Name: highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Forfatterne takker Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, og Nicola Kuhr for deres ekstraordinære tekniske assistance og Dr. Dennis Sohn for hans hjælp med fluorescens scanningen. Denne forskning blev støttet af en bevilling af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 til L.C.R. og L.S. Funder havde ingen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller forberedelse af manuskriptet.

Undersøgelserne blev gennemført i henhold til de retningslinjer, der er skitseret i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (US National Institutes of Health publikation nr. 85-23, revideret 1996). Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de relevante institutionelle godkendelser (delstatsregeringen Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referencenummer 84-02.04.2012. A397).
1. forberedelse af instrumenter, løsninger og udstyr
<ol><li>FITC-polys...

<ol>
	<li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy.">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li><li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule.">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+(ANG+II)+infusion+in+rats.">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li><li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice.">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li><li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes.">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li><li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool.">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity:+effects+of+molecular+size,+shape,+charge,+and+deformability.">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li><li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall.">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+Effects+of+Tempol,+NOS-,+RhoA-+and+Rac-1-inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li><li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo,+dependent+upon+reactive+oxygen+species.">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reactive+oxygen+species+(ROS)-dependent+effects+of+IL-1beta,+TNF-alpha,+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+(GFB)+in+vivo.">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo.">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li><li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability:+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol.">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li><li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma.">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats.">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hyperglycemia+induces+rapid,+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats.">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats.">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li><li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier.">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+effects+of+Tempol,+NOS,+RhoA,+and+Rac-1+inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li><li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae.">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li><li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods.">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li></ol>

Den præsenterede metode gør det muligt for investigator at teste glomerulær permeabilitet i mus på en meget følsom måde ved hjælp af en Tracer. Med denne metode, kortsigtede stigninger i glomerulær permeabilitet kan diagnosticeres ved hjælp af kun små mængder af urin. De mest kritiske trin for vellykket mastering denne teknik er 1) udvikling af manuel ekspertise i mus kirurgi, især i kanylen af en central vene, 2) placering af urin kateteret uden at skade slimhinden, og 3) manuel ekspertise i håndtering 384-...

Funktionelle eller strukturelle defekter inden for den glomerulære filtrerings barriere øger glomerulær permeabilitet til albumin, hvilket resulterer i påvisning af albumin i urinen (albuminuri). Albuminuria forudsiger hjerte-kar-udfald og er en vigtig markør for glomerulær skade1. Selv lave niveauer af albuminuri, liggende inden for normalområdet, er forbundet med en øget kardiovaskulær risiko1.
Under fysiologiske forhold filtreres albumin gennem glomerulus og er næsten fuldstændigt genabsorberet i det rørformede system2,3. I mus udføres påvisning af albumin i urinen sædvanligvis af en albumin enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA) fra 24 timers urinopsamling. Hvis der anvendes urin fra en urinopsamling eller spot urin på 24 timer, kan små forskelle i albumin koncentrationer gå tabt på grund af analyse følsomheds problemer. De fleste forskere bruger derfor dyremodeller, hvor albuminuri induceres af robust nyreskade på grund af toksiner, narkotika og nyre kirurgi.
Derfor er konstateringen af en følsom metode til påvisning af små og forbigående ændringer i glomerulær permeabilitet meget vigtig for marken. Rippe et al. har præsenteret en rotte model til at teste glomerulær permeabilitet ved at anvende en fluorescently mærket Tracer, nemlig FITC-polysaccharose 70 (dvs., FITC-Ficoll 70), på størrelse med albumin4. Den Tracer ansøgning tillader afprøvning af kortsigtede ændringer i glomerulær permeabilitet (inden for minutter) og er meget følsom4. To undersøgelser har brugt Tracer-metoden i mus5,6. På trods af sine fordele, denne metode, desværre, har ulemper: det er teknisk meget komplekst, radioaktivt, og invasiv. Yderligere analyse af urinen opnås kun ved hjælp af gel filtrering eller størrelses udelukkelse HPLC5,6.
Inden for dette papir præsenterer vi en alternativ, følsom, ikke-radioaktiv og hurtig metode til at måle glomerulær permeabilitet i mus ved hjælp af fluorescently mærket FITC-polysaccharose 70. Ved at introducere et transuretral kateter er urin indsamlingen mindre invasiv end blære punktering, urethrotomi og suprapubisk kateter applikation, og giver mulighed for opsamling af urin mindst hver 30 min. urinanalyse udføres fra små mængder (5μl) ved hjælp af en fluorescerende plade læser. Spor koncentrationerne i urinen normaliseret til kreatinin koncentrationer i urinen ved hjælp af en enzymatisk kreatinin-analyse.
Derfor, denne nye metode tilbyder et følsomt værktøj til at studere tidlig glomerulær skade med øget glomerulær permeabilitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for neck cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;"></td>
			<td style="width:77px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">BD Insyte Autoguard</td>
			<td style="width:77px;">BD</td>
			<td style="width:101px;">381823</td>
			<td>&#160;urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Multimode Detector DTX 880</td>
			<td style="width:77px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:257px;">384 well microtiterplate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">262260</td>
			<td style="width:235px;">384 well platte</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Creatinine Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">MAK080</td>
			<td>to measure creatinine concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">96 well plate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">260836</td>
			<td>for creatinine assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">FITC-labeled polysuccrose 70</td>
			<td style="width:77px;">TBD Consultancy</td>
			<td style="width:101px;">FP70</td>
			<td>FITC-ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Angiotensin II</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9525</td>
			<td>used to test glomerular permeability</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP-98A</td>
			<td style="width:77px;">Softron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for blood pressure measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">OTS 40.3040</td>
			<td style="width:77px;">Medite</td>
			<td style="width:101px;">01-4005-00</td>
			<td>heating plate for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Instillagel 6mL</td>
			<td style="width:77px;">Farco-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Exacta</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">GT415</td>
			<td>shaver</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70

Tabet af albumin i urinen (albuminuri) forudsiger kardiovaskulære udfald. Under fysiologiske forhold filtreres små mængder albumin af glomerulus og reabsorberes i det rørformede system indtil Absorptionsgrænsen nås. Tidlige stigninger i patologisk albumin filtrering kan således gå glip af ved at analysere albuminuria. Derfor er brugen af røbestoffer til at teste glomerulær permselektivitet synes fordelagtig. Fluorescently mærket Tracer fluorescein isothiocyanat (FITC)-polysakkarose (dvs., FITC-Ficoll), kan anvendes til at studere glomerulær permselektivitet. FITC-polysaccharosemolekyler filtreres frit af glomerulus, men ikke reabsorberes i det rørformede system. Hos mus og rotter er FITC-polysakkarose blevet undersøgt i modeller af glomerulær permeabilitet ved hjælp af teknisk komplekse procedurer (dvs. radioaktive målinger, højtydende væskekromatografi [HPLC], gel-filtrering). Vi har modificeret og lettet en FITC-polysakkarose Tracer-baserede protokol til at teste tidlige og små stigninger i glomerulær permeabilitet til FITC-polysakkarose 70 (størrelse af albumin) i mus. Denne metode muliggør gentagne urinanalyser med små urin volumener (5 μL). Denne protokol indeholder oplysninger om, hvordan Tracer FITC-polysaccharose 70 påføres intravenøst, og urin opsamles via et simpelt urin kateter. Urinen analyseres via en fluorescens plade læser og normaliseret til en urin koncentrations markør (kreatinin), hvorved man undgår teknisk komplekse procedurer.

Som afbildet i figur 2, er metoden til at teste glomerulær permeabilitet i mus opbygget i tre faser. Den første fase kaldes forberedelsesfasen, hvor et urin kateter og et centralt venekateter er placeret. Den anden fase kaldes ækvibrations fasen, begyndende med en intravenøs bolt indsprøjtning af FITC-polysaccharose 70 og efterfulgt af kontinuerlig infusion af FITC-polysaccharose 70 til 60 min. Den sidste fase kaldes den eksperimentelle fase. I denne fas...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Her præsenterer vi en protokol til at teste glomerulær permeabilitet i mus ved hjælp af en meget følsom, ikke-radioaktiv Tracer. Denne metode giver mulighed for gentagne urinanalyser med små urin volumener.

Meget følsom måling af glomerulær permeabilitet hos mus med fluorescein isothiocyanat-polysakkarose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i nefrologi området om den rolle, glomerulær permeabilitet i nyresygdom. Den største fordel ved denne teknik er, at små og forbigående stigninger i glomerulær permeabilitet opdages ved hjælp af en fluorescerende bly mærket sporstof. Efter anæstesi, placere et urinkateter i den kvindelige mus.Placer musen i dorsal recumbency. Stram underlivet og finde urethral ostium. Angiocatheterens plastdel af kateteret og smør det med xylocaingel.Brug den venstre pegefinger til at placere omhyggelig spænding på underlivet og indføre kateteret tre millimeter i urethral ostium, mens parallelt med den distale urethral akse. Drej toppen af angiocatheter 180 grader ved at holde spidsen i urethral ostium og opretholde aksen af urinrøret. Derefter indføre kateteret syv millimeter længere ind i musen, så det er placeret i blæren.Placer en 1,5 milliliter brun slange over toppen af angiocatheter at indsamle urinen. Påfør en milliliter 0,9% natriumchlorid subkutant for at øge urinproduktionen. Barber halsen på musen og læg den i recumbency med hovedet mod kirurgen.Hyper forlænge hovedet af musen med et bånd. Desinficere halsen med 70% isopropanol. Ved hjælp af en pincet og en saks gøre en fem millimeter hud snit under jawline.Skær huden ca. en centimeter i brystbenets retning, indtil midten af brystbenet er nået. Brug en saks. Forsigtigt dissekere huden til højre side af halsen.Lav et rektangulært snit af huden til højre for at eksponere det bløde væv i halsen. Pas på ikke at beskadige halspulsåren. Brug en saks og en pincet til at fastgøre hudklapperne med to klemmer.Brug spidsen af den fine pincet, omhyggeligt udsætte halspulsåren ved stump forberedelse. Fjern om nødvendigt væv med en saks. Undgå skader på venegrene.Placer og luk en ligatur med en silketråd i den distale del af den synlige halspulsåre, som er mod hovedet af musen. Fastgør silketråden med et bånd for at sætte spænding på ligaturen. Dette sikrer let spænding på halspulsåren.Forbered en ligatur omkring den proksimale del af halspulsåren. Derefter fyldes kateteret med ækvilibrerings- og fusionsopløsningen. Fastgør kateteret med et bånd, så kateteret justerer halspulsåren.Kontrol for bobler for at undgå luftemboli. Løft halspulsåren med fine pincet på indføringsstedet. Juster slangen parallelt med halspulsåren og punkter halspulsåren sigter mod lumen.Indsæt i ca. to til fire millimeter parallelt med halspulsårens akse. Undgå raske bevægelser. Luk ligaturen for at fastgøre kateteret.Kontrol for tæthed af ligaturen ved omhyggeligt at se gennem mikroskopet. Sæt en fugtig vatpind over stedet for kirurgi. Placer hale manchet i bunden af musen hale, mens musen lægger i dorsale recumbency.Start målingerne, og gentag dem ti gange pr. tidspunkt. Hvis blodtryksmålingerne ikke virker korrekte, og der frembiskes falske data, justeres halemanchettens position. Før ækvilibreringsfasen skal urinopsamlingsrøret skiftes, og det anbringes på is.Fold en vatpind og læg den omkring det lille karkateter, der indføres i halspulsåren. Placer en klemme over podningen for at afskaffe tilbageskridt i blodet eller luftemboli. Tilslut en 27 G nål med en 1 milliliter sprøjte fyldt med FITC bolus til enden af det lille karkateter.Åbn klemmen og påfør 100 mikroliterEN FITC bolus. Luk klemmen igen, og tilslut det større kateter med det mindre kateter. Åbn klemmen igen, og start sprøjtepumpen med en strømningshastighed på 0,008 milliliter pr. minut.Fortsæt infusionen i 60 minutter. I denne fase undersøges den effektive medicin mod glomerular perm selektivitet. Skift urinrøret form tidspunkt nul minut til en anden 1,5 milliliter brun rør.Sæt en vatpind rundt om det lille karkateter og afbryd det store kateter fra det lille karkateter. Fyld sprøjten med den eksperimentelle faseopløsning. Ansæt den i sprøjtepumpen, og lad infusionspumpen køre, så det store kateter fyldes med den eksperimentelle faseopløsning.Tilslut kateterne igen, samtidig med at luftemboli undgås, og klemmen skal åbnes igen. Start sprøjtepumpen med en strømningshastighed på 0,008 milliliter pr. minut. Fortsæt med at køre sprøjtepumpen i 60 minutter og opsaml derefter urinen i urinrøret.Placer urinrøret på is. I denne undersøgelse, fluorescens scanning af indfødte mus urin viser et højdepunkt på 395 nanometer. FITC polysucrose 70 ved en koncentration på 40 mikrogram pr. milliliter i museurin viser et fluorescensindhold ved 525 nanometer.Museurin forstyrrer ikke fluorescensmålingen af FITC polysucrose 70. Ved optagelse af 525 nanometer stigende koncentrationer af FITC polysucrose 70 viser en øget fluorescens intensitet. Denne metode er også i stand til at opdage forskelle i glomerulær permeabilitet.De hvide søjler repræsenterer FITC polysucrose 70 niveauer før starten af angiotensin II stimulation i den eksperimentelle fase. Efter doser i 60 minutter, den glomerulære permeabilitet steg sammenlignet med kontrolgruppe. angiotensin II vasker nedsat glomerulær permeabilitet ud.FITC polysucrose 70 niveauer faldt efter yderligere 60 minutter af angiotensin II stimulation eller 60 minutter af angiotensin II udvaskning. Stigningen i glomerulær permeabilitet på grund af angiotensin II kan blokeres af en angiotensin II receptorblokering. Blodtryk, der blev overvåget af halemanchetmetoden, viste ikke signifikante forskelle mellem kontrol- og angiotensin II-behandlede grupper.Mens du forsøger denne procedure er det vigtigt at undgå luftemboli, når du skifter infusionsopløsninger.

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantificering Glomerular fyldbarhed Fluorescent Macromolecules Brug 2-Photon mikroskopi i München Wistarrotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

En<em&gt; In vivo</em&gt; Assay til Test Blood Vessel Permeabilitet

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsåren infusioner farmakokinetisk og farmakodynamisk analyse af Taxaner i mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automatiseret Måling af lungeemfysem og Small Airway Remodeling i cigaretrøg-eksponerede mus

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Kirurgiske modeller af gastroøsofageal refluks med Mus

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualisering af Vascular og parenkymale Regeneration efter 70% Delvis hepatektomi i normale mus

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Langsigtet blodtryksmåling i Frit Flytning Mus Brug Telemetri

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re Arterialized rotte delvis lever Transplantation med en i vivo fartøj-orienterede 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Vurdering af nyrefunktion i musemodeller af glomerulær sygdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...