Name: synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Los autores agradecen Dr. Sai Kiran Sharma conversaciones útiles.

1. la síntesis de 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Nota: Debido a la sensibilidad a la luz de la sustancia, mantenga todas las reacciones en los vasos cubiertos de papel de aluminio.
<ol><li>De 10 mL redondo matraz de fondo, disolver 100 mg (0.517 mmol, 1 equivalente) de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol en 3 mL de metanol.</li>
	<li>A esta solución, añadir 360 μL de diisopropylethylamine (DIPEA; 2.07 mmol; 4 equivalentes; anhidro) y una barra de agitación ma...

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).</li><li>Agarwal, P., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody-drug+conjugates:+the+nexus+of+bioorthogonal+chemistry,+protein+engineering,+and+drug+development.">Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+1:+Cysteine+residues+and+glycans.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+2:+Peptide+tags+and+unnatural+amino+acids.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).</li><li>Alley, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+linker+stability+to+the+activities+of+anticancer+immunoconjugates.">Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+maleimide-thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shen, B. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Jackson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+cysteine+and+site+specific+conjugated+herceptin+antibody-drug+conjugates.">In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates.</a> Plos One. 9 (1), (2014).</li><li>Ponte, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+stability+of+the+thiol-maleimide+linkage+impacts+the+pharmacokinetics+of+lysine-linked+antibody-maytansinoid+conjugates.">Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).</li><li>Stimmel, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+on+serine+-&gt;+cysteine+variant+monoclonal+antibodies.">Site-specific conjugation on serine -&gt; cysteine variant monoclonal antibodies.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+kidney+uptake+in+radiometal+labeled+peptide+linkers+conjugated+to+recombinant+antibody+fragments.+site-specific+conjugation+of+DOTA-peptides+to+a+cys-diabody.">Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).</li><li>Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+bifunctional+chelator+BAT+to+mouse+IgG(1)+Fab'+fragment.">Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).</li><li>Tinianow, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+Zr-89-labeled+monoclonal+antibodies+for+ImmunoPET.">Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET.</a> Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+monodispersed+DOTA-PEGn+to+a+thiolated+diabody+reveals+the+effect+of+increasing+PEG+size+on+kidney+clearance+and+tumor+uptake+with+improved+64-copper+PET+imaging.">Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).</li><li>Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+binding+of+disulfide-bridged+PEG-Fabs.">Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).</li><li>Koniev, O., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+and+recent+advancements+in+the+field+of+endogenous+amino+acid+selective+bond+forming+reactions+for+bioconjugation.">Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation.</a> Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).</li><li>Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+serum+stability+of+site-specific+antibody+conjugates+with+sulfone+linkers.">Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).</li><li>Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+stable,+chemoselective+labeling+of+thiols+with+Julia-Kocienski-like+reagents:+A+serum-stable+alternative+to+maleimide-based+protein+conjugation.">Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Last-step+enzymatic+F-18-fluorination+of+cysteine-tethered+RGD+peptides+using+modified+Barbas+linkers.">Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers.</a> Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).</li><li>Chiotellis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemoselective+F-18-radiolabeling+of+thiol-containing+biomolecules+under+mild+aqueous+conditions.">Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions.</a> Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).</li><li>Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+bifunctional+chelators+for+the+creation+of+site-selectively+modified+radioimmunoconjugates+with+improved+stability.">Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability.</a> Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).</li><li>Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+the+intestinal+epithelium-related+antigen+A33,+a+cell+surface+target+for+antibody-based+imaging+and+treatment+in+gastrointestinal+cancer.">Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).</li><li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+a+cytotoxic+drug+to+an+antibody+improves+the+therapeutic+index.">Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li><li>Pillow, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+trastuzumab+maytansinoid+antibody-drug+conjugates+with+improved+therapeutic+activity+through+linker+and+antibody+engineering.">Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+tumor+retention+of+a+radiohalogen+label+for+site-specific+modification+of+antibodies.">Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+drug+conjugation+on+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+of+anti-STEAP1+antibody-drug+conjugates+in+rats.">Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).</li><li>Alvarez, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+modified+111In+labelled+antibodies+give+low+liver+backgrounds+and+improved+radioimmunoscintigraphy.">Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy.</a> Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).</li><li>Strop, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+matters:+SIte+of+conjugation+modulates+stability+and+pharmacokinetics+of+antibody+drug+conjugates.">Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates.</a> Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).</li><li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugates+with+unnatural+amino+acids.">Antibody conjugates with unnatural amino acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li><li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+site-specific+antibody-drug+conjugates+using+unnatural+amino+acids.">Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodate+oxidation+of+methionine+in+proteines.">Periodate oxidation of methionine in proteines.</a> Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+methionine+oxidation+in+human+IgG1+Fc+on+serum+half-life+of+monoclonal+antibodies.">Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).</li><li>O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+labeling+immunoglobulins+by+conjugation+to+oligosaccharide+moieties.">A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties.</a> Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).</li><li>Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody+drug+conjugates+for+cancer+therapy.">Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy.</a> Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).</li><li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+HIV-1+tat+peptides+to+IgG:+a+potential+route+to+construct+radioimmunoconjugates+for+targeting+intracellular+and+nuclear+epitopes+in+cancer.">Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).</li></ol>

En este informe, hemos decidido no incluir cualquier protocolos de experimentación radiolabeling o en vivo. Las razones son sencillas. Con respecto al anterior, radiolabeling de un immunoconjugate basada en las vainas no difiere en absoluto de una immunoconjugate sintetizado usando otras estrategias bioconjugation, y estos procedimientos han sido exhaustivamente revisado en otra parte2 . Con respecto a este último, los aspectos específicos de preclínicos experimentos in vivo (es decir, modelos...

Radiofármacos químicos durante mucho tiempo han explotado la selectividad y la especificidad de los anticuerpos de biomarcadores de la enfermedad para ambas imágenes nucleares y dirigidos radioterapia1. Enfoque lejos más común para el radiolabeling de anticuerpos se basa en el acoplamiento indiscriminado de grupos prostéticos radiactivos o quelantes del radiometal a aminoácidos, a menudo lisinas — dentro de la estructura de la inmunoglobulina ( Figura 1A)2. Mientras que esta estrategia es ciertamente efectiva, su naturaleza aleatoria, sitio-específica puede crear problemas. Específicamente, bioconjugation tradicionales enfoques producen poco definido y immunoconjugates heterogéneo compuesto por mezclas de miles de regioisomers diferentes, cada uno con su propio conjunto de propiedades biológicas y farmacológicas3. Además, al azar bioconjugation puede impedir el immunoreactivity de anticuerpos si la carga se anexa a los dominios de unión a antígeno de la inmunoglobulina.
Con los años, han desarrollado una variedad de estrategias bioconjugation específico y selectivo de sitio para hacer frente a estos problemas4,5. El más común de estos enfoques se basa en la ligación de sondas de maleimida-teniendo a los grupos sulfidrilo de cisteínas (figura 1B). Anticuerpos IgG1 naturalmente contienen 4 puentes disulfuro inter-cadena, vínculos que pueden reducirse selectivamente para producir tioles libres capaces de sufrir reacciones de adición de Michael con maleimides para formar succinimidyl thioether bonos. El uso de tioles y maleimides es sin duda una mejora sobre los métodos tradicionales y una gran variedad de rodamientos de maleimida sintones y quelantes bifuncionales están actualmente disponibles. Sin embargo, es importante señalar que esta metodología tiene también serias limitaciones. Immunoconjugates base de maleimida exhiben estabilidad limitada en vivo porque el vínculo thioether puede experimentar una reacción de retro-Michael (figura 2)6,7,8,9, 10. esto, por supuesto, puede conducir a la liberación de la carga radiactiva o su intercambio con biomoléculas de tiol-rodamiento en la circulación (por ejemplo, glutatión o albúmina sérica). Ambos de estos procesos pueden aumentar las concentraciones de actividad en órganos sanos así como disminuir las concentraciones de actividad en los tejidos diana, dando por resultado contraste imagen reducida y menores relaciones terapéuticas. Varios reactivos de tioles reactivos alternativos se han desarrollado en un esfuerzo para evitar estos problemas, incluyendo tosylates, bromo y iodo acetyls y vinilo Sulfonas11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. sin embargo, todos estos enfoques tienen limitaciones que han obstaculizado su aplicación generalizada.
Aproximadamente hace cinco años, el laboratorio de la tarde Carlos III de Barbas en el Scripps Research Institute fue pionero en el uso de Sulfonas de metilo phenyloxadiazolyl como reactivos para la formación selectiva de vínculos muy estables con los tioles (figura 1 y figura 3) 18 , 19. los autores emplean una variante de rodamiento de sulfona de metil phenyloxadiazolyl de fluoresceína a modificar varios anticuerpos diseñados para contener residuos de cisteína libre, produciendo en última instancia immunoconjugates con mayor estabilidad que el análogo construcciones creadas utilizando sondas de maleimida. Al ver este trabajo prometedor, nos sorprendió un poco que esta tecnología se ha utilizado apenas en radioquímica y no había aún sido utilizada en todos en la síntesis de quelantes bifuncionales o radioimmunoconjugates20,21 . Esta escasez de aplicaciones, sin embargo, pronto comenzó a tener más sentido: varios intentos de procurar el reactivo de Sigma-Aldrich dio lugar a la recepción de mezclas complejas de productos de degradación con < 15% del compuesto deseado. Además, sintetizando el reactivo informó nosotros mismos no era una opción realista, como la ruta sintética publicada es algo engorrosa y requiere de equipo sofisticado de química orgánica que mayoría de radioquímica y la proyección de imagen molecular laboratorios, incluido el nuestro — simplemente no poseen.
En respuesta a estos obstáculos, nos propusimos crear una fácilmente accesible y altamente estable reactivo de phenyloxadiazolyl metil sulfona que puede obtenerse a través de una ruta sintética razonablemente fácil y robusta. Este año, informó de la creación de un modular, estable y fácilmente accesible phenyloxadiazolyl metil sulfona reactivo — apodado 'Vainas' — como una plataforma para el22de bioconjugations basados en tiol (figura 1 y figura 3). La diferencia clave entre las vainas y el reactivo reportado por Barbas, et al es que el primero emplea un anilina anillo unido a la molécula de sulfona de phenyloxadiazolyl metílico, mientras que este último cuenta con un fenol en la misma posición (figura 4). Este cambio facilita una ruta sintética más sencilla y accesible, así como — si nuestra experiencia con el compuesto comercialmente disponible es emblemático, un reactivo final más estable. En este trabajo, sintetiza también un par de vainas-cojinete quelantes bifuncionales, DFO de vainas y vainas-CHX-A''-DTPA — para facilitar la creación de 89Zr - y 177marcado con Lu radioimmunoconjugates, respectivamente. Como vamos a discutir, hemos demostrado que bioconjugations sitio selectiva basada en las vainas reproducible y robusto crear radioimmunoconjugates homogénea, bien definida, altamente immunoreactive y muy estable. Además, los experimentos preclínicos en modelos murinos de cáncer colorrectal han demostrado que estos sitio selectivamente con la etiqueta radioimmunoconjugates exposición rendimiento en vivo superior en comparación con los anticuerpos radiactivos sintetizados vía base de maleimida conjugaciones.
El objetivo primordial de este trabajo es facilitar la creación de immunoconjugates bien definida, homogénea, muy estable y altamente immunoreactive para aplicaciones in vitro e in vivo. El enfoque sintético es simple de realizar en casi cualquier laboratorio, y el reactivo de las vainas de los padres puede modificarse con una plétora de diferentes quelantes, fluoróforos o cargas. En este protocolo y el video que lo acompaña, describimos la síntesis simple de cuatro pasos de vainas (figura 5); la creación de una variante de rodamiento de las vainas de DOTA, un quelante utilizado para la coordinación de 64Cu 68Ga, 111en 177Lu y 225Ac (figura 6); y el bioconjugation de vainas DOTA a un anticuerpo de la modelo, el trastuzumab IgG1 dirigidos a la HER2 (figura 7).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>925000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EN300000141G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C556-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC383780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diisopropylethylamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>150915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-727-5100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E145 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413485000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-chloroperbenzoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>273031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBoc-N&#8242;-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>671401</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#8242;- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10&#215; Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates

Rodamiento de maleimida bifuncionales sondas han sido utilizadas durante décadas para la modificación sitio selectivo de tioles en biomoléculas, especialmente de anticuerpos. Pero conjugados de maleimida Mostrar estabilidad limitada en vivo porque el vínculo thioether de succinimidyl puede experimentar una reacción de retro-Michael. Esto, por supuesto, puede conducir a la liberación de la carga radiactiva o su intercambio con biomoléculas de tiol-cojinete en circulación. Ambos de estos procesos pueden producir concentraciones elevadas de actividad en órganos sanos como disminución de las concentraciones de actividad en los tejidos diana, dando por resultado contraste imagen reducida y menores relaciones terapéuticas. En 2018, nos informó de la creación de un modular, estable y fácilmente accesible phenyloxadiazolyl metil sulfona reactivo — apodado 'Vainas' — como una plataforma para bioconjugations base de tiol. Hemos demostrado claramente que bioconjugations sitio selectiva basada en las vainas reproducible y robusto crear radioimmunoconjugates homogénea, bien definida, altamente immunoreactive y muy estable. Además, los experimentos preclínicos en modelos murinos de cáncer colorrectal han demostrado que estos sitio selectivamente con la etiqueta radioimmunoconjugates exposición rendimiento en vivo muy superior en comparación con los anticuerpos radiactivos sintetizados vía base de maleimida conjugaciones. En este protocolo, se describe la síntesis de cuatro pasos de vainas, la creación de una variante de rodamiento de las vainas bifuncional de la omnipresente quelante de DOTA (DOTA de vainas) y la conjugación de vainas-DOTA a lo dirigidos a la HER2 anticuerpo trastuzumab.

Los cuatro primeros pasos de este protocolo, la síntesis de las vainas, se han diseñado para ser robusto y fiable. La desprotonación y sustitución de 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol para formar el producto deseado thioether ofrece el thioether en > 99% de rendimiento después de sólo 45 minutos. A continuación, la ligadura entre 1 y N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine se logró a través de un péptido estándar procedimiento de acoplami...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Síntesis y Bioconjugation de tioles reactivos reactivos para la creación de sitio selectivamente modificados Immunoconjugates

En este protocolo, se describe la síntesis de las vainas, un reactivo phenyoxadiazolyl metil sulfona-basado para el acoplamiento selectivo sitio de cargos a los tioles de biomoléculas, especialmente de anticuerpos. Además, se describen la síntesis y caracterización de un quelante bifuncional de rodamiento de las vainas y su conjugación a un anticuerpo de modelo.

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Este protocolo describe la síntesis y aplicación de PODS, un nuevo reactivo para la bioconjuriación específica del sitio de proteínas y péptidos. Esta tecnología representa una notable mejora con respecto a las bioconjugas tradicionales basadas en maleimidos-tiol. La mayor ventaja de este procedimiento es la simplicidad con la que se hace el reactivo.El método permite sintetizar el reactivo en prácticamente cualquier laboratorio. En un matraz de fondo redondo de 10 mililitros, disolver 100 miligramos del tiol aminofenil oxadiazole en tres mililitros de metanol. A la solución, añadir 360 microlitros de diisopropylethylamine y una barra de agitación magnética.Selle el matraz con un tapón de goma y revuelva la solución durante 10 minutos a temperatura ambiente. Con una jeringa de vidrio de un mililitro, haga un agujero a través del tapón de goma y agregue rápidamente 32 microlitros de yodometano a la mezcla. Deje que la mezcla reaccione durante 45 minutos a temperatura ambiente.En un matraz de fondo redondo de 25 mililitros, disuelve 387 miligramos del ácido carboxílico protegido por boc en 10 mililitros de diclorometano. A la solución, añadir 480 microlitros de diisopropylethylamine, 264 miligramos de EDCI, 200 miligramos de la anilina, y una barra de agitación magnética. Selle el matraz con un tapón de vidrio y deje que la reacción se revuelva durante cinco días a temperatura ambiente.Una vez completada la reacción, transfiera la mezcla de reacción a un embudo separador y lave tres veces con cinco mililitros de ácido clorhídrico de un molar. Recoger la fase orgánica y transferirla al embudo separador. A continuación, lave la fase orgánica con un molar de carbonato sódico seguido de agua.A continuación, recoger la fase orgánica y añadir sulfato de magnesio para eliminar cualquier rastro de agua. A continuación, filtre la mezcla con una frita de vidrio mediana. Con un evaporador rotativo, retire los disolventes volátiles a presión reducida para permitir un sólido blanquecino.Después de esto, redissolve el sólido aislado en 10 mililitros de acetato de etilo. A continuación, precipite el producto a través de la adición gradual de 30 mililitros de ciclohexano. Filtrar la solución utilizando una frita de vidrio medio para obtener el producto carbamato como polvo blanco.En un matraz de fondo redondo de 10 mililitros, disuelva 30 miligramos del carbamato en cuatro mililitros de diclorometano. Añadir lentamente 49 miligramos de ácido cloroperbenzoico al 70%m y una barra de agitación magnética a la mezcla, y sellar el matraz con un tapón de vidrio. Revuelva la solución durante la noche a temperatura ambiente, produciendo en última instancia una mezcla amarilla.Al día siguiente, transfiera la mezcla a un embudo separador. A continuación, lave la mezcla con hidróxido de sodio de 0,1 molar seguido de agua. Recoger la fase orgánica y añadir sulfato de magnesio para eliminar cualquier rastro de agua.A continuación, filtre la mezcla con una frita de vidrio mediana. En un matraz de fondo redondo de 25 mililitros, disuelve 30 miligramos del carbamato en dos mililitros de diclorometano. Agregue una barra de agitación magnética a la mezcla.Y 400 microlitros de ácido trifluoroacético y sellar el matraz con un tapón de vidrio. A continuación, revuelva la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante tres horas. Una vez completada la reacción, retire los volátiles sometidos a presión reducida a temperatura ambiente utilizando un evaporador rotatorio para obtener un residuo aceitoso.Disolver el residuo aceitoso en siete mililitros de agua. Y transfiera a un embudo separador. Lavar la solución acuosa tres veces con cuatro mililitros de acetato de etilo.En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, disolver 10 miligramos de PODS y 300 microlitros de dimetil sulfóxido. A continuación, agregue 26 microlitros de N, N-diisopropylethylamine a la solución. Disolver 15,2 miligramos de DOTA NCS en 100 microlitros de dimetil sulfóxido, y combinar la solución con la solución PODS.Selle el tubo de microcentrífuga y permita que la reacción se incuba durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, diluir 61 microlitros de una solución de trastuzumab con 859 microlitros de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros de baja unión a proteínas. A esta mezcla, añadir 6,7 microlitros de una solución recién hecha de 10 mililitrolares de TCEP en agua.Añadir 73 microlitros de una solución PODS-DOTA de un miligramo por mililitro a la mezcla de reacción. Por último, selle el tubo de microcentrífuga e incubar la solución durante dos horas a temperatura ambiente. La síntesis DE PODS es robusta y fiable.La desproteinación y la sustitución del tiol de aminofenilo oxadiazole ofrecía a tioéter uno en rendimiento cuantitativo. La ligadura de tioéter uno y el ácido carboxílico protegido por boc produjo un compuesto dos en un 55% de rendimiento. La oxidación sueló compuesto tres en 90% de rendimiento.Y la eliminación del grupo protector de los bocs produjo PODS en un rendimiento del 98%. La identidad de cada producto se confirmó a través de RMN de protones, RMN de carbono y MS de alta resolución. Una variante de isotiocianato del quelante DOTA se acopuso a la amina colgante de PODS para obtener el quelante bifuncional en un 75% de rendimiento. La identidad del producto se confirmó a través de RMN de protones, RMN de carbono y MS de alta resolución. Aquí se muestra una bioconjugación selectiva en el sitio de PODS-DOTA al anticuerpo de orientación HER2 trastuzumab.Los enlaces de disulfuro de la región de bisagra del anticuerpo se redujeron selectivamente, y el anticuerpo se incubaba con PODS-DOTA para permitir que el inmunoconjugado dota tuviera un rendimiento del 80%. El análisis MALDI-TOF reveló un grado de etiquetado de 1,8 DOTA por anticuerpo. Lo cual sigue siendo consistente en una gama de anticuerpos IgG1 humanos, humanizados y quiméricos.Sin embargo, las mismas condiciones producen inmunoconjugados con un grado de etiquetado de 1,5 para los anticuerpos IgG1 murinos. Debido a la sensibilidad a la luz de este compuesto, es importante mantener todas las reacciones en los vasos recubiertos de papel de aluminio. Esto aumentará el rendimiento general del producto.Si bien este protocolo describe la síntesis de PODS-DOTA, se puede aplicar un procedimiento similar a una amplia gama de cargas potenciales, incluyendo fluoróforos, toxinas y otros quelantes. Este método facilitará la construcción de inmunoconjugados bien definidos, homogéneos y altamente estables que se pueden utilizar en una amplia variedad de campos. Es importante recordar que el yodometano añadido en el primer paso de este experimento puede tener efectos nocivos, y por lo tanto debe utilizarse en una campana de humo.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Síntesis de hipervalente iodonio Alquinilo triflatos para la Aplicación de Generación Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Investigación

Química

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Síntesis Split-y-piscina y caracterización del péptido Terciario Amida Biblioteca

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

El bioconjugación y Radiosíntesis de<sup&gt; 89</sup&gt; Los anticuerpos marcados con Zr-DFO

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocolo para la Síntesis de<em&gt; Ortho</em&gt; derivados de anilina -trifluoromethoxylated

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Síntesis y caracterización de supramoleculares Coloides

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-1 como un catalizador heterogéneo para la Síntesis de la vainillina

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Síntesis de Proteínas bioconjugados<em&gt; vía</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Síntesis Facile de micelas similares a gusanos de luz visible mediada por dispersión Polimerización con catalizador Photoredox

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Método de precipitación química para la síntesis de Nb2O5 modificado a granel catalizadores de níquel con alta superficie específica

We demonstrate a method for the synthesis of NixNb1-xO catalysts with sponge-like and fold-like nanostructures. By varying the Nb:Ni ratio, a series of ...