Name: highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00
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著者らは、クリスティーナ・シュヴァント、ブランカ・デュヴンジャク、ニコラ・クルに対し、卓越した技術支援と、蛍光スキャンに関する彼の助けに対するデニス・ソーン博士に感謝しています。この研究は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG)SFB 612 TP B18のL.C.R.およびL.S.への助成金によって支えられた。資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持ちはありませんでした。

調査は、実験動物のケアと使用に関するガイド(米国国立衛生研究所第85-23号、1996年改訂)に記載されたガイドラインに従って実施されました。すべての動物実験は、関連する機関の承認に従って行われました(州政府ランデサムト・フュル・ナチュラル、ウムウェルト・ウンド・ヴェルブラウチャーシュッツ[LANUV]参照番号84-02.04.2012.A397)。
1. 機器、ソリューション、機器の?...

<ol>
	<li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy.">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li><li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule.">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+(ANG+II)+infusion+in+rats.">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li><li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice.">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li><li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes.">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li><li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool.">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity:+effects+of+molecular+size,+shape,+charge,+and+deformability.">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li><li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall.">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+Effects+of+Tempol,+NOS-,+RhoA-+and+Rac-1-inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li><li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo,+dependent+upon+reactive+oxygen+species.">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reactive+oxygen+species+(ROS)-dependent+effects+of+IL-1beta,+TNF-alpha,+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+(GFB)+in+vivo.">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo.">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li><li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability:+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol.">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li><li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma.">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats.">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hyperglycemia+induces+rapid,+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats.">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats.">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li><li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier.">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+effects+of+Tempol,+NOS,+RhoA,+and+Rac-1+inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li><li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae.">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li><li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods.">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li></ol>

提示された方法は、研究者がトレーサーを使用して非常に敏感な方法でマウスの糸球体透過性をテストすることを可能にする。この方法では、糸球体透過性の短期的な増加は、少量の尿のみを使用して診断することができる。この技術をうまくマスターするための最も重要なステップは、1)マウス手術、特に中枢静脈のカナンテーションにおける手動専門知識の開発、2)粘膜に害を与えること...

糸球体濾過バリア内の機能的または構造的欠陥は、アルブミンに対する糸球透過性を増加させ、尿中のアルブミンの検出(アルブミン尿)をもたらす。アルブミン尿は心血管の転帰を予測し、糸球体損傷1の重要なマーカーである。アルブミン尿の低レベルでさえ、正常範囲内に横たわって、増加した心血管リスク1に関連している。
生理学的条件下では、アルブミンは糸球体を通して濾過され、管状システム2、3でほぼ完全に再吸収される。マウスでは、尿中のアルブミンの検出は、通常、尿採取の24時間からアルブミン酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって行われる。24時間の尿採取またはスポット尿からの尿を使用すると、アッセイ感受性の問題のためにアルブミン濃度の小さな違いが見逃される可能性があります。したがって、ほとんどの研究者は、毒素、薬物、腎外科による強い腎損傷によってアルブミン尿が誘発される動物モデルを使用する。
したがって、糸球体透過性の小さくて一過性の変化を検出する敏感な方法の発見は、フィールドにとって非常に重要である。Rippeらは、蛍光標識トレーサー、すなわちFITC-ポリスクロース70(すなわち、FITC-Ficoll 70)をアルブミン4の大きさで適用することにより、糸球体透過性を試験するラットモデルを提示した。トレーサーアプリケーションは、糸球体透過性(数分以内)の短期的な変化のテストを可能にし、非常に敏感な4.2つの研究は、マウス5、6でトレーサー法を使用している。その利点にもかかわらず、この方法は、残念ながら、欠点を持っています:それは技術的に非常に複雑で、放射性、および侵襲的です。尿のさらなる分析は、ゲル濾過またはサイズ排除HPLC5、6を用いてのみ行う。
本論文では、蛍光標識FITC-ポリスクロース70を用いてマウスの糸球体透過性を測定する代替的、敏感、非放射性、および高速方法を提示する。経尿道カテーテルを導入することにより、尿採取は膀胱穿刺、尿道切除術、および上腹部カテーテル塗布よりも侵襲性が低く、少なくとも30分毎に尿採取が可能である。蛍光プレートリーダー。尿中のトレーサー濃度は、酵素クレアチニンアッセイを使用して尿中のクレアチニン濃度に正規化される。
したがって、この新しい方法は、糸球体透過性の増加と早期糸球体損傷を研究するための敏感なツールを提供しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for neck cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;"></td>
			<td style="width:77px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">BD Insyte Autoguard</td>
			<td style="width:77px;">BD</td>
			<td style="width:101px;">381823</td>
			<td>&#160;urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Multimode Detector DTX 880</td>
			<td style="width:77px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:257px;">384 well microtiterplate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">262260</td>
			<td style="width:235px;">384 well platte</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Creatinine Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">MAK080</td>
			<td>to measure creatinine concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">96 well plate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">260836</td>
			<td>for creatinine assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">FITC-labeled polysuccrose 70</td>
			<td style="width:77px;">TBD Consultancy</td>
			<td style="width:101px;">FP70</td>
			<td>FITC-ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Angiotensin II</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9525</td>
			<td>used to test glomerular permeability</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP-98A</td>
			<td style="width:77px;">Softron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for blood pressure measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">OTS 40.3040</td>
			<td style="width:77px;">Medite</td>
			<td style="width:101px;">01-4005-00</td>
			<td>heating plate for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Instillagel 6mL</td>
			<td style="width:77px;">Farco-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Exacta</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">GT415</td>
			<td>shaver</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70

尿中のアルブミンの損失(アルブミン尿)は、心血管の結果を予測します。生理学的条件下では、少量のアルブミンを糸球体で濾過し、吸収限界に達するまで管状系で再吸収する。病理学的アルブミン濾過の早期増加は、したがって、アルブミン尿を分析することによって見逃されがちである。したがって、糸球体パーマ選択性をテストするためにトレーサーを使用することは有利と思われる。蛍光標識標識フッ素イソチオシアネート(FITC)-ポリスクロース(すなわち、FITC-Ficoll)は、糸球体透過性を研究するために使用することができる。FITC-ポリスクロース分子は糸球体によって自由に濾過されるが、管状系では再吸収されない。マウスおよびラットにおいて、FITC-ポリスクロースは、技術的に複雑な手順(すなわち、放射性測定、高性能液体クロマトグラフィー[HPLC]、ゲル濾過)を用いて糸球体透過性のモデルで調査されている。我々は、マウスにおけるFITC-ポリスクロース70(アルブミンのサイズ)に対する糸球透過性の早期および小さな増加をテストするために、FITC-ポリスクローストレーサーベースのプロトコルを改変し、促進した。この方法は小さい尿容積(5 μL)の反復的な尿の分析を可能にする。このプロトコルは、トレーサーFITC-ポリスクロース70が静脈内に適用され、尿が単純な尿カテーテルを介して収集される方法に関する情報を含む。尿は蛍光プレートリーダーを介して分析され、尿濃度マーカー(クレアチニン)に正規化され、技術的に複雑な手順を回避します。

図2に示すように、マウスにおける糸球体透過性を試験する方法は、3つの段階で構築されている。第1段階は、尿カテーテルと中央静脈カテーテルが置かれる調製段階と呼ばれる。第2段階は平衡化段階と呼ばれ、FITC-ポリスクロース70の静脈内ボーラス注入から始まり、続いてFITC-ポリスクロース70を60分間連続注入する。最後のフェーズは実験段?...

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Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

ここでは、高感度で非放射性トレーサーを用いてマウスの糸球体透過性を試験するプロトコルを提示する。この方法は、小さな尿量で反復的な尿分析を可能にします。

フルオレセインイソチオシアネート-ポリスクロースを用いたマウスにおける糸球透過性の高感度測定 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

この方法は、腎臓病における糸球体透過性の役割に関する腎臓学分野の主要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、蛍光鉛標識トレーサーを用いて、糸球体透過性の小さな一過性の増加が検出される点である。麻酔後、雌マウスに尿カテーテルを入れる。マウスを下振れ状態に置きます。下腹部を締め、尿道オスチウムを見つけます。22G血管カテーテルのカテーテルのプラスチック部分を入手し、キシロカインゲルで潤滑します。左人差し指を使って下腹部に慎重な張力を入れ、遠位尿道軸を平行しながらカテーテルを3ミリメートル尿道オスチウムに導入します。尿道オスティウム内の先端を維持し、尿道の軸を維持することにより、血管カテーテルの上部を180度回します。次に、カテーテルをさらに7ミリメートルマウスに導入し、膀胱内に置きます。1.5ミリリットルの茶色のチューブを血管カテーテルの上に置き、尿を採取します。尿の生産を高めるために皮下0.9%の塩化ナトリウムの1ミリリットルを適用します。マウスの首を剃り、外科医に向かって頭で債務に置きます。ハイパーはテープでマウスの頭を伸ばす。70%イソプロパノールで首を消毒する。トゥイザーとハサミを使用すると、顎の下に5ミリメートルの皮膚切開を行います。胸骨の真ん中に達するまで、胸骨の方向に約1センチメートルの皮膚を切断します。はさみを使用してください。首の右側に皮膚を慎重に解剖します。首の軟部組織を露出させるために右に皮膚の長方形の切開を行います。頸静脈を損傷しないように注意してください。はさみとトゥイザーを使用して、2つのクランプで皮膚のフラップを固定します。細かいツイーザーの先端を使用して、鈍い調製によって頸静脈を慎重に露出させる。必要に応じて、細かいはさみで組織を取り除きます。静脈の枝の損傷を避ける。マウスの頭に向かって見える頸静脈の遠位部分に絹糸で合字を置いて閉じます。合字に緊張を入れるテープでシルクの糸を固定します。これは頸静脈のわずかな緊張を保障する。頸静脈の近位部分の周りに合字を準備します。その後、カテーテルを平衡融解と融合液で満たします。カテーテルが頸静脈を揃えるように、カテーテルをテープで固定します。空気塞栓症を避けるために気泡の制御。挿入部位で細かいピンセットで頸静脈を持ち上げます。管を頸静脈に平行に位置合わせし、管腔を目指す頸静脈を穿刺する。頸静脈の軸線と平行に約2~4ミリメートル挿入します。活発な動きを避けてください。合字を閉じてカテーテルを固定します。顕微鏡を通して注意深く見ることによって合字の締まりのための制御。手術の部位の上に湿った綿棒を置きます。マウスが後尻尾に置かれながら、マウスの尻尾の底に尾の袖口を置きます。測定を開始し、時間ポイントごとに 10 回繰り返します。血圧測定が正しくないと思われ、誤ったデータが生成される場合は、テールカフの位置を調整します。平衡段階の前に、尿採取管を交換し、氷の上に置きます。綿棒を折り畳み、頸静脈に導入された小さな血管カテーテルの周りに置きます。逆行血流または空気塞栓症を廃止するために綿棒の上にクランプを置きます。27Gの針をFITCボーラスで満たされた1ミリリットルの注射器と小さな容器カテーテルの端に接続します。クランプを開き、100マイクロリットルFITCボーラスを塗布します。クランプをもう一度閉じて、より大きなカテーテルを小さいカテーテルと接続します。クランプを再度開き、毎分0.008ミリリットルの流量でシリンジポンプを始動します。注入を60分間続けます。この段階では、糸球体のパーマ選択性に対する有効な薬剤を調査する。尿管のフォームタイムポイントをゼロ分に変更して、別の1.5ミリリットルの茶色のチューブにします。小さな容器カテーテルの周りに綿棒を置き、小さな容器カテーテルから大きなカテーテルを取り外します。シリンジを実験段階溶液で満たします。注射器ポンプに入れ、注入ポンプを実行させて、大きなカテーテルが実験相溶液で満たされるようにします。空気塞栓症を避けながらカテーテルを再接続し、クランプを再度開きます。1分間に0.008ミリリットルの流量でシリンジポンプを開始します。注射器ポンプを60分間継続し、尿管内で尿を採取する。尿管を氷の上に置きます。本研究では、ネイティブマウス尿の蛍光スキャンは395ナノメートルでピークを示す。FITCポリスクロース70は、マウス尿中の1ミリリットル当たり40マイクログラムの濃度で、525ナノメートルで最大蛍光を示す。マウス尿はFITCポリスクロース70の蛍光測定を妨げない。FITCポリスクロース70の濃度を増加する525ナノメートルの入院時に、蛍光強度の増加を示す。この方法は、糸球体透過性の違いを検出することもできる。白いカラムは、実験段階におけるアンジオテンシンII刺激の開始前のFITCポリスクロース70レベルを表す。60分間の投与後、糸球体透過性は対照群と比較して増加した。アンジオテンシンIIは、球状透過性の低下を洗い流す。FITCポリスクロース70レベルは、アンジオテンシンII刺激の追加60分後またはアンジオテンシンII洗浄の60分後に減少した。アンジオテンシンIIによる糸球体透過性の増加は、アンジオテンシンII受容体遮断薬によって遮断され得る。テールカフ法によってモニタリングされた血圧は、対照群とアンジオテンシンII治療群との間に有意な差を示さなかった。この手順を試みる間、輸液溶液を変更する際に空気塞栓症を避けるために重要です。

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

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再門脈部分肝移植のラット体内血管指向 70% 肝切除

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Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

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