Name: synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates
Uploaded: 2019-03-06T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr Sai Kiran Sharma för bra konversationer.

1. syntes av 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
Obs: På grund av ljuskänslighet av föreningen, hålla alla reaktioner i folie-täckt fartyg.
<ol><li>I en 10 mL runda botten mätkolv, Lös 100 mg (0.517 mmol, 1 motsvarande) 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol i 3 mL metanol.</li>
	<li>Till denna lösning, tillsätt 360 μL av diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 mmol; 4 motsvarigheter; vattenfri) och små magnetiska rör bar. Täcka kolven med en gummipropp och rör n...

<ol>
	<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+and+antimatter:+The+resurgence+of+immuno-PET.">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography.">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).</li><li>Agarwal, P., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody-drug+conjugates:+the+nexus+of+bioorthogonal+chemistry,+protein+engineering,+and+drug+development.">Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+1:+Cysteine+residues+and+glycans.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).</li><li>Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+molecular+imaging-part+2:+Peptide+tags+and+unnatural+amino+acids.">Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids.</a> Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).</li><li>Alley, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+linker+stability+to+the+activities+of+anticancer+immunoconjugates.">Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).</li><li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+degradation+of+maleimide-thiol+adducts+in+reducing+environments.">Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li><li>Shen, B. -. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).</li><li>Jackson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+evaluation+of+cysteine+and+site+specific+conjugated+herceptin+antibody-drug+conjugates.">In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates.</a> Plos One. 9 (1), (2014).</li><li>Ponte, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+the+stability+of+the+thiol-maleimide+linkage+impacts+the+pharmacokinetics+of+lysine-linked+antibody-maytansinoid+conjugates.">Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).</li><li>Stimmel, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+on+serine+-&gt;+cysteine+variant+monoclonal+antibodies.">Site-specific conjugation on serine -&gt; cysteine variant monoclonal antibodies.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+kidney+uptake+in+radiometal+labeled+peptide+linkers+conjugated+to+recombinant+antibody+fragments.+site-specific+conjugation+of+DOTA-peptides+to+a+cys-diabody.">Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).</li><li>Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+bifunctional+chelator+BAT+to+mouse+IgG(1)+Fab'+fragment.">Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab' fragment.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).</li><li>Tinianow, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+Zr-89-labeled+monoclonal+antibodies+for+ImmunoPET.">Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET.</a> Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+monodispersed+DOTA-PEGn+to+a+thiolated+diabody+reveals+the+effect+of+increasing+PEG+size+on+kidney+clearance+and+tumor+uptake+with+improved+64-copper+PET+imaging.">Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).</li><li>Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+binding+of+disulfide-bridged+PEG-Fabs.">Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs.</a> Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).</li><li>Koniev, O., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+and+recent+advancements+in+the+field+of+endogenous+amino+acid+selective+bond+forming+reactions+for+bioconjugation.">Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation.</a> Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).</li><li>Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+serum+stability+of+site-specific+antibody+conjugates+with+sulfone+linkers.">Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).</li><li>Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+stable,+chemoselective+labeling+of+thiols+with+Julia-Kocienski-like+reagents:+A+serum-stable+alternative+to+maleimide-based+protein+conjugation.">Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Last-step+enzymatic+F-18-fluorination+of+cysteine-tethered+RGD+peptides+using+modified+Barbas+linkers.">Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers.</a> Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).</li><li>Chiotellis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chemoselective+F-18-radiolabeling+of+thiol-containing+biomolecules+under+mild+aqueous+conditions.">Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions.</a> Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).</li><li>Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+bifunctional+chelators+for+the+creation+of+site-selectively+modified+radioimmunoconjugates+with+improved+stability.">Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability.</a> Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).</li><li>Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+expression+of+the+intestinal+epithelium-related+antigen+A33,+a+cell+surface+target+for+antibody-based+imaging+and+treatment+in+gastrointestinal+cancer.">Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).</li><li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma.">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).</li><li>Junutula, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+a+cytotoxic+drug+to+an+antibody+improves+the+therapeutic+index.">Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.</a> Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).</li><li>Pillow, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+trastuzumab+maytansinoid+antibody-drug+conjugates+with+improved+therapeutic+activity+through+linker+and+antibody+engineering.">Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+tumor+retention+of+a+radiohalogen+label+for+site-specific+modification+of+antibodies.">Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).</li><li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+drug+conjugation+on+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+of+anti-STEAP1+antibody-drug+conjugates+in+rats.">Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).</li><li>Alvarez, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+modified+111In+labelled+antibodies+give+low+liver+backgrounds+and+improved+radioimmunoscintigraphy.">Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy.</a> Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).</li><li>Strop, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+matters:+SIte+of+conjugation+modulates+stability+and+pharmacokinetics+of+antibody+drug+conjugates.">Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates.</a> Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).</li><li>Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+conjugates+with+unnatural+amino+acids.">Antibody conjugates with unnatural amino acids.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).</li><li>Axup, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+site-specific+antibody-drug+conjugates+using+unnatural+amino+acids.">Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).</li><li>Lang, K., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+incorporation+of+unnatural+amino+acids+and+bioorthogonal+labeling+of+proteins.">Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins.</a> Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).</li><li>Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodate+oxidation+of+methionine+in+proteines.">Periodate oxidation of methionine in proteines.</a> Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+methionine+oxidation+in+human+IgG1+Fc+on+serum+half-life+of+monoclonal+antibodies.">Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies.</a> Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).</li><li>O'Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+labeling+immunoglobulins+by+conjugation+to+oligosaccharide+moieties.">A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties.</a> Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).</li><li>Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+antibody+drug+conjugates+for+cancer+therapy.">Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy.</a> Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).</li><li>Hu, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+conjugation+of+HIV-1+tat+peptides+to+IgG:+a+potential+route+to+construct+radioimmunoconjugates+for+targeting+intracellular+and+nuclear+epitopes+in+cancer.">Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).</li></ol>

I denna rapport har vi valt att inte inkludera några protokoll för radiolabeling eller in vivo-experiment. Våra skäl är enkelt. Med avseende på förra, den radiolabeling av en SKIDA-baserade immunoconjugate skiljer sig inte alls från det av en immunoconjugate som syntetiseras med andra bioconjugation strategier, och dessa förfaranden har varit utförligt recenserade någon annanstans2 . Beträffande den senare kan detaljerna i prekliniska in vivo experiment (dvs musmodeller, doser, etc.) v...

Radiofarmaceutisk kemister har länge utnyttjas den selektivitet och specificitet av antikroppar för biomarkörer för sjukdom för både kärn avbildning och riktad strålbehandling1. Särklass vanligaste förhållningssätt till den radiolabeling av antikroppar bygger på urskillningslösa tillbehöret av radiomärkt prosthetic grupper eller radiometal kelater till aminosyror — oftast lysines — inom strukturen för immunglobulin ( Figur 1A)2. Denna strategi är säkert effektiv, kan dess slumpmässigt, icke-plats-specifika natur skapa problem. Specifikt, traditionella bioconjugation metoder producera dåligt definierat och heterogena immunoconjugates består av blandningar av tusentals olika lägesisomererna, alla med sin egen uppsättning biologiska och farmakologiska egenskaper3. Slumpmässiga bioconjugation kan dessutom hindra immunoreaktivitet antikroppar om lasten läggs till den immunglobulin antigen-bindande domäner.
Genom åren har en mängd platsspecifika och webbplats-selektiv bioconjugation strategier utvecklats för att hantera dessa problem4,5. Den vanligaste av dessa metoder bygger på ligering av maleimide-bärande sonder till sulfhydryl grupper av cysteines (figur 1B). IgG1 antikroppar innehåller naturligt 4 mellan kedjan disulfidbryggor, kopplingar som selektivt kan reduceras för att ge gratis Tioler kan genomgå Michael tillägg reaktioner med maleimides att bilda succinimidyl thioether obligationer. Tioler och maleimides är verkligen en förbättring jämfört med traditionella metoder, och ett brett utbud av maleimide-bärande synthons och bifunktionell kelater är tillgängliga. Det är dock viktigt att notera att denna metod har allvarliga begränsningar samt. Maleimide-baserade immunoconjugates uppvisar begränsad stabilitet i vivo eftersom thioether kopplingen kan genomgå en retro-Michael reaktion (figur 2)6,7,8,9, 10. detta, naturligtvis, kan leda till utsläpp av radioaktiva nyttolasten eller dess utbyte med thiol-bärande biomolekyler i omlopp (glutation eller serum albumin). Båda dessa processer kan öka aktivitetskoncentrationer i friska organ samt minska aktivitetskoncentrationer i målvävnad, vilket resulterar i minskad imaging kontrast och lägre terapeutiska nyckeltal. Flera alternativa thiol-reaktiva reagenser har utvecklats i ett försök att kringgå dessa frågor, inklusive tosylates, bromo - och Jodo-Acetexs, och vinyl sulfoner11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. alla dessa metoder har dock begränsningar som har hindrat deras utbredd tillämpning.
Ungefär fem år sedan, börjat laboratoriet för den sena Carlos Barbas III vid Scripps Research Institute använda sig av phenyloxadiazolyl metyl sulfoner som reagens för selektiv bildandet av mycket stabila kopplingar med Tioler (figur 1 c och figur 3) 18 , 19. författarna sysselsatt en phenyloxadiazolyl metyl sulfon-bärande variant av fluorescein att ändra flera antikroppar konstruerade för att innehålla rester av gratis Cystein, i slutändan producerar immunoconjugates med högre stabilitet än motsvarande konstruktioner som skapats med maleimide-baserade sonder. När han ser denna lovande arbete, var vi lite förvånad över att denna teknik hade endast använts knappt i radiokemi och hade ännu inte använts alls i syntesen av bifunktionell kelater eller radioimmunoconjugates20,21 . Denna brist på tillämpningar, men snart började mer meningsfullt: flera försök till koppleri reagensen från Sigma-Aldrich resulterade i mottagandet av komplexa blandningar av nedbrytningsprodukter med < 15% av den önskvärda föreningen. Dessutom syntetisera rapporterade reagensen oss var inte ett realistiskt alternativ heller, som den publicerade syntesväg är ganska ohanterlig och kräver avancerad organisk kemi utrustning som de flesta radiokemi och molekylär avbildning laboratorier — inklusive vår — helt enkelt inte besitter.
Svar på dessa hinder anges vi att skapa en lättillgänglig och mycket stabil phenyloxadiazolyl metyl sulfon reagens som kan erhållas via en robust och rimligen lättköpt syntesväg. Tidigare i år, rapporterade vi att skapa en modulär, stabil och lättillgängligt phenyloxadiazolyl metyl sulfon reagens — dubbade 'SKIDA' — som en plattform för thiol-baserade bioconjugations (figur 1 c och figur 3)22. Den viktigaste skillnaden mellan SKIDA och reagens rapporteras av Barbas, et al. är att den förstnämnda sysselsätter en anilin ring bifogas den phenyloxadiazolyl metyl sulfon biexponentiellt, medan det sistnämnda erbjuder en fenol i samma position (figur 4). Ändringen underlättar en mer enkel och lättåtkomlig syntesväg som — om vår erfarenhet med kommersiellt tillgängliga föreningen är symboliska — en stabilare slutliga reagens. I detta arbete, vi också syntetiseras ett par BALJOR räntebärande bifunktionell kelater — PODS-DFO och PODS-CHX-A''-DTPA — att underlätta skapandet av 89Zr- och 177Lu-märkt radioimmunoconjugates, respektive. Som vi kommer att diskutera, har vi visat att SKIDA-baserade webbplats-selektiv bioconjugations reproducibly och kraftfullt skapar homogena, väldefinierade, mycket immunreaktiva och mycket stabil radioimmunoconjugates. Prekliniska experiment i murina modeller av kolorektal cancer har dessutom visat att dessa webbplats-selektivt märkt radioimmunoconjugates uppvisar överlägsen Invivo prestanda jämfört med radiomärkt antikroppar syntetiseras via maleimide-baserade konjugationer.
Övergripande målet med detta arbete är att underlätta skapandet av väldefinierade, homogent, mycket stabil och mycket immunreaktiva immunoconjugates för in vitro- och in vivo-program. Den syntetiska metoden är enkel nog att utföras i nästan alla laboratorium och överordnade PODS reagens kan ändras med en uppsjö av olika kelatorer, fluorophores eller laster. I detta protokoll och medföljande videon, kommer vi att beskriva enkla, fyra steg syntesen av SKIDA (figur 5). skapandet av en SKIDA räntebärande variant av DOTA, en allmänt använd kelator för samordning av 64Cu, 68Ga, 111år, 177Lu och 225Ac (figur 6). och bioconjugation av SKIDA-DOTA till en modell antikropp, den HER2-targeting IgG1 trastuzumab (figur 7).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>675024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>925000090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifugal Tube</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A998-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>EN300000141G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C556-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC383780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diisopropylethylamine</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>150915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-727-5100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E145 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>413485000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>m-chloroperbenzoic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>273031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBoc-N&#8242;-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>671401</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#8242;- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10&#215; Concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-SCN-Bn-DOTA</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-205</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17085101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>20490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethylamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC157911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A116-50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis and bioconjugation of thiol-reactive reagents for the creation of site-selectively modified immunoconjugates

Maleimide-bärande bifunktionell sonder har använts i decennier för webbplats-selektiv modifiering av Tioler i biomolekyler, särskilt antikroppar. Maleimide-baserade konjugat visas ännu begränsad stabilitet i vivo eftersom succinimidyl thioether kopplingen kan genomgå en retro-Michael reaktion. Detta kan naturligtvis leda till utgivningen av radioaktiva nyttolasten eller dess utbyte med thiol-bärande biomolekyler i omlopp. Båda dessa processer kan producera förhöjda aktivitetskoncentrationer i friska organ samt minskad aktivitetskoncentrationer i målvävnad, vilket resulterar i minskad imaging kontrast och lägre terapeutiska nyckeltal. 2018, rapporterade vi att skapa en modulär, stabil och lättillgängligt phenyloxadiazolyl metyl sulfon reagens — dubbade 'SKIDA' — som en plattform för thiol-baserade bioconjugations. Vi har tydligt visat att SKIDA-baserade webbplats-selektiv bioconjugations reproducibly och kraftfullt skapar homogena, väldefinierade, mycket immunreaktiva och mycket stabil radioimmunoconjugates. Prekliniska experiment i murina modeller av kolorektal cancer har dessutom visat att dessa webbplats-selektivt märkt radioimmunoconjugates utställning vida överlägsen Invivo prestanda jämfört med radiomärkt antikroppar syntetiseras via maleimide-baserade konjugationer. I detta protokoll, kommer vi att beskriva fyra steg syntesen av BALJOR, skapandet av en bifunktionell PODS-bärande variant av den allestädes närvarande kelator DOTA (PODS-DOTA) och konjugationen av SKIDA-DOTA till den HER2-targeting antikropp trastuzumab.

De fyra första stegen i detta protokoll — syntesen av SKIDA — har utformats för att vara robust och tillförlitlig. Den deprotonation och substitution av 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol att bilda den önska thioether-produkten ger thioether i > 99% avkastning efter bara 45 minuter. Nästa, uppnåddes ligering mellan 1 och N-Boc-N'-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine via en standard peptid koppling förfarande, vilket resulterar i samlingen av pro...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates at JoVE.com

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Syntes och Bioconjugation av Thiol-reaktiva reagenser för skapandet av webbplatsen-selektivt modifierade Immunoconjugates

I detta protokoll, kommer vi att beskriva syntesen av BALJOR, phenyoxadiazolyl metyl sulfon-baserade reagens för webbplats-selektiv fastsättning av laster till Tioler av biomolekyler, särskilt antikroppar. Dessutom kommer vi att beskriva syntes och karakterisering av en SKIDA räntebärande bifunktionell kelator och dess konjugering till en modell antikropp.

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Detta protokoll beskriver syntes och tillämpning av PODS, ett nytt reagens för den platsspecifika biokonjugation av proteiner och peptider. Denna teknik utgör en markant förbättring jämfört med traditionella maleimide-thiol-baserade bioconjugations. Den största fördelen med detta förfarande är enkelheten med vilken reagenset görs.Metoden gör att reagensen syntetiseras i praktiskt taget alla laboratorium. I en 10-milliliter rund-botten kolv, lösa 100 milligram av aminofenyloxadiazol tiolen i tre milliliter metanol. Till lösningen, tillsätt 360 mikroliter av diisopropyletylamin och en magnetisk rör bar.Täta kolven med en gummipropp, och rör om lösningen i 10 minuter vid rumstemperatur. Med hjälp av en glasspruta med en millimeter peta ett hål genom gummiproppen och tillsätt snabbt 32 mikroliter i jotometan i blandningen. Låt blandningen reagera i 45 minuter i rumstemperatur.I en 25-milliliter rund-botten kolv, lösa 387 milligram av boc-skyddade karboxylsyra i 10 milliliter av diklormetan. Till lösningen, tillsätt 480 mikroliter av diisopropyletylamin, 264 milligram EDCI, 200 milligram av anilin, och en magnetisk rör bar. Förslut kolven med en glaspropp, och låt reaktionen röra om i fem dagar i rumstemperatur.När reaktionen är klar, överför reaktionsblandningen till en separatorisk tratt, och tvätta tre gånger med fem milliliter av en-molar saltsyra. Samla den organiska fasen och överför den till separatortratten. Tvätta sedan den organiska fasen med en-molar natriumkarbonat följt av vatten.Därefter samla den organiska fasen och tillsätt magnesiumsulfat för att ta bort eventuella spår av vatten. Filtrera sedan blandningen med hjälp av ett medium glasfrit. Ta bort de flyktiga lösningsmedlet under reducerat tryck för att ha råd med ett off-white fast med hjälp av en rotationsförångare.Efter detta, rödissolve den isolerade fasta i 10 milliliter av etylacetat. Fäll sedan ut produkten via den gradvisa tillsats av 30 milliliter cyklohexan. Filtrera lösningen med hjälp av en medium glasfrit för att erhålla karbamatprodukten som ett vitt pulver.I en 10-milliliter rund-botten kolv, lösa 30 milligram av karbamat i fyra milliliter av diklormetan. Tillsätt långsamt 49 milligram 70%m-kloroperbensosyra och en magnetisk rör bar till blandningen, och försegla kolven med en glaspropp. Rör om lösningen över natten i rumstemperatur, vilket i slutändan ger en gul blandning.På följande dag, överför blandningen till en separata tratt. Tvätta sedan blandningen med 0,1-molar natriumhydroxid följt av vatten. Samla den organiska fasen och tillsätt magnesiumsulfat för att ta bort eventuella spår av vatten.Filtrera sedan blandningen med hjälp av ett medium glasfrit. I en 25-milliliter rund-botten kolv, lösa 30 milligram av karbamat i två milliliter av diklormetan. Tillsätt en magnetisk rör bar till blandningen.Och 400 mikroliter av trifluoroättiksyra och försegla kolven med en glaspropp. Rör sedan reaktionsblandningen i rumstemperatur i tre timmar. När reaktionen är klar, avlägsna flyktiga ämnena under minskat tryck vid rumstemperatur med hjälp av en roterande förångare för att få en oljig restprodukt.Lös upp den oljiga återstoden i sju milliliter vatten. Och överföring till en separatorisk tratt. Tvätta vattenlösningen tre gånger med fyra milliliter etylacetat.I en 1,5-milliliter microcentrifuge rör, lösa 10 milligram PODS och 300 mikroliter av dimetylsulfoxid. Tillsätt sedan 26 mikroliter av N, N-diisopropyletylamin till lösningen. Lös upp 15,2 milligram DOTA NCS i 100 mikroliter dimetylsulfoxid, och kombinera lösningen med PODS-lösningen.Täta mikrocentrifugröret, och låt reaktionen inkubera över natten i rumstemperatur. Späd därefter 61 mikroliter av en trastuzumab stamlösning med 859 mikroliter PBS i ett lågproteinbindande 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Till denna blandning, tillsätt 6,7 mikroliter av en nygjord 10-millimolar lösning av TCEP i vatten.Tillsätt 73 mikroliter av en en milligram per milliliter PODS-DOTA-lösning till reaktionsblandningen. Slutligen, försegla microcentrifugröret och inkubera lösningen i två timmar i rumstemperatur. PODS-syntesen är robust och tillförlitlig.Deproteination och ersättning av aminofenyloxadiazoltiolen som ges thioether en i kvantitativ avkastning. Ligatur av diteter en och den boc-skyddade karboxylsyra gav förening två i 55%avkastning. Oxidation ges förening tre i 90%avkastning.Och avlägsnande av bocs-skydda gruppen gav PODS i 98%avkastning. Identiteten på varje produkt bekräftades via proton NMR, kol NMR, och högupplöst MS. En isothiocyanate-bärande variant av kelator DOTA kopplades till hänge ammin av PODS att erhålla den bifunktionella kelatator i 75%avkastning. Produktens identitet bekräftades via proton NMR, kol-NMR och högupplöst MS. Platsselektiv biokonjugering av PODS-DOTA till den HER2-inriktade antikroppen trastuzumab visas här.Disulfidlänkagen av antikroppens gångjärnsregion reducerades selektivt, och antikroppen inkuberades sedan med PODS-DOTA för att ha råd med det DOTA-bärande immunkonjugaterna 80 %i avkastning. MALDI-TOF analys visade en grad av märkning av 1,8 DOTA per antikropp. Vilket förblir konsekvent över en rad mänskliga, humaniserade och chimära IgG1 antikroppar.Samma villkor ger dock immunkonjugat med en grad av märkning av 1,5 för murine IgG1 antikroppar. På grund av den lätta känsligheten hos denna förening är det viktigt att hålla alla reaktioner i folietäckta kärl. Detta kommer att öka den totala avkastningen av produkten.Medan detta protokoll beskriver syntesen av PODS-DOTA, ett liknande förfarande kan tillämpas på ett brett spektrum av potentiella laster, inklusive fluoroforer, toxiner, och andra kelatorer. Denna metod kommer att underlätta byggandet av väldefinierade, homogena, och högstabila immunkonjugat som kan användas inom en mängd olika områden. Det är viktigt att komma ihåg att iodometan läggas i steg ett av detta experiment kan ha skadliga effekter, och bör därför användas i en rök huva.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Synthesis of Hypervalent Iodonium Alkynyl Triflates for the Application of Generating Cyanocarbenes

Syntes av hypervalent jodonium Alkynyl triflater för tillämpning av Generera Cyanocarbenes

The procedures described in this article involve the synthesis and isolation of hypervalent iodonium alkynyl triflates (HIATs) and their subsequent ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Split-och-pool Syntes och karakterisering av peptid tertiär amid Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Den biokonjugering och radiosynthesis av<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-märkta antikroppar

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protocol for the Synthesis of Ortho-trifluoromethoxylated Aniline Derivatives

Protokoll för syntes av<em&gt; Ortho</em&gt; -trifluoromethoxylated anilinderivat

Molecules bearing trifluoromethoxy (OCF3) group often show desired pharmacological and biological properties. However, facile synthesis of ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Syntes och karakterisering av Supramolekylära Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

HKUST-1 as a Heterogeneous Catalyst for the Synthesis of Vanillin

HKUST-1 som en heterogen katalysator för syntes av Vanillin

Vanillin (4-hydoxy-3-methoxybenzaldehyde) is the main component of the extract of vanilla bean. The natural vanilla scent is a mixture of approximately ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntesen av protein biokonjugat<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntes av maskliknande Miceller med synligt ljus medierad dispersionspolymerisation Använda Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Syntes och masspektrometri analys av Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Chemical Precipitation Method for the Synthesis of Nb2O5 Modified Bulk Nickel Catalysts with High Specific Surface Area

Kemisk fällning metod för syntesen av Nb2O5 modifierad Bulk Nickel katalysatorer med höga specifika yta

We demonstrate a method for the synthesis of NixNb1-xO catalysts with sponge-like and fold-like nanostructures. By varying the Nb:Ni ratio, a series of ...