Name: synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Os autores agradecer Dr. Sai Kiran Sharma conversas úteis.

1. a síntese de 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Nota: Devido à luz-sensibilidade do composto, mantenha todas as reacções em vasos de folha-cobertas.
<ol><li>Em um 10 mL redondo balão de fundo, dissolver 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalente) de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol em 3 mL de metanol.</li>
	<li>Para esta solução, adicionar 360 μL de diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 mmol; 4 equivalentes; anidro) e uma barra de agitação magnética pequena. Cubr...

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).</li><li>Agarwal, P., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody-drug+conjugates:+the+nexus+of+bioorthogonal+chemistry,+protein+engineering,+and+drug+development.">Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+1:+Cysteine+residues+and+glycans.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+2:+Peptide+tags+and+unnatural+amino+acids.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).</li><li>Alley, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+linker+stability+to+the+activities+of+anticancer+immunoconjugates.">Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+maleimide-thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shen, B. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Jackson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+cysteine+and+site+specific+conjugated+herceptin+antibody-drug+conjugates.">In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates.</a> Plos One. 9 (1), (2014).</li><li>Ponte, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+stability+of+the+thiol-maleimide+linkage+impacts+the+pharmacokinetics+of+lysine-linked+antibody-maytansinoid+conjugates.">Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).</li><li>Stimmel, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+on+serine+-&gt;+cysteine+variant+monoclonal+antibodies.">Site-specific conjugation on serine -&gt; cysteine variant monoclonal antibodies.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+kidney+uptake+in+radiometal+labeled+peptide+linkers+conjugated+to+recombinant+antibody+fragments.+site-specific+conjugation+of+DOTA-peptides+to+a+cys-diabody.">Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).</li><li>Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+bifunctional+chelator+BAT+to+mouse+IgG(1)+Fab'+fragment.">Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).</li><li>Tinianow, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+Zr-89-labeled+monoclonal+antibodies+for+ImmunoPET.">Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET.</a> Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+monodispersed+DOTA-PEGn+to+a+thiolated+diabody+reveals+the+effect+of+increasing+PEG+size+on+kidney+clearance+and+tumor+uptake+with+improved+64-copper+PET+imaging.">Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).</li><li>Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+binding+of+disulfide-bridged+PEG-Fabs.">Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).</li><li>Koniev, O., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+and+recent+advancements+in+the+field+of+endogenous+amino+acid+selective+bond+forming+reactions+for+bioconjugation.">Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation.</a> Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).</li><li>Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+serum+stability+of+site-specific+antibody+conjugates+with+sulfone+linkers.">Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).</li><li>Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+stable,+chemoselective+labeling+of+thiols+with+Julia-Kocienski-like+reagents:+A+serum-stable+alternative+to+maleimide-based+protein+conjugation.">Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Last-step+enzymatic+F-18-fluorination+of+cysteine-tethered+RGD+peptides+using+modified+Barbas+linkers.">Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers.</a> Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).</li><li>Chiotellis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemoselective+F-18-radiolabeling+of+thiol-containing+biomolecules+under+mild+aqueous+conditions.">Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions.</a> Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).</li><li>Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+bifunctional+chelators+for+the+creation+of+site-selectively+modified+radioimmunoconjugates+with+improved+stability.">Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability.</a> Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).</li><li>Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+the+intestinal+epithelium-related+antigen+A33,+a+cell+surface+target+for+antibody-based+imaging+and+treatment+in+gastrointestinal+cancer.">Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).</li><li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+a+cytotoxic+drug+to+an+antibody+improves+the+therapeutic+index.">Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li><li>Pillow, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+trastuzumab+maytansinoid+antibody-drug+conjugates+with+improved+therapeutic+activity+through+linker+and+antibody+engineering.">Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).</li><li>Boswell, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+modified+111In+labelled+antibodies+give+low+liver+backgrounds+and+improved+radioimmunoscintigraphy.">Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy.</a> Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).</li><li>Strop, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+matters:+SIte+of+conjugation+modulates+stability+and+pharmacokinetics+of+antibody+drug+conjugates.">Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates.</a> Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).</li><li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+HIV-1+tat+peptides+to+IgG:+a+potential+route+to+construct+radioimmunoconjugates+for+targeting+intracellular+and+nuclear+epitopes+in+cancer.">Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).</li></ol>

Neste relatório, decidimos não incluir quaisquer protocolos para experimentação radioativos ou in vivo. Nossos motivos são simples. No que diz respeito ao primeiro, o radioativos de uma immunoconjugate baseada em vagens não difere em tudo isso de um immunoconjugate sintetizado usando outras estratégias bioconjugation, e esses procedimentos têm sido exaustivamente analisado em outro lugar2 . No que diz respeito a último, as especificidades de pré-clínicos experimentos in vivo (i.e., mode...

Radiofarmacêuticos químicos têm explorado a seletividade e especificidade dos anticorpos para biomarcadores da doença para ambos imagem nuclear e direcionados a radioterapia1. Abordagem de longe o mais comum para o radioativos de anticorpos baseia-se a penhora indiscriminada de radiolabeled grupos prostético ou radiometal quelantes de aminoácidos — mais frequentemente lisinas — dentro da estrutura da imunoglobulina ( Figura 1A)2. Enquanto esta estratégia é certamente eficaz, sua natureza aleatória, não-local-específica pode criar problemas. Especificamente, bioconjugation tradicionais abordagens produzem mal definidos e immunoconjugates heterogêneo composto por misturas de milhares de regioisomers diferentes, cada um com seu próprio conjunto de propriedades biológicas e farmacológicas3. Além disso, bioconjugation aleatório pode impedir a imunorreatividade dos anticorpos se a carga é acrescentada aos domínios de antígeno-ligando a imunoglobulina.
Ao longo dos anos, uma variedade de estratégias de bioconjugation site-specific e local-seletiva foram desenvolvidos a fim de abordar estes problemas4,5. A mais comum dessas abordagens depende a ligadura de sondas de maleimide-rolamento aos grupos sulfidrila das cisteínas (figura 1B). Anticorpos IgG1 contêm naturalmente 4 pontes de dissulfeto inter cadeia, vínculos que podem ser seletivamente reduzidos para render capaz de sofrer reações de adição de Michael com maleimides para formar grufo Tioéter ligações grátis tióis. O uso de tióis e maleimides é, certamente, uma melhoria em relação a métodos tradicionais e uma grande variedade de synthons de maleimide-rolamento e quelantes bifuncionais estão atualmente disponíveis. No entanto, é importante notar que esta metodologia tem sérias limitações também. Immunoconjugates baseada em maleimide apresentam estabilidade limitada em vivo, pois a ligação Tioéter pode sofrer uma reação retrô-Michael (Figura 2),6,7,8,9, 10. isto, claro, pode levar à liberação de carga radioativa ou sua troca com biomoléculas thiol-rolamento em circulação (por exemplo, glutationa ou albumina). Ambos estes processos podem aumentar as concentrações de atividade em órgãos saudáveis bem como diminuir as concentrações de actividade em tecidos-alvo, resultando em menor contraste de imagem e inferiores relações terapêuticas. Vários reagentes thiol-reactivos alternativos foram desenvolvidos na tentativa de contornar esses problemas, incluindo tosylates, bromo e iodo-acetyls e vinil sulfonas11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. no entanto, todas essas abordagens têm limitações que têm dificultado a sua aplicação generalizada.
Há cinco anos, o laboratório do falecido Carlos Barbas III no Scripps Research Institute foi pioneira no uso de sulfonas de metil phenyloxadiazolyl como reagentes para a formação seletiva de ligações altamente estáveis com tióis (Figura 1 e Figura 3) 18 , 19. os autores empregou uma variante de sulfona-rolamento de metil phenyloxadiazolyl de fluoresceína para modificar diversos anticorpos projetados para conter resíduos de cisteína livre, em última análise, produzindo immunoconjugates com maior estabilidade do que o análogo construções criadas usando sondas baseadas em maleimide. Ao ver este trabalho promissor, ficamos um pouco surpresos que esta tecnologia só tinha sido usada raramente em radioquímica e não tinha ainda sido usada em tudo na síntese de quelantes bifuncionais ou radioimmunoconjugates20,21 . Esta escassez de aplicativos, no entanto, logo começou a fazer mais sentido: várias tentativas de adquirir o reagente da Sigma-Aldrich resultaram no recebimento de misturas complexas de produtos de degradação com < 15% do composto desejado. Além disso, sintetizar o reagente relatado nos não era uma opção realista também, como a rota sintética publicada é um pouco complicada e requer equipamento sofisticado de química orgânica que mais radioquímica e imagem molecular laboratórios — incluindo a nossa — simplesmente não possuem.
Em resposta a esses obstáculos, nos propusemos a criar uma facilmente acessível e altamente estável phenyloxadiazolyl reagente de sulfona de metila que pode ser obtido através de uma rota sintética robusta e razoavelmente fáceis. No início deste ano, informamos a criação de um modular, estável e facilmente acessível phenyloxadiazolyl metil sulfona reagente — apelidado de 'PODS' — como uma plataforma para bioconjugations tiol-baseado (Figura 1 e Figura 3)22. A principal diferença entre cápsulas e o reagente relatado por Barbas, et al é que o antigo emprega um anel da anilina anexado para o agrupamento de sulfona de metil phenyloxadiazolyl, enquanto este último dispõe de um fenol na mesma posição (Figura 4). Essa mudança facilita uma rota sintética mais simples e acessível, bem como — se nossa experiência com o composto comercialmente disponível é emblemática — um reagente final mais estável. Neste trabalho, nós também sintetizado um par de vagens-rolamento bifuncionais quelantes — PODS-DFO e vagens-CHX-A '-DTPA — para facilitar a criação de 89Zr - e 177Lu-rotulados radioimmunoconjugates, respectivamente. Como vamos discutir, temos demonstrado que bioconjugations local-seletiva baseada em vagens reproducibly e robustamente criar radioimmunoconjugates homogênea, bem definidas, altamente immunoreactive e altamente estável. Além disso, experimentos pré-clínicos em modelos murino de câncer colorretal demonstraram que estes site-seletivamente rotulado radioimmunoconjugates exposição superior desempenho in vivo comparado ao radiolabeled anticorpos sintetizados através de baseado em maleimide conjugações.
O over-arching objetivo deste trabalho é facilitar a criação de immunoconjugates bem definidas, homogêneas, altamente estável e altamente immunoreactive para aplicações in vitro e in vivo. A abordagem sintética é bastante simples de ser realizada em quase qualquer laboratório, e o reagente de vagens do pai pode ser modificado com uma infinidade de diferentes quelantes, fluorophores ou cargas. No presente protocolo e o vídeo que acompanha, descreveremos a síntese simples, quatro etapas de vagens (Figura 5); a criação de uma variante de vagens-rolamento do DOTA, um quelante amplamente utilizado para a coordenação de 64Cu, 68Ga, 111, em 177Lu e 225Ac (Figura 6); e o bioconjugation de vagens-DOTA de um anticorpo de modelo, o Trastuzumabe HER2-direcionamento IgG1 (Figura 7).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>925000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EN300000141G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C556-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC383780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diisopropylethylamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>150915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-727-5100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E145 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413485000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-chloroperbenzoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>273031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBoc-N&#8242;-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>671401</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#8242;- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10&#215; Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates

Maleimide-rolamento bifuncionais sondas têm sido empregadas há décadas para a modificação de local-seletiva de tióis em biomoléculas, especialmente de anticorpos. Ainda conjugados com base em maleimide exibem limitada estabilidade in vivo, porque a ligação Tioéter de grufo pode sofrer uma reação retrô-Michael. Isso, claro, pode levar à liberação de carga radioativa ou sua troca com biomoléculas thiol-rolamento em circulação. Ambos estes processos podem produzir concentrações elevadas de atividade em órgãos saudáveis bem como diminuíram a concentrações de actividade em tecidos-alvo, resultando em menor contraste de imagem e inferiores relações terapêuticas. Em 2018, informamos a criação de um modular, estável e facilmente acessível phenyloxadiazolyl metil sulfona reagente — apelidado de 'PODS' — como uma plataforma para bioconjugations tiol-baseado. Temos claramente demonstrado que bioconjugations local-seletiva baseada em vagens reproducibly e robustamente criar radioimmunoconjugates homogênea, bem definidas, altamente immunoreactive e altamente estável. Além disso, experimentos pré-clínicos em modelos murino de câncer colorretal demonstraram que estes site-seletivamente rotulado radioimmunoconjugates exposição muito superior desempenho in vivo em comparação com radiolabeled anticorpos sintetizados através de baseada em maleimide conjugações. Neste protocolo, descreveremos a síntese de quatro etapas de vagens, a criação de uma variante de vagens-rolamento bifuncional do quelante onipresente DOTA (PODS-DOTA) e a conjugação de vagens-DOTA para o direcionamento de HER2-anticorpo Trastuzumabe.

As quatro primeiras etapas deste protocolo — a síntese de vagens — ter sido projetado para ser robusto e confiável. A deprotonação e substituição de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol para formar o produto desejado Tioéter proporciona o Tioéter em > 99% de rendimento após apenas 45 minutos. Em seguida, a ligadura entre 1 e N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine foi conseguida através de um peptídeo padrão procedimento de acoplamento,...

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Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Síntese e Bioconjugation dos reagentes Thiol-reativa para a criação de Site-seletivamente modificado Immunoconjugates

Neste protocolo, descreveremos a síntese de vagens, phenyoxadiazolyl metil sulfona-baseado reagente para a ligação local-seletivo de cargas para os tióis de biomoléculas, especialmente de anticorpos. Além disso, descreveremos a síntese e caracterização de um quelante bifuncional PODS-rolamento e sua conjugação com um anticorpo de modelo.

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Este protocolo descreve a síntese e a aplicação do PODS, um novo reagente para a bioconjugação específica do local de proteínas e peptídeos. Esta tecnologia representa uma melhoria acentuada em relação às bioconjugações tradicionais baseadas em maleimida-thiol. A maior vantagem deste procedimento é a simplicidade com que o reagente é feito.O método permite que o reagente seja sintetizado em praticamente qualquer laboratório. Em um frasco de fundo redondo de 10 mililitros, dissolva 100 miligramas do aminofenil oxadiazole thiol em três mililitros de metanol. À solução, adicione 360 microliters de diisopropiletilamina e uma barra de agitação magnética.Sele o frasco com uma rolha de borracha e mexa a solução por 10 minutos em temperatura ambiente. Usando uma seringa de vidro de um mililitro, faça um furo através da rolha de borracha e adicione rapidamente 32 microliters de iodometano à mistura. Deixe a mistura reagir por 45 minutos em temperatura ambiente.Em um frasco de fundo redondo de 25 mililitros, dissolva 387 miligramas do ácido carboxílico protegido pelo bocha em 10 mililitros de diclorometano. À solução, adicione 480 microlitadores de diisopropiletilamina, 264 miligramas de EDCI, 200 miligramas da anilina e uma barra de agitação magnética. Sele o frasco com uma rolha de vidro e deixe a reação agitar por cinco dias à temperatura ambiente.Uma vez que a reação esteja completa, transfira a mistura de reação para um funil separador, e lave três vezes com cinco mililitros de ácido clorídrico de um molar. Recolher a fase orgânica e transferi-la para o funil separador. Em seguida, lave a fase orgânica com carbonato de sódio de um molar seguido de água.Em seguida, colete a fase orgânica e adicione sulfato de magnésio para remover quaisquer vestígios de água. Em seguida, filtre a mistura usando um frito de vidro médio. Usando um evaporador rotativo, remova os solventes voláteis sob pressão reduzida para pagar um sólido off-white.Na sequência, ressola o sólido isolado em 10 mililitros de acetato etílico. Em seguida, precipitar o produto através da adição gradual de 30 mililitros de ciclohexano. Filtre a solução usando um frit de vidro médio para obter o produto carbamate como pó branco.Em um frasco de fundo redondo de 10 mililitros, dissolva 30 miligramas do carbamate em quatro mililitros de diclorometano. Adicione lentamente 49 miligramas de ácido cloroperbenómico de 70%m e uma barra de agitação magnética à mistura, e sele o frasco com uma rolha de vidro. Mexa a solução durante a noite à temperatura ambiente, resultando em uma mistura amarela.No dia seguinte, transfira a mistura para um funil separador. Em seguida, lave a mistura com hidróxido de sódio de 0,1 molar seguido de água. Colete a fase orgânica e adicione sulfato de magnésio para remover quaisquer vestígios de água.Em seguida, filtre a mistura usando um frito de vidro médio. Em um frasco de fundo redondo de 25 mililitros, dissolva 30 miligramas do carbamate em dois mililitros de diclorometano. Adicione uma barra de mexiça magnética à mistura.E 400 microliters de ácido trifluoroacético e selar o frasco com uma rolha de vidro. Em seguida, mexa a mistura de reação à temperatura ambiente por três horas. Uma vez que a reação esteja completa, remova os voláteis sob pressão reduzida à temperatura ambiente usando um evaporador rotativo para obter um resíduo oleoso.Dissolva o resíduo oleoso em sete mililitros de água. E transferir para um funil separador. Lave a solução aquosa três vezes com quatro mililitros de acetato etílico.Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, dissolva 10 miligramas de PODS e 300 microliters de sulfóxido de dimetil. Em seguida, adicione 26 microlitadores de N, N-diisopropiletilamina à solução. Dissolva 15,2 miligramas de DOTA NCS em 100 microliters de sulfóxido de dimetil e combine a solução com a solução PODS.Sele o tubo de microcentrifuuge e permita que a reação incubar durante a noite à temperatura ambiente. Em seguida, diluir 61 microliters de uma solução de estoque trastuzumabe com 859 microliters de PBS em um tubo de microcentrifuge de baixa proteína de ligação de 1,5 mililitro. Nessa mistura, adicione 6,7 microliters de uma solução recém-feita de 10 mililitros de TCEP na água.Adicione 73 microliters de uma solução PODS-DOTA de um miligrama à mistura de reação. Por fim, sele o tubo de microcentrifuuagem e incuba a solução por duas horas em temperatura ambiente. A síntese do PODS é robusta e confiável.A desproteína e a substituição do aminofenil oxadiazole thiol proporcionou outra em rendimento quantitativo. A ligadura de tither um e o ácido carboxílico protegido por bocha produziu composto dois em rendimento de 55%. Oxidação proporcionada composto três em rendimento de 90%.E a remoção do grupo de proteção de bocs rendeu PODS em rendimento de 98%. A identidade de cada produto foi confirmada via NMR de próton, NMR de carbono e MS de alta resolução. Uma variante isothiocianato do dota chelator foi acoplado ao pingente amina de PODS para obter o chelator bifunctional em rendimento de 75%. A identidade do produto foi confirmada via NMR de próton, NMR de carbono e MS de alta resolução. A bioconjugação seletiva do pods-DOTA para o trastuzumabe de anticorpos de alvo HER2 é mostrada aqui.As ligações dissulfetos da região da dobradiça do anticorpo foram seletivamente reduzidas, e o anticorpo foi então incubado com PODS-DOTA para pagar ao imunoconjugado portador de DOTA um rendimento de 80%. A análise MALDI-TOF revelou um grau de rotulagem de 1,8 DOTA por anticorpo. O que permanece consistente em uma gama de anticorpos IgG1 humanos, humanizados e quiméricos.No entanto, as mesmas condições produzem imunoconjugados com um grau de rotulagem de 1,5 para anticorpos murine IgG1. Devido à sensibilidade à luz deste composto, é importante manter todas as reações em vasos cobertos de papel alumínio. Isso aumentará o rendimento global do produto.Embora este protocolo descreva a síntese de PODS-DOTA, um procedimento semelhante pode ser aplicado a uma ampla gama de cargas potenciais, incluindo fluoroforos, toxinas e outros queladores. Este método facilitará a construção de imunoconjugados bem definidos, homogêneos e altamente estáveis que podem ser usados em uma ampla variedade de campos. É importante lembrar que o iodometano adicionado na primeira etapa deste experimento pode ter efeitos nocivos e, portanto, deve ser usado em um capuz de fumaça.

Research

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Chemistry

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Síntese de hipervalente iodónio Alquinilo triflatos de Aplicação de Geração Cyanocarbenes

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Química

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Síntese Split-and-Pool e Caracterização de Biblioteca de Peptídeo de Amida Terciária

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

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O bioconjugação e radiossíntese de 89 Anticorpos Zr-DFO-rotulados

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

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Protocolo para a Síntese de Derivados de Anilina Orto-trifluorometoxilados

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