Name: highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Les auteurs remercient Christina Schwandt, Blanka Duvnjak et Nicola Kuhr pour leur assistance technique exceptionnelle et le Dr Dennis Sohn pour son aide à l'analyse de la fluorescence. Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 à L.C.R. et L.S. Le bailleur de rôle n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Les enquêtes ont été menées conformément aux lignes directrices décrites dans le Guide for Care and Use of Laboratory Animals (US National Institutes of Health Publication No. 85-23, révisé en 1996). Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux approbations institutionnelles pertinentes (gouvernement de l'État Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] numéro de référence 84-02.04.2012.A397).
1. Préparation d'instruments, de solution...

<ol>
	<li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy.">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li><li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule.">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+(ANG+II)+infusion+in+rats.">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li><li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice.">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li><li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes.">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li><li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool.">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity:+effects+of+molecular+size,+shape,+charge,+and+deformability.">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li><li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall.">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+Effects+of+Tempol,+NOS-,+RhoA-+and+Rac-1-inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li><li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo,+dependent+upon+reactive+oxygen+species.">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reactive+oxygen+species+(ROS)-dependent+effects+of+IL-1beta,+TNF-alpha,+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+(GFB)+in+vivo.">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo.">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li><li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability:+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol.">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li><li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma.">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats.">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hyperglycemia+induces+rapid,+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats.">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats.">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li><li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier.">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+effects+of+Tempol,+NOS,+RhoA,+and+Rac-1+inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li><li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae.">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li><li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods.">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li></ol>

La méthode présentée permet à l'investigateur de tester la perméabilité glomerulaire chez la souris d'une manière très sensible à l'aide d'un traceur. Avec cette méthode, des augmentations à court terme de la perméabilité glomerulaire peuvent être diagnostiquées en utilisant seulement de petites quantités d'urine. Les étapes les plus critiques pour maîtriser avec succès cette technique sont 1) développer l'expertise manuelle dans la chirurgie de souris, particulièrement dans l'annulation d'une veine ...

Les défauts fonctionnels ou structurels dans la barrière de filtration glomerulaire augmentent la perméabilité glomerulaire à l'albumine, ayant pour résultat la détection de l'albumine dans l'urine (albuminuria). L'albuminurie prédit les résultats cardio-vasculaireset est un marqueur important pour des dommages glomerular 1. Même de faibles niveaux d'albuminurie, se trouvant dans la plage normale, sont associés à un risque cardio-vasculaire accru1.
Dans des conditions physiologiques, l'albumine est filtrée à travers le glomerulus et est presque entièrement réabsorbée dans le système tubulaire2,3. Chez la souris, la détection de l'albumine dans l'urine est habituellement effectuée par un essai immunosorbent lié à l'enzyme d'albumine (ELISA) à partir de 24 h de collecte d'urine. Si l'urine d'une collecte d'urine de 24 h ou de l'urine spot est utilisée, de petites différences dans les concentrations d'albumine peuvent être manquées en raison de problèmes de sensibilité à l'analyse. La plupart des chercheurs, par conséquent, utilisent des modèles animaux dans lesquels l'albuminurie est induite par des dommages rénaux robustes dus aux toxines, aux drogues, et à la chirurgie rénale.
Par conséquent, la découverte d'une méthode sensible pour détecter les changements petits et transitoires dans la perméabilité glomerulaire est très importante pour le domaine. Rippe et coll. ont présenté un modèle de rat pour tester la perméabilité glomerulaire en appliquant un traceur étiqueté fluorescent, à savoir FITC-polysucrose 70 (c.-à-d., FITC-Ficoll 70), à la taille de l'albumine4. L'application de traceur permet de tester les changements à court terme de la perméabilité glomerulaire (en quelques minutes) et est très sensible4. Deux études ont utilisé la méthode traceur chez les souris5,6. Malgré ses avantages, cette méthode présente malheureusement des inconvénients : elle est techniquement très complexe, radioactive et invasive. Une analyse plus approfondie de l'urine n'est effectuée qu'en utilisant la filtration de gel ou la taille-exclusion HPLC5,6.
Dans cet article, nous présentons une méthode alternative, sensible, non radioactive, et rapide pour mesurer la perméabilité glomerular chez les souris utilisant fluorescently étiqueté FITC-polysucrose 70. En introduisant un cathéter transurétral, la collecte d'urine est moins invasive que la perforation de la vessie, l'urérotomie et l'épétére suprapubienne, et permet la collecte d'urine au moins toutes les 30 min. L'analyse d'urine est effectuée à partir de petites quantités (5 l) à l'aide d'un lecteur de plaques fluorescentes. Les concentrations de traceurs dans l'urine sont normalisées aux concentrations de créatinine dans l'urine à l'aide d'un test de créatinine enzymatique.
Par conséquent, cette nouvelle méthode offre un outil sensible pour étudier les dommages glomerulaires tôt avec la perméabilité glomerular accrue.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for neck cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;"></td>
			<td style="width:77px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">BD Insyte Autoguard</td>
			<td style="width:77px;">BD</td>
			<td style="width:101px;">381823</td>
			<td>&#160;urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Multimode Detector DTX 880</td>
			<td style="width:77px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:257px;">384 well microtiterplate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">262260</td>
			<td style="width:235px;">384 well platte</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Creatinine Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">MAK080</td>
			<td>to measure creatinine concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">96 well plate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">260836</td>
			<td>for creatinine assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">FITC-labeled polysuccrose 70</td>
			<td style="width:77px;">TBD Consultancy</td>
			<td style="width:101px;">FP70</td>
			<td>FITC-ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Angiotensin II</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9525</td>
			<td>used to test glomerular permeability</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP-98A</td>
			<td style="width:77px;">Softron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for blood pressure measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">OTS 40.3040</td>
			<td style="width:77px;">Medite</td>
			<td style="width:101px;">01-4005-00</td>
			<td>heating plate for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Instillagel 6mL</td>
			<td style="width:77px;">Farco-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Exacta</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">GT415</td>
			<td>shaver</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70

La perte d'albumine dans l'urine (albuminurie) prédit les résultats cardiovasculaires. Dans des conditions physiologiques, de petites quantités d'albumine sont filtrées par le glomerulus et réabsorbées dans le système tubulaire jusqu'à ce que la limite d'absorption soit atteinte. Les premières augmentations de la filtration pathologique de l'albumine peuvent, par conséquent, être manquées en analysant l'albuminurie. Par conséquent, l'utilisation de traceurs pour tester la permsélectivité glomerulaire semble avantageuse. L'isothiocyanate de fluorescéine étiqueté fluorescent (FITC)-polysucrose (c.-à-d., FITC-Ficoll), peut être employé pour étudier la permselectivité glomerulaire. Les molécules de FITC-polysucrose sont librement filtrées par le glomerulus mais ne sont pas réabsorbées dans le système tubulaire. Chez la souris et le rat, fitC-polysucrose a été étudié dans des modèles de perméabilité glomerulaire en utilisant des procédures techniquement complexes (c.-à-d., mesures radioactives, chromatographie liquide haute performance [HPLC], filtration de gel). Nous avons modifié et facilité un protocole basé sur le traceur FITC-polysucrose pour tester les augmentations précoces et petites de la perméabilité glomerulaire à FITC-polysucrose 70 (taille de l'albumine) chez les souris. Cette méthode permet des analyses d'urine répétitives avec de petits volumes d'urine (5 L). Ce protocole contient des informations sur la façon dont le traceur FITC-polysucrose 70 est appliqué par voie intraveineuse et l'urine est recueillie par l'intermédiaire d'un cathéter urinaire simple. L'urine est analysée par un lecteur de plaque de fluorescence et normalisée à un marqueur de concentration d'urine (créatinine), évitant ainsi des procédures techniquement complexes.

Comme le montre la figure 2, la méthode pour tester la perméabilité glomerulaire chez la souris est constituée en trois phases. La première phase est appelée phase de préparation, dans laquelle un cathéter urinaire et un cathéter veineux central sont placés. La deuxième phase est appelée phase d'équilibre, en commençant par une injection intraveineuse de bolus de FITC-polysucrose 70 et suivie de l'infusion continue de FITC-polysucrose 70 pendant...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Ici, nous présentons un protocole pour tester la perméabilité glomerulaire chez les souris à l'aide d'un traceur hautement sensible et non radioactif. Cette méthode permet des analyses d'urine répétitives avec de petits volumes d'urine.

Mesure très sensible de la perméabilité glomerulaire chez les souris avec fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la néphrologie sur le rôle de la perméabilité glomerular dans les maladies rénales. Le principal avantage de cette technique est que de petites augmentations transitoires de la perméabilité glomerular sont détectées à l’aide d’un traceur fluorescent étiqueté plomb. Après l’anesthésie, placez un cathéter urinaire chez la souris femelle.Placez la souris dans la récumbence dorsale. Serrez le bas-ventre et trouvez l’ostium urétral. Obtenir la partie plastique du cathéter d’un angiocathéter de 22 G et le lubrifier avec du gel de xylocaine.Utilisez l’index gauche pour placer une tension soigneuses sur le bas-ventre et introduire le cathéter de trois millimètres dans l’ostium urétral tout en faisant le parallèle avec l’axe urétral distal. Tournez le dessus de l’angiocathéter à 180 degrés en gardant la pointe dans l’ostium urétral et en maintenant l’axe de l’urètre. Ensuite, introduisez le cathéter sept millimètres plus loin dans la souris afin qu’il soit placé dans la vessie.Placez un tube brun de 1,5 millilitre sur le dessus de l’angiocathéter pour recueillir l’urine. Appliquer un millilitre de chlorure de sodium de 0,9 % sous-cutané pour améliorer la production d’urine. Rasez le cou de la souris et placez-le en récumbence avec la tête vers le chirurgien.Hyper étendre la tête de la souris avec une bande. Désinfecter le cou avec 70% d’isopropanol. À l’aide d’une pince à épiler et d’une paire de ciseaux, faire une incision cutanée de cinq millimètres sous la mâchoire.Couper la peau d’environ un centimètre en direction du sternum jusqu’à ce que le milieu du sternum soit atteint. Utilisez une paire de ciseaux. Disséquer soigneusement la peau sur le côté droit du cou.Faire une incision rectangulaire de la peau à droite pour exposer les tissus mous du cou. Veillez à ne pas endommager la veine jugulaire. Utilisez une paire de ciseaux et une pince à épiler pour fixer les volets de la peau avec deux pinces.À l’aide de la pointe de la pince fine, exposer soigneusement la veine jugulaire par une préparation émoussée. Si nécessaire, retirer les tissus avec de beaux ciseaux. Évitez les blessures aux branches veineuses.Placez et fermez une ligature avec un fil de soie à la partie distale de la veine jugulaire visible qui est vers la tête de la souris. Fixer le fil de soie avec un ruban adhésif pour mettre la tension sur la ligature. Cela assure une légère tension sur la veine jugulaire.Préparer une ligature autour de la partie proximale de la veine jugulaire. Après cela, remplissez le cathéter avec la solution d’équilibrage et de fusion. Fixer le cathéter avec un ruban adhésif de sorte que le cathéter aligne la veine jugulaire.Contrôle des bulles pour éviter l’embolie de l’air. Soulevez la veine jugulaire avec de fines pinces à épiler sur le site de l’insertion. Aligner le tube parallèlement à la veine jugulaire et percer la veine jugulaire visant le lumen.Insérer pendant environ deux à quatre millimètres parallèlement à l’axe de la veine jugulaire. Évitez les mouvements rapides. Fermez la ligature pour fixer le cathéter.Contrôle de l’étanchéité de la ligature en regardant attentivement à travers le microscope. Placez un écouvillon humide sur le site de la chirurgie. Placez le brassard de queue au bas de la queue de la souris pendant que la souris se couche dans la couchée dorsale.Démarrez les mesures et répétez-les dix fois par point de temps. Si les mesures de la pression artérielle ne semblent pas correctes et que de fausses données sont produites, ajustez la position du brassard de queue. Avant la phase d’équilibrage, changer le tube de collecte urinaire et le placer sur la glace.Pliez un écouvillon et placez-le autour du cathéter du petit récipient qui est introduit dans la veine jugulaire. Placez une pince sur l’écouvillon pour abolir le flux sanguin rétrograde ou l’embolie de l’air. Connectez une aiguille de 27 G avec une seringue d’un millilitre remplie du bolus FITC à l’extrémité du cathéter du petit navire.Ouvrez la pince et appliquez le bolus FITC de 100 microlitres. Fermez à nouveau la pince et connectez le cathéter plus grand avec le cathéter plus petit. Rouvrir la pince et démarrer la pompe à seringues avec un débit de 0,008 millilitre par minute.Poursuivre l’infusion pendant 60 minutes. Dans cette phase, les médicaments efficaces sur la sélectivité perm glomerular sont étudiés. Changez le point de temps de forme de tube urinaire zéro minute à un autre tube brun de 1,5 millilitre.Placez un écouvillon autour du cathéter du petit récipient et déconnectez le grand cathéter du cathéter du petit navire. Remplissez la seringue avec la solution de phase expérimentale. Placez-le dans la pompe à seringues et laissez la pompe à perfusion fonctionner de sorte que le grand cathéter soit rempli de la solution de phase expérimentale.Reconnecter les cathéters tout en évitant l’embolie de l’air et rouvrir la pince. Démarrez la pompe à seringues à un débit de 0,008 millilitre par minute. Continuer à faire fonctionner la pompe à seringues pendant 60 minutes et recueillir l’urine dans le tube urinaire par la suite.Placer le tube d’urine sur la glace. Dans cette étude, le balayage de fluorescence de l’urine indigène de souris montre un pic à 395 nanomètres. Le polysucrose FITC 70 à une concentration de 40 microgrammes par millilitre dans l’urine de souris affiche un maximum de fluorescence à 525 nanomètres.L’urine de souris ne perturbe pas la mesure de fluorescence de la polysucrose FITC 70. À l’admission de 525 nanomètres augmentant les concentrations de polysucrose FITC 70 montre une intensité de fluorescence accrue. Cette méthode est également capable de détecter les différences de perméabilité glomerular.Les colonnes blanches représentent la polysucrose FITC 70 niveaux avant le début de la stimulation de l’angiotensine II dans la phase expérimentale. Après des dosages pendant 60 minutes, la perméabilité glomerular a augmenté comparée au groupe témoin. Angiotensin II laver la perméabilité glomerular diminuée.Le polysucrose FITC 70 niveaux a diminué après 60 minutes supplémentaires de stimulation angiotensine II ou 60 minutes de lavage angiotensine II. L’augmentation de la perméabilité glomerular due à l’angiotensine II pourrait être bloquée par un bloqueur de récepteur d’angiotensine II. La tension artérielle surveillée par la méthode de manchette de queue n’a pas montré des différences significatives entre les groupes traités de contrôle et d’angiotensine II.Tout en essayant cette procédure, il est important d’éviter l’embolie de l’air lors de la modification des solutions d’infusion.

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Identification et isolement des cellules ne se divisant lentement dans le glioblastome humain Utilisation carboxy fluorescéine succinimidyl ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Recherche

Médecine

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Quantifier glomérulaire perméabilité des macromolécules fluorescentes en microscopie 2 photons à Munich chez le rat Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Un<em&gt; In vivo</emTest&gt; Tester la perméabilité des vaisseaux sanguins

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Infusions de l&#39;artère carotide pour pharmacocinétiques et pharmacodynamiques Analyse des taxanes chez la souris

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Mesure automatisée de l&#39;emphysème pulmonaire et petites remodelage des voies aériennes dans la cigarette de fumée souris exposées

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Les modèles de chirurgie de reflux gastro-œsophagien avec des souris

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualisation des vasculaire et parenchymateuse Régénération après 70% hépatectomie partielle chez des souris normales

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Mesure la pression artérielle à long terme chez la souris Librement mobile à l&#39;aide de télémesure

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-artérialisé Transplantation de foie partielle de Rat in vivo axée sur le navire 70 % hépatectomie

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Évaluation de la fonction rénale chez les modèles murins de la maladie glomérulaire

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...