Name: highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Forfatterne takker Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, og Nicola Kuhr for deres eksepsjonelle tekniske assistanse og Dr. Dennis Sohn for hans hjelp med fluorescens Scan. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 til L.C.R. og L.S. Funder hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.

Undersøkelsene ble utført i henhold til retningslinjene som er skissert i veiledningen for Stell og bruk av Laboratoriedyr (US National Institutes of Health publikasjon nr. 85-23, revidert 1996). Alle dyre eksperimenter ble utført i samsvar med relevante institusjonelle godkjenninger (State Government Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referansenummer 84-02.04.2012. A397).
1. utarbeidelse av instrumenter, løsninger og utstyr
<ol><li>Rekonstituer FITC-polysucrose 7...

<ol>
	<li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy.">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li><li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule.">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+(ANG+II)+infusion+in+rats.">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li><li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice.">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li><li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes.">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li><li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool.">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity:+effects+of+molecular+size,+shape,+charge,+and+deformability.">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li><li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall.">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+Effects+of+Tempol,+NOS-,+RhoA-+and+Rac-1-inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li><li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo,+dependent+upon+reactive+oxygen+species.">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reactive+oxygen+species+(ROS)-dependent+effects+of+IL-1beta,+TNF-alpha,+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+(GFB)+in+vivo.">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo.">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li><li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability:+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol.">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li><li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma.">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats.">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hyperglycemia+induces+rapid,+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats.">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats.">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li><li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier.">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+effects+of+Tempol,+NOS,+RhoA,+and+Rac-1+inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li><li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae.">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li><li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods.">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li></ol>

Den presenterte metoden gjør det mulig for etterforsker å teste glomerulær permeabilitet i mus på en svært følsom måte ved hjelp av en Tracer. Med denne metoden, kortsiktige økninger i glomerulær permeabilitet kan diagnostiseres ved hjelp av bare små mengder urin. De mest kritiske trinnene for vellykket mestring denne teknikken er 1) utvikle manuell ekspertise i musen kirurgi, spesielt i kanyleringen av en sentral vene, 2) plassere urin kateter uten å skade slimhinnen, og 3) manuell ekspertise i håndtering 38...

Funksjonelle eller strukturelle defekter innenfor glomerulær filtrerings barriere øke glomerulær permeabilitet til albumin, noe som resulterer i påvisning av albumin i urinen (albuminuri). Albuminuri spår kardiovaskulære utfall og er en viktig markør for glomerulær Kader1. Selv lave nivåer av albuminuri, ligger innenfor normalområdet, er forbundet med økt kardiovaskulær risiko1.
Under fysiologiske forhold, er albumin filtrert gjennom glomerulus og er nesten helt reabsorberes i rørformede system2,3. I mus, påvisning av albumin i urinen er vanligvis utført av en albumin enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (ELISA) fra 24 h av urin samling. Hvis urin fra en 24 h urin samling eller flekk urin brukes, små forskjeller i albumin konsentrasjoner kan bli savnet på grunn av analysen følsomhet problemer. De fleste forskere derfor bruke dyremodeller der albuminuri er indusert av robust nyreskader på grunn av giftstoffer, narkotika, og nyre kirurgi.
Derfor er funn av en følsom metode for å oppdage små og forbigående endringer i glomerulær permeabilitet svært viktig for feltet. Rippe et al. har presentert en rotte modell for å teste glomerulær permeabilitet ved å bruke en fluorescensmerkete merket Tracer, nemlig FITC-polysucrose 70 (dvs. FITC-Ficoll 70), på størrelse med albumin4. Den Tracer programmet tillater testing av kortsiktige endringer i glomerulær permeabilitet (i løpet av minutter) og er svært følsom4. To studier har brukt Tracer metoden i mus5,6. Til tross for sine fordeler, denne metoden, dessverre, har ulemper: det er teknisk svært kompleks, radioaktiv, og invasiv. Ytterligere analyse av urinen oppnås bare ved bruk av gel-filtrering eller størrelsesekskludering HPLC.
Innenfor dette papiret, presenterer vi en alternativ, følsom, radioaktivt, og rask metode for å måle glomerulær permeabilitet i mus ved hjelp av fluorescensmerkete merket FITC-polysucrose 70. Ved å innføre et Transurethral kateter, urin samling er mindre invasiv enn blære punktering, urethrotomy, og suprapubisk kateter søknad, og tillater urin samling minst hver 30 min. urin analyse utføres fra små mengder (5μL) ved hjelp av en fluorescerende plate leser. Tracer konsentrasjoner i urinen er normalisert til kreatinin konsentrasjoner i urinen ved hjelp av en enzymatisk kreatinin analysen.
Derfor, denne romanen metoden tilbyr et følsomt verktøy for å studere tidlig glomerulær skade med økt glomerulær permeabilitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for neck cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;"></td>
			<td style="width:77px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">BD Insyte Autoguard</td>
			<td style="width:77px;">BD</td>
			<td style="width:101px;">381823</td>
			<td>&#160;urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Multimode Detector DTX 880</td>
			<td style="width:77px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:257px;">384 well microtiterplate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">262260</td>
			<td style="width:235px;">384 well platte</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Creatinine Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">MAK080</td>
			<td>to measure creatinine concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">96 well plate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">260836</td>
			<td>for creatinine assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">FITC-labeled polysuccrose 70</td>
			<td style="width:77px;">TBD Consultancy</td>
			<td style="width:101px;">FP70</td>
			<td>FITC-ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Angiotensin II</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9525</td>
			<td>used to test glomerular permeability</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP-98A</td>
			<td style="width:77px;">Softron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for blood pressure measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">OTS 40.3040</td>
			<td style="width:77px;">Medite</td>
			<td style="width:101px;">01-4005-00</td>
			<td>heating plate for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Instillagel 6mL</td>
			<td style="width:77px;">Farco-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Exacta</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">GT415</td>
			<td>shaver</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70

Tapet av albumin i urinen (albuminuri) spår kardiovaskulære utfall. Under fysiologiske forhold filtreres små mengder albumin av glomerulus og reabsorberes i rørsystemet frem til absorpsjons grensen nås. Tidlig økning i patologisk albumin filtrering kan dermed bli savnet ved å analysere albuminuri. Derfor, bruk av Bevegelsesuskarphet å teste glomerulær permselectivity synes fordelaktig. Fluorescensmerkete merket Tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (dvs. FITC-Ficoll), kan brukes til å studere glomerulær permselectivity. FITC-polysucrose molekyler er fritt filtrert av glomerulus men ikke reabsorberes i rørformede systemet. I mus og rotter, FITC-polysucrose har blitt undersøkt i modeller av glomerulær permeabilitet ved hjelp av teknisk komplekse prosedyrer (dvs. radioaktive målinger, høy ytelse væske kromatografi [HPLC], gel filtrering). Vi har endret og tilrettelagt en FITC-polysucrose Tracer-basert protokoll for å teste tidlig og små økninger i glomerulær permeabilitet til FITC-polysucrose 70 (størrelsen av albumin) i mus. Denne metoden tillater repeterende urin analyser med små urin mengder (5 μL). Denne protokollen inneholder informasjon om hvordan Tracer FITC-polysucrose 70 brukes intravenøst og urin er samlet inn via en enkel urin kateter. Urin analyseres via en fluorescens plate leser og normalisert til en urin konsentrasjon markør (kreatinin), og dermed unngår teknisk komplekse prosedyrer.

Som avbildet i figur 2, er metoden for å teste glomerulær permeabilitet i mus bygget opp i tre faser. Den første fasen kalles forberedelsesfasen, der et urin kateter og et sentralt venekateter er plassert. Den andre fasen kalles likevekts fasen, og starter med en intravenøs bolus injeksjon av FITC-polysucrose 70 og etterfulgt av kontinuerlig infusjon av FITC-polysucrose 70 for 60 min. Den siste fasen kalles den eksperimentelle fasen. I denne fasen, infusj...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Her presenterer vi en protokoll for å teste glomerulær permeabilitet i mus ved hjelp av en svært følsom, radioaktivt Tracer. Denne metoden tillater repeterende urin analyser med små urin volumer.

Svært følsom måling av Glomerulær permeabilitet i mus med Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i nephrology-feltet om rollen som glomerulær permeabilitet i nyresykdom. Den største fordelen med denne teknikken er at små og forbigående økninger av glomerulær permeabilitet oppdages ved hjelp av en fluorescerende blymerket tracer. Etter anestesi, legg et urinkateter i den kvinnelige musen.Plasser musen i dorsal recumbency. Stram underlivet og finn urinrøret ostium. Få plastdelen av kateteret til et 22 G angiocatheter og smør det med xylokaingel.Bruk venstre pekefinger til å plassere forsiktig spenning på underlivet og introdusere kateteret tre millimeter i urinrøret mens du paralleller den distale uretralaksen. Vri toppen av angiocatheter 180 grader ved å holde spissen innenfor urinrøret ostium og opprettholde aksen av urinrøret. Deretter introduserer kateteret syv millimeter lenger inn i musen slik at det er plassert i blæren.Plasser et 1,5 milliliter brunt rør over toppen av angiocatheter for å samle urinen. Påfør en milliliter på 0,9% natriumklorid subkutant for å forbedre urinproduksjonen. Barber musens hals og plasser den i recumbency med hodet mot kirurgen.Hyper utvider musens hode med et bånd. Desinfiser nakken med 70% isopropanol. Ved hjelp av en pinsett og en saks gjør en fem millimeter hud snitt under kjeven.Skjær huden ca en centimeter i brystbenets retning til midten av brystbenet er nådd. Bruk en saks. Disseker huden forsiktig til høyre side av nakken.Lag et rektangulært snitt av huden til høyre for å utsette det myke vevet i nakken. Vær forsiktig så du ikke skader halsvenen. Bruk en saks og en pinsett for å fikse hudklaffene med to klemmer.Bruk spissen av den fine pinsett, utsett forsiktig halsvenen ved sløv forberedelse. Fjern om nødvendig vev med fin saks. Unngå skade på venegrener.Plasser og lukk en ligatur med en silketråd på den distale delen av den synlige halsvenen som er mot musens hode. Fest silketråden med et bånd for å sette spenning på ligaturen. Dette sikrer liten spenning på halsvenen.Forbered en ligatur rundt den proksimale delen av halsvenen. Deretter fyller du kateteret med likevekts- og fusjonsløsningen. Fest kateteret med et bånd slik at kateteret justerer halsvenen.Kontroll for bobler for å unngå luftemboli. Løft halsvenen med fine pinsett på innsettingsstedet. Juster slangen parallelt med halsvenen og punkter halsvenen som sikter mot lumen.Sett inn i omtrent to til fire millimeter parallelt med aksen i halsvenen. Unngå raske bevegelser. Lukk ligaturen for å fikse kateteret.Kontroll for tetthet av ligaturen ved å se nøye gjennom mikroskopet. Sett en fuktig vattpinne over operasjonsstedet. Plasser halemansjetten nederst på musehalen mens musen ligger i dorsal recumbency.Start målingene og gjenta dem ti ganger per tidspunkt. Hvis blodtrykksmålinger ikke virker riktige og falske data produseres, justerer du posisjonen til halemansjetten. Før likevektsfasen, bytt urinoppsamlingsrøret og legg det på is.Brett en vattpinne og legg den rundt det lille karkateteret som introduseres i halsvenen. Plasser en klemme over vattpinnen for å avskaffe retrograd blodstrømmen eller luftemboli. Koble en 27 G kanyle med en en millimetersprøyte fylt med FITC bolus til enden av det lille karkateteret.Åpne klemmen og påfør 100 mikroliter FITC bolus. Lukk klemmen igjen og koble det større kateteret til det mindre kateteret. Åpne klemmen igjen og start sprøytepumpen med en strømningshastighet på 0,008 milliliter per minutt.Fortsett infusjonen i 60 minutter. I denne fasen undersøkes de effektive stoffene på glomerulær perm selektivitet. Endre urinrøret form tidpunkt null minutt til en annen 1,5 milliliter brunt rør.Sett en vattpinne rundt det lille karkateteret og koble det store kateteret fra det lille karkateteret. Fyll sprøyten med den eksperimentelle faseoppløsningen. Plasser den i sprøytepumpen og la infusjonspumpen gå slik at det store kateteret er fylt med den eksperimentelle faseløsningen.Koble til kateterene igjen samtidig som du unngår luftemboli og åpner klemmen igjen. Start sprøytepumpen med en strømningshastighet på 0,008 milliliter per minutt. Fortsett å kjøre sprøytepumpen i 60 minutter og samle urinen i urinrøret etterpå.Plasser urinrøret på isen. I denne studien viser fluorescensskanning av innfødt musurin en topp på 395 nanometer. FITC polysukrose 70 med en konsentrasjon på 40 mikrogram per milliliter i museurin viser en fluorescens maksimum på 525 nanometer.Museurin forstyrrer ikke fluorescensmålingen av FITC polysukrose 70. Ved opptak av 525 nanometer øker konsentrasjonen av FITC polysukrose 70 viser en økt fluorescens intensitet. Denne metoden er også i stand til å oppdage forskjeller i glomerulær permeabilitet.De hvite søylene representerer FITC polysukrose 70 nivåer før starten av angiotensin II stimulering i eksperimentell fase. Etter doser i 60 minutter økte den glomerulære permeabiliteten sammenlignet med kontrollgruppen. angiotensin II vasker ut redusert glomerulær permeabilitet.FITC polysukrose 70 nivåer redusert etter ytterligere 60 minutter med angiotensin II stimulering eller 60 minutter med angiotensin II utvasking. Økningen i glomerulær permeabilitet på grunn av angiotensin II kan blokkeres av en angiotensin II reseptorblokker. Blodtrykk overvåket av hale mansjettmetoden viste ikke signifikante forskjeller mellom kontroll og angiotensin II behandlede grupper.Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å unngå luftemboli når du endrer infusjonsløsninger.

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantifisere Glomerular permeabilitet i Fluorescent Macromolecules Bruke 2-Photon Mikroskopi i München Wistar rotter

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

En<em&gt; In vivo</em&gt; Assay til Test Blood Vessel Permeabilitet

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Carotisar infusjoner for farmakokinetiske og farmakodynamiske Analyse av Taxaner i Mus

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automatisert Måling av lungeemfysem og Small Airway Ombygging i sigarettrøyk utsatte Mus

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Kirurgiske modeller av gastroøsofageal refluks med Mus

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualisering av Vaskulær og Parenkymalt Regeneration etter 70% Delvis hepatectomy i normale mus

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Langsiktig blodtrykksmåling i fritt bevegelige Mus Bruke Telemetri

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Nytt Arterialized Rat delvis leveren transplantasjon med en i vivo fartøyet orienterte 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Vurdering av nyrefunksjon i musen modeller av Glomerular sykdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...