjugates+with+sulfone+linkers.">Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).</li><li>Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+stable,+chemoselective+labeling+of+thiols+with+Julia-Kocienski-like+reagents:+A+serum-stable+alternative+to+maleimide-based+protein+conjugation.">Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Last-step+enzymatic+F-18-fluorination+of+cysteine-tethered+RGD+peptides+using+modified+Barbas+linkers.">Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers.</a> Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).</li><li>Chiotellis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemoselective+F-18-radiolabeling+of+thiol-containing+biomolecules+under+mild+aqueous+conditions.">Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions.</a> Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).</li><li>Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+bifunctional+chelators+for+the+creation+of+site-selectively+modified+radioimmunoconjugates+with+improved+stability.">Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability.</a> Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).</li><li>Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+the+intestinal+epithelium-related+antigen+A33,+a+cell+surface+target+for+antibody-based+imaging+and+treatment+in+gastrointestinal+cancer.">Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).</li><li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+a+cytotoxic+drug+to+an+antibody+improves+the+therapeutic+index.">Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li><li>Pillow, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+trastuzumab+maytansinoid+antibody-drug+conjugates+with+improved+therapeutic+activity+through+linker+and+antibody+engineering.">Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+tumor+retention+of+a+radiohalogen+label+for+site-specific+modification+of+antibodies.">Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+drug+conjugation+on+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+of+anti-STEAP1+antibody-drug+conjugates+in+rats.">Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).</li><li>Alvarez, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+modified+111In+labelled+antibodies+give+low+liver+backgrounds+and+improved+radioimmunoscintigraphy.">Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy.</a> Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).</li><li>Strop, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+matters:+SIte+of+conjugation+modulates+stability+and+pharmacokinetics+of+antibody+drug+conjugates.">Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates.</a> Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).</li><li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugates+with+unnatural+amino+acids.">Antibody conjugates with unnatural amino acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li><li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+site-specific+antibody-drug+conjugates+using+unnatural+amino+acids.">Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodate+oxidation+of+methionine+in+proteines.">Periodate oxidation of methionine in proteines.</a> Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+methionine+oxidation+in+human+IgG1+Fc+on+serum+half-life+of+monoclonal+antibodies.">Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).</li><li>O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+labeling+immunoglobulins+by+conjugation+to+oligosaccharide+moieties.">A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties.</a> Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).</li><li>Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody+drug+conjugates+for+cancer+therapy.">Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy.</a> Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).</li><li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+HIV-1+tat+peptides+to+IgG:+a+potential+route+to+construct+radioimmunoconjugates+for+targeting+intracellular+and+nuclear+epitopes+in+cancer.">Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).</li></ol>

I denne rapporten, har vi valgt ikke å inkludere alle protokoller for radiolabeling eller i vivo eksperimentering. Våre grunner er grei. Med hensyn til tidligere, radiolabeling av en PODS-baserte immunoconjugate ikke avvike hele fra av en immunoconjugate syntetisert andre bioconjugation strategier, og disse prosedyrene er grundig gjennomgått andre steder2 . Når det gjelder sistnevnte, kan detaljene i preklinisk i vivo eksperimenter (dvs. mus modeller, doser, etc.) variere bredt både programme...

Radiopharmaceutical kjemikere har lenge utnyttet selektivitet og spesifisitet av antistoffer for biomarkers sykdom for både kjernefysiske bildebehandling og målrettet strålebehandling1. Langt unna de vanligste tilnærming til radiolabeling av antistoffer forutsetter vilkårlige feste radiolabeled prosthetic grupper eller radiometal chelater til aminosyrer, oftest lysines-i strukturen av immunglobulin ( Figur 1A)2. Selv om denne strategien er sikkert effektivt, kan tilfeldig, ikke-område-spesifikk natur skape problemer. Spesielt tradisjonelle bioconjugation tilnærminger produsere dårlig definert og heterogene immunoconjugates består av blandinger av forskjellige regioisomers, hver med sitt eget sett av biologisk og farmakologisk egenskaper3. Videre kan tilfeldig bioconjugation hindre immunoreactivity av antistoffer Hvis lasten er lagt til av immunglobulin antigen bindende domener.
Gjennom årene, en rekke områdespesifikke og området-selektive bioconjugation strategier er utviklet for å møte disse problemer4,5. Den vanligste av disse avhengig av ligation av maleimide-bærende sonder til sulfhydryl grupper med cysteinene (figur 1B). IgG1 antistoffer inneholder naturlig 4 mellom kjeden disulfidbroer, sammenhengene som reduseres selektivt for å gi gratis thiols i stand til å gjennomgå Michael tillegg reaksjoner med maleimides til succinimidyl thioether obligasjoner. Bruk av thiols og maleimides er absolutt en forbedring over tradisjonelle metoder, og en rekke maleimide-bærende synthons og bifunctional chelater er tilgjengelige. Det er imidlertid viktig å merke seg at denne metoden har alvorlige begrensninger også. Maleimide-baserte immunoconjugates utstilling begrenset stabilitet i vivo fordi thioether sammenhengen kan gjennomgå en retro-Michael reaksjon (figur 2)6,7,8,9, 10. dette, selvfølgelig, kan føre til utgivelsen av radioaktivt nyttelast eller sin exchange thiol-bærende biomolecules i sirkulasjon (f.eks glutation eller serum albumin). Begge disse prosessene kan øke aktiviteten konsentrasjoner i friske organer samt redusere aktivitet konsentrasjonene i målet vev, som resulterer i redusert tenkelig kontrast og lavere terapeutiske forhold. Flere alternative thiol-reaktive reagenser er utviklet i et forsøk på å omgå disse problemene, inkludert tosylates, bromo - og iodo-acetyls, og vinyl sulfones11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. alle disse tilnærmingene har imidlertid begrensninger som har hemmet utbredt programmet.
Fem år siden, pioner laboratoriet av sen Carlos Barbas III ved Scripps Research Institute i bruk av phenyloxadiazolyl methyl sulfones som reagenser for selektiv dannelsen av svært stabile sammenhengene med thiols (figur 1 c og figur 3) 18 , 19. forfatterne ansatt en phenyloxadiazolyl methyl sulfone-bærende variant av fluorescein endre flere antistoffer konstruert for å inneholde gratis cystein rester, til slutt produsere immunoconjugates med høyere stabilitet enn analoge konstruksjoner laget med maleimide-baserte sonder. Da han så dette lovende arbeidet, var vi litt overrasket over at denne teknologien var bare brukt knapt i radiochemistry og hadde ennå ikke er brukt på alle i syntesen av bifunctional chelater eller radioimmunoconjugates20,21 . Denne mangel på programmer, men snart begynte å gjøre mer fornuftig: flere forsøk på å skaffe reagensen fra Sigma Aldrich resulterte i mottak av komplekse blandinger av nedbrytningsprodukter med < 15% av den ønskede sammensatt. I tillegg syntetisere rapporterte reagensen oss var ikke en realistisk opsjon, som publiserte syntetiske ruten er noe tungvint og krever sofistikerte organisk kjemi utstyr som de fleste radiochemistry og molekylære bildebehandling laboratorier, inkludert vår-bare ikke har.
Svar på disse hindringene satt vi å lage en lett tilgjengelig og svært stabil phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagens som kan fås via en robust og rimelig lettvinte syntetisk prosess. Tidligere i år, rapporterte vi etableringen av en modulær, stabil og lett tilgjengelig phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagens-kalt "PODS", som en plattform for thiol-baserte bioconjugations (figur 1 c og figur 3)22. Hovedforskjellen mellom PODS og reagens rapportert av Barbas, et al. er at tidligere benytter en anilinhud ring festet til phenyloxadiazolyl methyl sulfone moiety, mens sistnevnte har en fenol i samme stilling (Figur 4). Denne endringen gir en mer enkel og tilgjengelig syntetisk prosess som, hvis vår erfaring med det kommersielt tilgjengelige sammensatt er illustrerende-en mer stabil siste reagens. I dette arbeidet, vi også syntetiseres et par PODS-bærende bifunctional chelater-PODS-DFO og PODS-CHX-A''-DTPA-å forenkle etableringen av 89Zr- og 177Lu-merket radioimmunoconjugates, henholdsvis. Som vi vil diskutere, har vi vist at PODS-basert nettsted-selektiv bioconjugations reproduserbar og robustly opprette homogene, veldefinerte, svært immunoreactive og svært stabile radioimmunoconjugates. Videre har prekliniske eksperimenter i murine modeller av tykktarmskreft vist at dette området-selektivt merket radioimmunoconjugates utstillingen overlegen i vivo ytelse sammenlignet med radiolabeled antistoffer syntetisert via maleimide-basert conjugations.
Det overordnede målet med dette arbeidet er å forenkle etableringen av veldefinerte, homogen, svært stabile og svært immunoreactive immunoconjugates for i vitro og in vivo programmer. Den syntetiske tilnærmingen er enkel nok utføres i nesten alle laboratorium, og overordnede PODS reagensen kan endres med en mengde forskjellige chelater, fluorophores eller Last. I denne protokollen og på videoen, vil vi beskrive enkle, fire-trinns syntesen av PODS (figur 5); etableringen av en PODS rentebærende variant av DOTA, en brukte chelator for koordinering av 64Cu, 68Ga, 111i 177Lu og 225Ac (figur 6). og bioconjugation av PODS-DOTA til en modell antistoff, HER2 målretting IgG1 trastuzumab (figur 7).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>925000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EN300000141G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C556-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC383780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diisopropylethylamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>150915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-727-5100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E145 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413485000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-chloroperbenzoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>273031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBoc-N&#8242;-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>671401</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#8242;- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10&#215; Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates

Maleimide-bærende bifunctional sonder har vært ansatt i tiår området-selektiv endring av thiols i biomolecules, spesielt antistoffer. Likevel vise maleimide-baserte conjugates begrenset stabilitet i vivo fordi succinimidyl thioether sammenhengen kan gjennomgå en retro-Michael reaksjon. Dette, selvfølgelig, kan føre til utgivelsen av radioaktivt nyttelast eller sin exchange thiol-bærende biomolecules i sirkulasjon. Begge disse prosessene kan produsere opphøyet aktivitet konsentrasjoner i friske organer samt redusert aktivitet konsentrasjonene i målet vev, som resulterer i redusert tenkelig kontrast og lavere terapeutiske forhold. I 2018, rapporterte vi etableringen av en modulær, stabil og lett tilgjengelig phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagens-kalt "PODS", som en plattform for thiol-basert bioconjugations. Vi har vist at PODS-basert nettsted-selektiv bioconjugations reproduserbar og robustly opprette homogene, veldefinerte, svært immunoreactive og svært stabile radioimmunoconjugates. Videre har prekliniske eksperimenter i murine modeller av tykktarmskreft vist at dette området-selektivt merket radioimmunoconjugates utstillingen langt overlegen i vivo ytelse sammenlignet med radiolabeled antistoffer syntetisert via maleimide-basert conjugations. I denne protokollen, vil vi beskrive fire trinn syntesen av PODS, etableringen av en bifunctional PODS rentebærende variant av den allestedsnærværende chelator DOTA (PODS-DOTA) og Bøyning av PODS-DOTA til HER2 målretting antistoffet trastuzumab.

De fire første trinnene av denne protokollen-syntese av PODS, er designet for å være robust og pålitelig. Deprotonering og substitusjon av 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol å danne ønskede thioether produktet gir thioether i > 99% avkastning etter bare 45 minutter. Neste, ligation mellom 1 og N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine ble nådd via en standard peptid kopling prosedyren, som resulterer i samlingen av produktet (2)...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Syntese og Bioconjugation Thiol-reaktive reagenser for etableringen av nettstedet-selektivt endret Immunoconjugates

I denne protokollen, vil vi beskrive syntesen av PODS, en phenyoxadiazolyl methyl sulfone-baserte reagens for området-selektiv feste Last til thiols av biomolecules, spesielt antistoffer. I tillegg vil vi beskrive syntese og karakterisering av en PODS-bærende bifunctional chelator og dens Bøyning til en modell antistoff.

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Denne protokollen beskriver syntese og anvendelse av PODS, en ny reagens for stedsspesifikk biokonjugering av proteiner og peptider. Denne teknologien representerer en markant forbedring over tradisjonelle maleimide-thiol-baserte biokonjugeringer. Den største fordelen med denne prosedyren er enkelheten som reagensen er laget med.Metoden gjør at reagensen kan syntetiseres i nesten alle laboratorier. I en 10-milliliter rund bunnkolbe oppløses 100 milligram aminofenyloksadiazolthiol i tre milliliter metanol. Til løsningen, tilsett 360 mikroliter diisopropylethylamine og en magnetisk rørestang.Forsegle kolben med en gummipropp, og rør oppløsningen i 10 minutter ved romtemperatur. Bruk en en milliliter glasssprøyte, poke et hull gjennom gummiproppen og legg raskt til 32 mikroliter iodometan til blandingen. La blandingen reagere i 45 minutter ved romtemperatur.I en 25-milliliter rund bunnkolbe oppløses 387 milligram av boc-beskyttet karboksylsyre i 10 milliliter diklormetan. Til løsningen, tilsett 480 mikroliter diisopropylethylamine, 264 milligram EDCI, 200 milligram avanilin, og en magnetisk rørestang. Forsegle kolben med en glassstopper, og la reaksjonen røre i fem dager ved romtemperatur.Når reaksjonen er fullført, overfør reaksjonsblandingen til en separattor trakt, og vask tre ganger med fem milliliter av en-molarsyklorsyre. Samle den organiske fasen og overfør den til separatoritrakten. Vask deretter den organiske fasen med en-molar natriumkarbonat etterfulgt av vann.Deretter samler du den organiske fasen og legger til magnesiumsulfat for å fjerne eventuelle spor av vann. Deretter filtrerer du blandingen ved hjelp av en middels glassfrit. Bruk en roterende fordamper til å fjerne de flyktige løsemidlene under redusert trykk for å ha råd til en off-white solid.Etter dette, redissolve det isolerte fast i 10 milliliter etylacetat. Deretter utløse produktet via gradvis tilsetning av 30 milliliter cyclohexane. Filtrer løsningen ved hjelp av en middels glassfrit for å få carbamate-produktet som et hvitt pulver.I en 10-milliliter rund bunnkolbe oppløses 30 milligram av karbamaten i fire milliliter diklormetan. Tilsett langsomt 49 milligram 70% m-kloroperbenzosyre og en magnetisk rørestang til blandingen, og forsegle kolben med en glasspropp. Rør løsningen over natten ved romtemperatur, og gi til slutt en gul blanding.På neste dag overfører du blandingen til en separatoritrakt. Vask deretter blandingen med 0,1-molar natriumhydroksid etterfulgt av vann. Samle den organiske fasen og tilsett magnesiumsulfat for å fjerne eventuelle spor av vann.Deretter filtrerer du blandingen ved hjelp av en middels glassfrit. I en 25-milliliter rund bunnkolbe oppløses 30 milligram av karbamaten i to milliliter diklormetan. Tilsett en magnetisk rørestang til blandingen.Og 400 mikroliter trifluorotaksyre og forsegle kolben med en glasspropp. Rør deretter reaksjonsblandingen ved romtemperatur i tre timer. Når reaksjonen er fullført, fjern volatilene under redusert trykk ved romtemperatur ved hjelp av en roterende fordamper for å oppnå en oljeaktig rester.Oppløs de oljete rester i syv milliliter vann. Og overfør til en separatoritrakt. Vask vandig oppløsning tre ganger med fire milliliter etylacetat.I et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør oppløser du 10 milligram PODS og 300 mikroliter dimetylsulfoksid. Tilsett deretter 26 mikroliter N, N-diisopropylethylamine til løsningen. Oppløs 15,2 milligram DOTA NCS i 100 mikroliter dimetylsulfoksid, og kombiner oppløsningen med PODS-oppløsningen.Forsegle mikrocentrifugerøret, og la reaksjonen inkubere over natten ved romtemperatur. Deretter fortynner du 61 mikroliter av en trastuzumab-lagerløsning med 859 mikroliter PBS i et lavproteinbindende 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Til denne blandingen, tilsett 6,7 mikroliter av en nylaget 10-millimolar løsning av TCEP i vann.Tilsett 73 mikroliter av en en mg-per-milliliter PODS-DOTA-løsning til reaksjonsblandingen. Til slutt forsegler du mikrocentrifugerøret og inkuberer løsningen i to timer ved romtemperatur. PODS-syntesen er robust og pålitelig.Deproteinering og substitusjon av aminofenyloksadiazol thiol ga tioether en i kvantitativt utbytte. Ligation av thioether en og boc-beskyttet karboksylsyre ga sammensatte to i 55% avkastning. Oksidasjon ga sammensatt tre i 90% yield.Og fjerning av bocs-beskyttende gruppen ga PODS i 98% yield. Identiteten til hvert produkt ble bekreftet via proton NMR, karbon NMR og høyoppløselig MS. En isotyocyanatbærende variant av chelator DOTA ble skrevet til anhenget av PODS for å oppnå den tofunksjonelle chelatoren i 75% avkastning. Identiteten til produktet ble bekreftet via proton NMR, karbon NMR og høyoppløselig MS. Stedsselektiv biokonjugering av PODS-DOTA til HER2-målretting antistoff trastuzumab er vist her.Disulfidkoblingene i antistoffets hengselregion ble selektivt redusert, og antistoffet ble deretter inkubert med PODS-DOTA for å ha råd til DOTA-bærende immunkonjugering av en 80% avkastning. MALDI-TOF analyse viste en grad av merking av 1,8 DOTA per antistoff. Som forblir konsekvent på tvers av en rekke menneskelige, humaniserte og kimeriske IgG1 antistoffer.De samme tilstandene produserer imidlertid immunokonjugater med en grad av merking på 1,5 for murine IgG1-antistoffer. På grunn av lysfølsomheten til denne forbindelsen, er det viktig å holde alle reaksjoner i folie-dekket fartøy. Dette vil øke produktets totale utbytte.Selv om denne protokollen beskriver syntesen av PODS-DOTA, kan en lignende prosedyre brukes på et bredt spekter av potensielle laster, inkludert fluoroforer, toksiner og andre chelatorer. Denne metoden vil legge til rette for bygging av veldefinerte, homogene og svært stabile immunoconjugates som kan brukes i et bredt spekter av felt. Det er viktig å huske at iodometan lagt i trinn en av dette eksperimentet kan ha skadelige effekter, og bør derfor brukes i en røyk hette.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Syntese av Hypervalent jod Alkynyl Triflates for anvendelse av Generering Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Split-and-pool Syntese og karakterisering av Peptide Tertiær Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Den Bioconjugation og radiosynthesis av<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-merkede antistoffer

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protokoll for syntese av<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated anilinderivater

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntese og karakterisering av supra Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-en som en heterogen katalysator for syntese av Vanillin

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthesis of Worm-lignende Miceller av synlig lys mediert dispersjonspolymeriseringen Bruke Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntese og massespektrometri analyse av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Kjemisk nedbør metoden for syntese av Nb2O5 endret Bulk nikkel katalysatorer med høy bestemt areal

We demonstrate a method for the synthesis of NixNb1-xO catalysts with sponge-like and fold-like nanostructures. By varying the Nb:Ni ratio, a series of ...