Name: synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Авторы благодарят доктор Sai Kiran Шарма за полезные беседы.

1. синтез 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Примечание: Из-за света чувствительность комплекса, держите все реакции в фольги, покрытой судов.
<ol><li>В 10 мл вокруг нижней колбе, растворить 100 мг (0,517 ммоль, эквивалентный 1) 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol в 3 мл метанола.</li>
	<li>В этот раствор до?...

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).</li><li>Agarwal, P., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody-drug+conjugates:+the+nexus+of+bioorthogonal+chemistry,+protein+engineering,+and+drug+development.">Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+1:+Cysteine+residues+and+glycans.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+2:+Peptide+tags+and+unnatural+amino+acids.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).</li><li>Alley, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+linker+stability+to+the+activities+of+anticancer+immunoconjugates.">Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+maleimide-thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shen, B. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Jackson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+cysteine+and+site+specific+conjugated+herceptin+antibody-drug+conjugates.">In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates.</a> Plos One. 9 (1), (2014).</li><li>Ponte, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+stability+of+the+thiol-maleimide+linkage+impacts+the+pharmacokinetics+of+lysine-linked+antibody-maytansinoid+conjugates.">Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).</li><li>Stimmel, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+on+serine+-&gt;+cysteine+variant+monoclonal+antibodies.">Site-specific conjugation on serine -&gt; cysteine variant monoclonal antibodies.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+kidney+uptake+in+radiometal+labeled+peptide+linkers+conjugated+to+recombinant+antibody+fragments.+site-specific+conjugation+of+DOTA-peptides+to+a+cys-diabody.">Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).</li><li>Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+bifunctional+chelator+BAT+to+mouse+IgG(1)+Fab'+fragment.">Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).</li><li>Tinianow, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+Zr-89-labeled+monoclonal+antibodies+for+ImmunoPET.">Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET.</a> Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+monodispersed+DOTA-PEGn+to+a+thiolated+diabody+reveals+the+effect+of+increasing+PEG+size+on+kidney+clearance+and+tumor+uptake+with+improved+64-copper+PET+imaging.">Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).</li><li>Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+binding+of+disulfide-bridged+PEG-Fabs.">Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).</li><li>Koniev, O., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+and+recent+advancements+in+the+field+of+endogenous+amino+acid+selective+bond+forming+reactions+for+bioconjugation.">Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation.</a> Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).</li><li>Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+serum+stability+of+site-specific+antibody+conjugates+with+sulfone+linkers.">Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).</li><li>Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+stable,+chemoselective+labeling+of+thiols+with+Julia-Kocienski-like+reagents:+A+serum-stable+alternative+to+maleimide-based+protein+conjugation.">Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Last-step+enzymatic+F-18-fluorination+of+cysteine-tethered+RGD+peptides+using+modified+Barbas+linkers.">Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers.</a> Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).</li><li>Chiotellis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemoselective+F-18-radiolabeling+of+thiol-containing+biomolecules+under+mild+aqueous+conditions.">Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions.</a> Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).</li><li>Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+bifunctional+chelators+for+the+creation+of+site-selectively+modified+radioimmunoconjugates+with+improved+stability.">Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability.</a> Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).</li><li>Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+the+intestinal+epithelium-related+antigen+A33,+a+cell+surface+target+for+antibody-based+imaging+and+treatment+in+gastrointestinal+cancer.">Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).</li><li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+a+cytotoxic+drug+to+an+antibody+improves+the+therapeutic+index.">Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li><li>Pillow, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+trastuzumab+maytansinoid+antibody-drug+conjugates+with+improved+therapeutic+activity+through+linker+and+antibody+engineering.">Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+tumor+retention+of+a+radiohalogen+label+for+site-specific+modification+of+antibodies.">Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+drug+conjugation+on+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+of+anti-STEAP1+antibody-drug+conjugates+in+rats.">Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).</li><li>Alvarez, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+modified+111In+labelled+antibodies+give+low+liver+backgrounds+and+improved+radioimmunoscintigraphy.">Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy.</a> Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).</li><li>Strop, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+matters:+SIte+of+conjugation+modulates+stability+and+pharmacokinetics+of+antibody+drug+conjugates.">Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates.</a> Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).</li><li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugates+with+unnatural+amino+acids.">Antibody conjugates with unnatural amino acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li><li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+site-specific+antibody-drug+conjugates+using+unnatural+amino+acids.">Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodate+oxidation+of+methionine+in+proteines.">Periodate oxidation of methionine in proteines.</a> Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+methionine+oxidation+in+human+IgG1+Fc+on+serum+half-life+of+monoclonal+antibodies.">Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).</li><li>O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+labeling+immunoglobulins+by+conjugation+to+oligosaccharide+moieties.">A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties.</a> Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).</li><li>Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody+drug+conjugates+for+cancer+therapy.">Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy.</a> Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).</li><li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+HIV-1+tat+peptides+to+IgG:+a+potential+route+to+construct+radioimmunoconjugates+for+targeting+intracellular+and+nuclear+epitopes+in+cancer.">Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).</li></ol>

В настоящем докладе мы решили не включать любые протоколы для radiolabeling или в естественных условиях экспериментов. Причины просты. Что касается первого, radiolabeling на основе СТРУЧКИ immunoconjugate не отличается от того из immunoconjugate, синтезируются с помощью других bioconjugation стратегии, и эти процедуры б...

Радиофармацевтические химики давно эксплуатируемых избирательности и специфичность антител для биомаркеров болезни для обеих ядерных изображений и целевых радиотерапии1. Далеко и прочь наиболее общий подход к radiolabeling антител основывается на неизбирательное придание radiolabeled протезно групп или radiometal энтеросорбенты аминокислоты — наиболее часто lysines — в рамках структуры иммуноглобулина ( Рисунок 1A)2. Хотя эта стратегия является безусловно эффективным, его случайные, сайт неспецифический характер может создать проблемы. В частности традиционные bioconjugation подходы производят плохо определены и гетерогенных immunoconjugates состоит из смеси тысяч различных regioisomers, каждый со своим собственным набором биологических и фармакологические свойства3. Кроме того случайных bioconjugation могут препятствовать иммунореактивности антител, если груз добавляется иммуноглобулина антиген связывая доменов.
С годами разнообразные bioconjugation участкам и сайт селективные стратегии были разработаны с целью решения этих проблем4,5. Наиболее распространенные из этих подходов основывается на лигирование maleimide подшипник зондов сульфгидрильных групп, по которым (рис. 1B). IgG1 антитела естественно содержат 4 Интер цепи дисульфидных мостов, связей, которые могут быть выборочно сведены к дают бесплатные тиолы способных претерпевает Майкл реакции с малеинимидов в форме succinimidyl тиоэфиры облигаций. Использование тиолами и малеинимидов, безусловно, улучшение по сравнению с традиционными методами и широкий спектр maleimide подшипник синтонов и бифункциональных хелаторов в настоящее время доступны. Однако важно отметить, что эта методология имеет также серьезные ограничения. На основе Maleimide immunoconjugates выставку ограниченное стабильности в естественных условиях, потому что тиоэфиры связь может пройти ретро Майкл реакции (рис. 2)6,,78,9, 10. это, конечно, может привести к выпуска радиоактивных полезных данных или обмен с биомолекулами тиоловых подшипник в обращении (например, глутатион или альбумина в сыворотке крови). Оба из этих процессов можно увеличения концентрации деятельности в здоровых органов, а также уменьшение концентрации деятельности в тканях-мишенях, обусловило уменьшение контрастность изображений и ниже терапевтические показатели. Были разработаны несколько альтернативных тиоловых реактивной реагентов в попытке обойти эти проблемы, включая tosylates, bromo - и Иодо acetyls и винил сульфонов11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Однако все эти подходы имеют ограничения, которые препятствуют их широкое применение.
Около пяти лет назад, в лаборатории в конце Карлос Barbas III научно-исследовательском институте Скриппса пионером в использовании phenyloxadiazolyl метил сульфонов как реагенты для селективного формирования высокостабильных связей с тиолами (Рисунок 1 c и рис. 3) 18 , 19. авторы заняты phenyloxadiazolyl метил сульфон подшипник вариант флуоресцеин изменить несколько антител, спроектирован, чтобы содержать остатки свободной цистеина, в конечном счете производства immunoconjugates с более высокой стабильности, чем аналогичные конструкции, созданные с помощью датчиков на основе maleimide. Увидев этой перспективной работы, мы были несколько удивлены тем, что эта технология использовалась только вряд в радиохимии и еще не было вообще используется в синтезе бифункциональных хелаторов или radioimmunoconjugates20,21 . Эта нехватка приложений, однако, вскоре начал делать больше смысла: несколько попыток закупки реагент от Sigma-Aldrich привело к получения сложных смесей продуктов разложения с < 15% нужного соединения. Кроме того, обобщение сообщенных реагент себя был не является реалистичным вариантом либо, как опубликованные синтетических маршрут несколько громоздкой и требует сложных органической химии оборудование, большинство радиохимии и Молекулярное воображение лаборатории — включая ours — просто не обладают.
В ответ на эти препятствия мы намереваемся создать легко доступны и очень стабильной phenyloxadiazolyl метил сульфона реагент, который может быть получен через надежную и разумно снисходительный синтетических маршрут. Ранее в этом году, мы сообщили создание модульный, стабильный и легко доступны phenyloxadiazolyl метил сульфона реагент — называли «СТРУЧКИ» — как платформы на основе тиоловых bioconjugations (Рисунок 1 c и рис. 3)22. Ключевое различие между СТРУЧКИ и реагент сообщил Barbas, et al. является, что бывший использует анилин кольцо, прикрепленное к phenyloxadiazolyl метил сульфона остаток, в то время как последняя имеет фенола в таком же положении (рис. 4). Это изменение облегчает более простой и доступной синтетических маршрутов, а также — если наш опыт с коммерчески доступные соединения является символом — более стабильной окончательный реагент. В этой работе, мы также синтезируется пару СТРУЧКИ подшипник бифункциональных хелаторов — СТРУЧКИ-ДФО и СТРУЧКИ-CHX-A''-DTPA — содействовать созданию 89Zr - и 177Лу меченых radioimmunoconjugates, соответственно. Как мы будем обсуждать, мы продемонстрировали, что на основе СТРУЧКИ сайт селективного bioconjugations можно воспроизвести и энергично создать однородную, четко определенных, весьма иммунореактивных и высокостабильных radioimmunoconjugates. Кроме того доклинические эксперименты в мышиных моделях колоректального рака показали, что эти сайт выборочно помечены radioimmunoconjugates выставку Улучшенный в естественных условиях производительности по сравнению с radiolabeled антитела синтезируются через на основе maleimide спряжения.
Сквозные цель этой работы заключается в содействии созданию четко, однородной, очень стабильный и высоко иммунореактивных immunoconjugates для приложений в vitro и in vivo. Синтетический подход является достаточно простым, чтобы выполняться в почти любой лаборатории, и родитель СТРУЧКИ реагента могут быть изменены с множеством различных энтеросорбенты, флуорофоров или грузов. В этот протокол и сопровождающих видео мы будем описывать простые, четырехступенчатая синтез СТРУЧКИ (рис. 5); Создание СТРУЧКИ подшипник вариант DOTA, широко используемый хелатором для координации 64Cu, 68Ga, 111, 177Лу и 225переменного тока (рис. 6); и bioconjugation СТРУЧКИ-DOTA в модели антитела, трастузумаб HER2-таргетинг IgG1 (рис. 7).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>925000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EN300000141G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C556-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC383780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diisopropylethylamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>150915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-727-5100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E145 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413485000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-chloroperbenzoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>273031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBoc-N&#8242;-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>671401</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#8242;- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10&#215; Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates

Maleimide подшипник бифункциональных зонды были использованы на протяжении десятилетий для сайта селективные модификации тиолы в биомолекулы, особенно антител. Еще на основе maleimide конъюгатов отображения ограниченное стабильности в естественных условиях, потому что succinimidyl тиоэфиры связь может пройти ретро Майкл реакции. Это, конечно, может привести к выпуска радиоактивных полезных данных или обмена с биомолекулами тиоловых подшипник в обращении. Оба этих процессов может производить повышенной активности концентрации в здоровых органов, а также снижение активности концентрации в тканях-мишенях, обусловило уменьшение контрастность изображений и ниже терапевтические показатели. В 2018 году, мы сообщили создание модульный, стабильный и легко доступны phenyloxadiazolyl метил сульфона реагент — называли «СТРУЧКИ» — как платформы на базе тиоловых bioconjugations. Мы наглядно продемонстрировали, что на основе СТРУЧКИ сайт селективного bioconjugations можно воспроизвести и энергично создать однородную, четко определенных, весьма иммунореактивных и высокостабильных radioimmunoconjugates. Кроме того доклинические эксперименты в мышиных моделях колоректального рака показали, что эти сайт выборочно помечены radioimmunoconjugates выставка намного превосходят в естественных условиях производительности по сравнению с radiolabeled антитела синтезируются через на основе maleimide спряжения. В этом протоколе мы будем описывать четырехступенчатая синтез СТРУЧКИ, создание бифункциональных СТРУЧКИ подшипник вариант вездесущие хелатором DOTA (СТРУЧКИ-DOTA) и спряжение СТРУЧКИ-DOTA к трастузумаб HER2-таргетинг антитела.

Первые четыре шага этого протокола — синтез СТРУЧКИ — были разработаны для быть прочным и надежным. Deprotonation и замена 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol сформировать желаемый тиоэфиры продукта дает тиоэфиры в > 99% доходности после всего за 45 минут. Далее перевязка между 1 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Синтез и Bioconjugation тиоловых реактивной реагентов для создания сайта выборочно изменять Immunoconjugates

В этом протоколе мы будем описывать синтез СТРУЧКИ, phenyoxadiazolyl метил на основе сульфона реагент для сайта селективные крепление грузов тиолы биомолекул, особенно антител. Кроме того мы будем описывать синтеза и характеристика бифункциональных хелатором СТРУЧКИ подшипника и его спряжение модель антитела к.

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Этот протокол описывает синтез и применение PODS, новый реагент для сайта конкретных биоконъюгации белков и пептидов. Эта технология представляет собой заметное улучшение по сравнению с традиционными биосюргациями на основе малеймид-тиола. Самым большим преимуществом этой процедуры является простота, с которой изготовлен реагент.Метод позволяет синтезировать реагент практически в любой лаборатории. В 10-миллилитровой круглой нижней колбе растворяют 100 миллиграммов аминокислоты оксадиазол тиол в трех миллилитров метанола. К раствору добавьте 360 микролитров диизопропилэтиламина и магнитный батончик.Запечатайте колбу резиновой пробкой и перемешайте раствор в течение 10 минут при комнатной температуре. Используя одноми миллилитровый стеклянный шприц, проткните отверстие через резиновую пробку и быстро добавьте в смесь 32 микролитров идометанов. Разрешить смесь реагировать в течение 45 минут при комнатной температуре.В 25-миллилитровой колбе круглого дна растворите 387 миллиграммов защищенной боком карбоксиновой кислоты в 10 миллилитров дихлорметана. К раствору добавьте 480 микролитров диизопропилетиламина, 264 миллиграмма ЭДКИ, 200 миллиграммов анилина и магнитного батончика. Запечатайте колбу стеклянной пробкой и дайте реакции перемешать в течение пяти дней при комнатной температуре.Как только реакция будет завершена, перенесите реакционной смеси в сепараторную воронку, и мыть три раза с пятью миллилитров одной молярной соляной кислоты. Соберите органическую фазу и перенесите ее в разделительную воронку. Затем промойте органическую фазу одномолярным карбонатом натрия, за которым последует вода.Затем соберите органическую фазу и добавьте сульфат магния, чтобы удалить любые следы воды. Затем профильтруйте смесь с помощью среднего стеклянного фрита. Используя роторный испаритель, удалите летучие растворители под пониженным давлением, чтобы позволить себе небелый твердый.После этого, redissolve изолированных твердых в 10 миллилитров этилового ацетата. Затем осаждают продукт через постепенное добавление 30 миллилитров циклохексана. Фильтр решение с помощью среднего стекла фрит для получения продукта карбамат в качестве белого порошка.В 10-миллилитровой круглой нижней колбе растворяют 30 миллиграммов карбамата в четырех миллилитров дихлорметана. Медленно добавьте в смесь 49 миллиграммов 70%-м-хлоропербензойной кислоты и магнитного батончика, и запечатайте колбу стеклянной пробкой. Перемешать раствор на ночь при комнатной температуре, в конечном итоге уступая желтую смесь.На следующий день перенесите смесь в сепараторную воронку. Затем промыть смесь 0,1-молярным гидроксидом натрия, а затем водой. Соберите органическую фазу и добавьте сульфат магния, чтобы удалить любые следы воды.Затем профильтруйте смесь с помощью среднего стеклянного фрита. В 25-миллилитровой круглой нижней колбе растворяют 30 миллиграммов карбамата в двух миллилитров дихлорметана. Добавить магнитный бар перемешать в смеси.И 400 микролитров трифтороацетической кислоты и запечатать колбу стеклянной пробкой. Затем перемешать реакционной смеси при комнатной температуре в течение трех часов. Как только реакция завершена, удалите летучие веществ под пониженным давлением при комнатной температуре с помощью роторного испарителя для получения масляных остатков.Растворите масляные остатки в семи миллилитров воды. И перенесите в разделительную воронку. Вымойте аковый раствор три раза с четырьмя миллилитров этилового ацетата.В 1,5-миллилитровой микроцентрифуге трубки растворяют 10 миллиграммов PODS и 300 микролитров диметилсульфида. Затем добавьте в раствор 26 микролитров N, N-diisopropylethylamine. Растворите 15,2 миллиграмма DOTA NCS в 100 микролитров диметилфоксида и объедините раствор с раствором PODS.Печать микроцентрифуг трубки, и позволяют реакции инкубировать на ночь при комнатной температуре. Далее разбавляют 61 микролитром раствора trastuzumab с 859 микролитров PBS в низко белке-связывающей 1,5-миллилитровой микроцентрифуге трубки. К этой смеси добавьте 6,7 микролитров свежеприготовленного 10-миллимолярского раствора TCEP в воду.Добавьте в реакционной смеси 73 микролитров раствора PODS-DOTA по 1 миллиграмму на миллилитр. Наконец, запечатать трубку микроцентрифуга и инкубировать раствор в течение двух часов при комнатной температуре. Синтез PODS является надежным и надежным.Депротеинация и замена аминофенил оксадиазола тиола позволили thioether один в количественной урожайности. Лигация thioether один и бок-защищенной карбоксиновой кислоты дали соединение два в 55%yield. Окисление позволило соединения три в 90% урожайности.А удаление группы, защищающей бока, дало PODS в 98%-ной урожайности. Идентификация каждого продукта была подтверждена с помощью протонной ЯМР, углерода ЯМР и ms с высоким разрешением. Изотиоцианат-несущий вариант хелатора DOTA был соединен с подвесным амином PODS для получения двухфункционального хелатора в 75%-ной урожайности. Личность продукта была подтверждена с помощью протонной ЯМР, углерода ЯМР и MS с высоким разрешением. Сайт-селективной биосюджации PODS-DOTA к HER2-таргетинга антитела trastuzumab показано здесь.Дисульфидные связи шарнирной области антитела были выборочно уменьшены, и антитела затем инкубировали с PODS-DOTA, чтобы позволить себе DOTA-несущий иммуноконъюгировать 80% урожайности. Анализ MALDI-TOF показал степень маркировки 1,8 DOTA на антитело. Который остается последовательным по всему спектру человеческих, гуманизированных и химерных антител IgG1.Тем не менее, те же условия производят иммуноконъюгации со степенью маркировки 1,5 для murine IgG1 антител. Из-за светочувствительность этого соединения, важно, чтобы сохранить все реакции в фольге покрытые сосуды. Это увеличит общую урожайность продукта.Хотя этот протокол описывает синтез PODS-DOTA, аналогичная процедура может быть применена к широкому кругу потенциальных грузов, включая фторфоры, токсины и другие хелаторы. Этот метод облегчит строительство четко определенных, однородных и высококонституальных иммуноконъюгированных препаратов, которые могут быть использованы в самых различных областях. Важно помнить, что идометан добавил в шаге один из этого эксперимента может иметь вредные последствия, и поэтому должны быть использованы в дым капот.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Синтез гипервалентных иодония Алкинил трифлаты по применению генерирующая Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Сплит-и-бассейн Синтез и свойства пептида третичный амид библиотеки

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Биоконъюгации и Radiosynthesis из<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-ДФО меченых антител

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Протокол синтеза<em&gt; Орто</em&gt; -trifluoromethoxylated анилина

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Синтез и характеристика супрамолекулярных коллоидов

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-1 в качестве гетерогенного катализатора для синтеза ванилина

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Синтез червеобразных мицелл с помощью видимого света опосредованного дисперсионной полимеризации с использованием Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Синтез и анализ масс-спектрометрии Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Метод химического осаждения для синтеза Nb2O5 изменение массовых никель катализаторов с высокой удельной площади поверхности

We demonstrate a method for the synthesis of NixNb1-xO catalysts with sponge-like and fold-like nanostructures. By varying the Nb:Ni ratio, a series of ...