Name: highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Os autores agradecem Christina Schwandt, Blanka Duvnjak, e Nicola Kuhr por sua assistência técnica excepcional e Dr. Dennis Sohn por sua ajuda com a varredura de fluorescência. Esta pesquisa foi apoiada por uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 para L.C.R. e L.S. O financiador não teve papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

As investigações foram conduzidas de acordo com as diretrizes delineadas no guia de cuidados e uso de animais de laboratório (institutos nacionais de saúde da publicação n º 85-23, revisado em 1996). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as aprovações institucionais relevantes (governo estadual Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] número de referência 84-02.04.2012. A397).
1. preparação de instrumentos, soluções e equipamentos
<...

<ol>
	<li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy.">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li><li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule.">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+(ANG+II)+infusion+in+rats.">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li><li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice.">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li><li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes.">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li><li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool.">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity:+effects+of+molecular+size,+shape,+charge,+and+deformability.">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li><li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall.">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+Effects+of+Tempol,+NOS-,+RhoA-+and+Rac-1-inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li><li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo,+dependent+upon+reactive+oxygen+species.">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reactive+oxygen+species+(ROS)-dependent+effects+of+IL-1beta,+TNF-alpha,+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+(GFB)+in+vivo.">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo.">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li><li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability:+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol.">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li><li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma.">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats.">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hyperglycemia+induces+rapid,+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats.">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats.">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li><li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier.">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+effects+of+Tempol,+NOS,+RhoA,+and+Rac-1+inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li><li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae.">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li><li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods.">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li></ol>

O método apresentado permite ao investigador testar a permeabilidade glomerular em camundongos de uma maneira muito sensível usando um traçador. Com este método, os aumentos a curto prazo na permeabilidade glomerular podem ser diagnosticados usando somente pequenas quantidades de urina. As etapas mais críticas para dominar com sucesso esta técnica são 1) desenvolver a perícia manual na cirurgia do rato, especial no canulação de uma veia central, 2) coloc o cateter urinário sem prejudicar a mucosa, e 3) períci...

Defeitos funcionais ou estruturais dentro da barreira de filtração glomerular aumentam a permeabilidade glomerular à albumina, resultando na detecção de albumina na urina (albuminúria). A albuminúria preafirma o desfecho cardiovascular e é um importante marcador para lesão glomerular1. Mesmo os baixos níveis de albuminúria, encontrando-se dentro da escala normal, são associados com um risco cardiovascular aumentado1.
condições fisiológicas, a albumina é filtrada através do glomérulo e é quase completamente reabsorvida no sistema tubular2,3. Em camundongos, a detecção de albumina na urina é geralmente realizada por um ensaio imunoenzimático de albumina (ELISA) a partir de 24 h de coleta de urina. Se a urina de uma coleta de urina de 24 h ou urina local for usada, pequenas diferenças nas concentrações de albumina podem ser perdidas devido a problemas de sensibilidade do ensaio. A maioria dos pesquisadores, portanto, usam modelos animais em que a albuminúria é induzida por lesão renal robusta devido a toxinas, drogas e Cirurgia renal.
Portanto, o achado de um método sensível para detectar alterações pequenas e transitórias na permeabilidade glomerular é muito importante para o campo. Rippe et al. apresentaram um modelo de rato para testar a permeabilidade glomerular aplicando um traçador fluorescentamente rotulado, a saber FITC-polysacarose 70 (ou seja, FITC-Ficoll 70), no tamanho da albumina4. A aplicação do traçador permite o teste de mudanças a curto prazo na permeabilidade glomerular (dentro dos minutos) e é muito sensível4. Dois estudos utilizaram o método Tracer em camundongos5,6. Apesar de seus benefícios, este método, infelizmente, tem desvantagens: é tecnicamente muito complexo, radioativo e invasivo. Uma análise mais adicional da urina é conseguida somente usando a filtração do gel ou a HPLC5,6da tamanho-exclusão.
Neste trabalho, apresentamos um método alternativo, sensível, não radioativo e rápido para medir a permeabilidade glomerular em camundongos utilizando FITC-polysacarose 70 fluorescentamente rotulado. Introduzindo um cateter transuretral, a coleção da urina é menos invasora do que a punctura da bexiga, o Urethrotomy, e a aplicação suprapúbica do cateter, e permite a coleção da urina pelo menos cada 30 minutos. a análise de urina é realizada a partir de pequenas quantidades (5μl) leitor de placas fluorescentes. As concentrações de traçador na urina são normalizadas para concentrações de creatinina na urina usando um ensaio de creatinina enzimática.
Conseqüentemente, este método novo oferece uma ferramenta sensível para estudar ferimento glomerular adiantado com permeabilidade glomerular aumentada.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for neck cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;"></td>
			<td style="width:77px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">BD Insyte Autoguard</td>
			<td style="width:77px;">BD</td>
			<td style="width:101px;">381823</td>
			<td>&#160;urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Multimode Detector DTX 880</td>
			<td style="width:77px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:257px;">384 well microtiterplate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">262260</td>
			<td style="width:235px;">384 well platte</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Creatinine Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">MAK080</td>
			<td>to measure creatinine concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">96 well plate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">260836</td>
			<td>for creatinine assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">FITC-labeled polysuccrose 70</td>
			<td style="width:77px;">TBD Consultancy</td>
			<td style="width:101px;">FP70</td>
			<td>FITC-ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Angiotensin II</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9525</td>
			<td>used to test glomerular permeability</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP-98A</td>
			<td style="width:77px;">Softron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for blood pressure measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">OTS 40.3040</td>
			<td style="width:77px;">Medite</td>
			<td style="width:101px;">01-4005-00</td>
			<td>heating plate for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Instillagel 6mL</td>
			<td style="width:77px;">Farco-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Exacta</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">GT415</td>
			<td>shaver</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70

A perda de albumina na urina (albuminúria) preafirma o desfecho cardiovascular. Em condições fisiológicas, pequenas quantidades de albumina são filtradas pelo glomérulo e reabsorvidas no sistema tubular até o limite de absorção ser atingido. Os aumentos adiantados na filtração patológica da albumina podem, assim, ser faltado analisando o Albuminuria. Portanto, o uso de traçadores para testar a permseletividade glomerular parece vantajoso. O isotiocianato do Tracer fluorescently etiquetado do fluoresceína (FITC)-polysacarose (isto é, FITC-Ficoll), pode ser usado para estudar o permselectivity glomerular. As moléculas FITC-polisacarose são livremente filtradas pelo glomérulo, mas não reabsorvidas no sistema tubular. Em camundongos e ratos, FITC-polysacarose tem sido investigado em modelos de permeabilidade glomerular usando procedimentos tecnicamente complexos (i.e., medições radioativas, cromatografia líquida de alta eficiência [HPLC], filtração de gel). Nós modificamos e facilitamos um protocolo Tracer-baseado do FITC-polysacarose para testar aumentos adiantados e pequenos na permeabilidade glomerular a FITC-polysacarose 70 (tamanho da albumina) nos ratos. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina (5 μL). Este protocolo contém informações sobre como o Tracer FITC-polysacarose 70 é aplicado por via intravenosa e a urina é coletada através de um cateter urinário simples. A urina é analisada através de um leitor de placas de fluorescência e normalizada para um marcador de concentração de urina (creatinina), evitando assim procedimentos tecnicamente complexos.

Conforme representado na Figura 2, o método para testar a permeabilidade glomerular em camundongos é construído em três fases. A primeira fase é denominada fase de preparação, na qual se colocam um cateter urinário e um cateter venoso central. A segunda fase é chamada de fase de equilíbrio, iniciando com uma injeção intravenosa de bóculo de FITC-polysacarose 70 e seguida pela infusão contínua de FITC-polysacarose 70 por 60 min. A última fase ?...

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Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Aqui, nós apresentamos um protocolo para testar a permeabilidade glomerular nos ratos usando um Tracer altamente sensível, nonradioativo. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina.

Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da nefrologia sobre o papel da permeabilidade glomerular na doença renal. A principal vantagem desta técnica é que pequenos e transitórios aumentos de permeabilidade glomerular são detectados usando um rastreador fluorescente rotulado de chumbo. Após anestesia, coloque um cateter urinário no rato fêmea.Posicione o rato em recumbência dorsal. Aperte o abdômen inferior e encontre o ostium uretral. Obtenha a parte plástica do cateter de um angiocatheter de 22 G e lubrifique-a com gel de xilocaine.Use o dedo indicador esquerdo para colocar uma tensão cuidadosa no abdômen inferior e introduzir o cateter três milímetros no ostium uretral, paralelamente ao eixo uretratal distal. Gire a parte superior do angiocateter 180 graus mantendo a ponta dentro do ostium uretral e mantendo o eixo da uretra. Em seguida, introduza o cateter sete milímetros mais adiante no mouse para que ele seja colocado dentro da bexiga.Coloque um tubo marrom de 1,5 mililitro sobre a parte superior do angiocateter para coletar a urina. Aplique um mililitro de cloreto de sódio de 0,9% subcutâneamente para melhorar a produção de urina. Raspe o pescoço do rato e coloque-o em recumbência com a cabeça em direção ao cirurgião.Hiper estenda a cabeça do mouse com uma fita. Desinfete o pescoço com 70% de isopropanol. Usando uma pinça e um par de tesouras faça uma incisão de pele de cinco milímetros abaixo da mandíbula.Corte a pele aproximadamente um centímetro na direção do esterno até que o meio do esterno seja atingido. Use uma tesoura. Dissecar cuidadosamente a pele para o lado direito do pescoço.Faça uma incisão retangular da pele à direita para expor o tecido mole do pescoço. Tenha cuidado para não danificar a veia jugular. Use um par de tesouras e uma pinça para fixar os retalhos da pele com dois grampos.Utilizando a ponta da pinça fina, exponha cuidadosamente a veia jugular por preparação contundente. Se necessário, remova o tecido com uma tesoura fina. Evite ferimentos nos galhos da veia.Coloque e feche uma ligadura com um fio de seda na parte distal da veia jugular visível que está em direção à cabeça do rato. Fixar o fio de seda com uma fita para colocar tensão na ligadura. Isso garante uma leve tensão na veia jugular.Prepare uma ligadura em torno da parte proximal da veia jugular. Depois disso, encha o cateter com a solução de equilíbrio e fusão. Conserte o cateter com uma fita para que o cateter esteja alinhando a veia jugular.Controle de bolhas para evitar embolia de ar. Levante a veia jugular com pinças finas no local da inserção. Alinhe o tubo paralelo à veia jugular e perfure a veia jugular visando o lúmen.Insira por aproximadamente dois a quatro milímetros paralelamente ao eixo da veia jugular. Evite movimentos rápidos. Feche a ligadura para consertar o cateter.Controle para o aperto da ligadura visualizando cuidadosamente através do microscópio. Coloque um cotonete úmido sobre o local da cirurgia. Coloque a braçadeira na parte inferior da cauda do rato enquanto o mouse fica em recumedência dorsal.Inicie as medições e repita-as dez vezes por ponto de tempo. Se as medidas da pressão arterial não parecerem corretas e forem produzidos dados falsos, ajuste a posição do manguito da cauda. Antes da fase de equilíbrio, troque o tubo de coleta urinária e coloque-o no gelo.Dobre um cotonete e coloque-o ao redor do pequeno cateter do vaso que é introduzido na veia jugular. Coloque um grampo sobre o cotonete para abolir o fluxo sanguíneo retrógrado ou embolia do ar. Conecte uma agulha de 27 G com uma seringa de um mililitro preenchida com o bolus FITC até a extremidade do cateter do pequeno vaso.Abra o grampo e aplique o bolus FITC de 100 microliter. Feche novamente o grampo e conecte o cateter maior com o cateter menor. Reabra o grampo e inicie a bomba de seringa com uma vazão de 0,008 mililitros por minuto.Continue a infusão por 60 minutos. Nesta fase, são investigadas as drogas eficazes na seletividade glomerular perm. Mude o tubo urinário ponto de tempo zero minuto para outro tubo marrom de 1,5 mililitro.Coloque um cotonete ao redor do cateter do pequeno vaso e desconecte o cateter grande do cateter do pequeno vaso. Encha a seringa com a solução de fase experimental. Coloque-a na bomba de seringa e deixe a bomba de infusão funcionar para que o cateter grande seja preenchido com a solução de fase experimental.Reconecte os cateteres enquanto evita a embolia do ar e reabra o grampo. Inicie a bomba de seringa à taxa de fluxo de 0,008 mililitro por minuto. Continue executando a bomba de seringa por 60 minutos e colete a urina dentro do tubo urinário depois disso.Coloque o tubo de urina no gelo. Neste estudo, a fluorescência da urina de camundongos nativos mostra um pico de 395 nanômetros. FITC polisucrose 70 a uma concentração de 40 microgramas por mililitro na urina do rato exibe um máximo de fluorescência em 525 nanômetros.A urina do rato não perturba a medição da fluorescência da polisucrose FITC 70. Na admissão de 525 nanômetros, o aumento das concentrações de polisucrose FITC 70 mostra um aumento da intensidade da fluorescência. Este método também é capaz de detectar diferenças na permeabilidade glomerular.As colunas brancas representam polisucrose FITC 70 níveis antes do início da estimulação da angiotensina II na fase experimental. Após dosagens por 60 minutos, a permeabilidade glomerular aumentou em comparação com o grupo controle. angiotensina II lavar-se diminuiu a permeabilidade glomerular.Os níveis de polisucrose FITC diminuíram após 60 minutos adicionais de estimulação de angiotensina II ou 60 minutos de lavagem de angiotensina II. O aumento da permeabilidade glomerular devido à angiotensina II pode ser bloqueado por um bloqueador receptor de angiotensina II. A pressão arterial monitorada pelo método do manguito da cauda não apresentou diferenças significativas entre os grupos tratados de controle e angiotensina II.Ao tentar este procedimento é importante evitar a embolia do ar ao mudar as soluções de infusão.

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Identificação e isolamento de células em divisão lento no glioblastoma humano usando Carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Medicina

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

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Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualização dos Vascular e parênquima regeneração após 70% hepatectomia parcial em ratos normais

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Longo prazo medição de pressão arterial em ratos movimentando-se livremente utilizar telemetria

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized transplante de fígado parcial de rato com na vivo orientado a embarcação 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

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