Name: highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Los autores agradecen a Christina Schwandt, Blanka Duvnjak y Nicola Kuhr por su excepcional asistencia técnica y al Dr. Dennis Sohn por su ayuda con el escaneo de fluorescencia. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 a L.C.R. y L.S. El fundero no tuvo ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Las investigaciones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices descritas en la Guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio (Publicación No 85-23 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, revisada en 1996). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las aprobaciones institucionales pertinentes (el gobierno estatal Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] número de referencia 84-02.04.2012.A397).
1. Preparación de in...

<ol>
	<li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy.">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li><li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule.">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+(ANG+II)+infusion+in+rats.">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li><li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice.">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li><li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes.">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li><li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool.">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity:+effects+of+molecular+size,+shape,+charge,+and+deformability.">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li><li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall.">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+Effects+of+Tempol,+NOS-,+RhoA-+and+Rac-1-inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li><li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo,+dependent+upon+reactive+oxygen+species.">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reactive+oxygen+species+(ROS)-dependent+effects+of+IL-1beta,+TNF-alpha,+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+(GFB)+in+vivo.">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo.">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li><li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability:+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol.">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li><li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma.">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats.">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hyperglycemia+induces+rapid,+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats.">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats.">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li><li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier.">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+effects+of+Tempol,+NOS,+RhoA,+and+Rac-1+inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li><li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae.">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li><li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods.">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li></ol>

El método presentado permite al investigador probar la permeabilidad glomerular en ratones de una manera muy sensible utilizando un trazador. Con este método, los aumentos a corto plazo en la permeabilidad glomerular se pueden diagnosticar utilizando sólo pequeñas cantidades de orina. Los pasos más críticos para dominar con éxito esta técnica son 1) el desarrollo de la experiencia manual en cirugía de ratón, especialmente en la cannulación de una vena central, 2) la colocación del catéter urinario sin dañar...

Los defectos funcionales o estructurales dentro de la barrera de filtración glomerular aumentan la permeabilidad glomerular a la albúmina, lo que resulta en la detección de albúmina en la orina (albuminuria). La albúmina predice el resultado cardiovascular y es un marcador importante para la lesión glomerular1. Incluso los niveles bajos de albúmina, que se encuentran dentro del rango normal, se asocian con un aumento del riesgo cardiovascular1.
En condiciones fisiológicas, la albúmina se filtra a travésdel glomérulo y se reabsorbe casi por completo en el sistema tubular 2,3. En ratones, la detección de albúmina en la orina suele realizarse mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de albúmina (ELISA) a partir de las 24 horas de recolección de orina. Si se utiliza orina de una colección de orina de 24 horas o orina manchada, se pueden perder pequeñas diferencias en las concentraciones de albúmina debido a problemas de sensibilidad al ensayo. La mayoría de los investigadores, por lo tanto, utilizan modelos animales en los que la albuminuria es inducida por una lesión renal robusta debido a toxinas, medicamentos y cirugía renal.
Por lo tanto, la búsqueda de un método sensible para detectar pequeños y transitorios cambios en la permeabilidad glomerular es muy importante para el campo. Rippe et al. han presentado un modelo de rata para probar la permeabilidad glomerular mediante la aplicación de un trazador con etiqueta fluorescente, a saber, FITC-polisucrose 70 (es decir, FITC-Ficoll 70), en el tamaño de la albúmina4. La aplicación de trazador permite la prueba de cambios a corto plazo en la permeabilidad glomerular (en cuestión de minutos) y es muy sensible4. Dos estudios han utilizado elmétodo trazador en ratones 5,6. A pesar de sus beneficios, este método, por desgracia, tiene desventajas: es técnicamente muy complejo, radiactivo e invasivo. El análisis posterior de la orina sólo se realiza mediante el uso de filtración de gel o tamaño-exclusión HPLC5,6.
Dentro de este artículo, presentamos un método alternativo, sensible, no radioactivo y rápido para medir la permeabilidad glomerular en ratones utilizando fluorescentemente etiquetado FITC-policrorosa 70. Mediante la introducción de un catéter transuretral, la recolección de orina es menos invasiva que la punción vesical, la uretrotomía y la aplicación de catéter suprapúbico, y permite la recolección de orina al menos cada 30 minutos. El análisis de orina se realiza a partir de pequeñas cantidades (5 ol) utilizando un lector de placas fluorescentes. Las concentraciones de trazador en la orina se normalizan a las concentraciones de creatinina en la orina mediante un ensayo de creatinina enzimática.
Por lo tanto, este novedoso método ofrece una herramienta sensible para estudiar lesiones glomerulares tempranas con mayor permeabilidad glomerular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for neck cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;"></td>
			<td style="width:77px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">BD Insyte Autoguard</td>
			<td style="width:77px;">BD</td>
			<td style="width:101px;">381823</td>
			<td>&#160;urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Multimode Detector DTX 880</td>
			<td style="width:77px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:257px;">384 well microtiterplate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">262260</td>
			<td style="width:235px;">384 well platte</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Creatinine Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">MAK080</td>
			<td>to measure creatinine concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">96 well plate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">260836</td>
			<td>for creatinine assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">FITC-labeled polysuccrose 70</td>
			<td style="width:77px;">TBD Consultancy</td>
			<td style="width:101px;">FP70</td>
			<td>FITC-ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Angiotensin II</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9525</td>
			<td>used to test glomerular permeability</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP-98A</td>
			<td style="width:77px;">Softron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for blood pressure measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">OTS 40.3040</td>
			<td style="width:77px;">Medite</td>
			<td style="width:101px;">01-4005-00</td>
			<td>heating plate for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Instillagel 6mL</td>
			<td style="width:77px;">Farco-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Exacta</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">GT415</td>
			<td>shaver</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70

La pérdida de albúmina en la orina (albuminuria) predice el resultado cardiovascular. En condiciones fisiológicas, pequeñas cantidades de albúmina son filtradas por el glomérulo y reabsorbidas en el sistema tubular hasta que se alcanza el límite de absorción. Los primeros aumentos en la filtración patológica de albúmina pueden, por lo tanto, perderse mediante el análisis de la albúmina. Por lo tanto, el uso de trazadores para probar la permselectividad glomerular parece ventajoso. El trazador fluorescentemente etiquetado isotiocianato de fluoresceína (FITC)-polisucrosa (es decir, FITC-Ficoll), se puede utilizar para estudiar la permselectividad glomerular. Las moléculas FITC-polisucrosa son filtradas libremente por el glomérulo pero no reabsorbidas en el sistema tubular. En ratones y ratas, FITC-policrorosa se ha investigado en modelos de permeabilidad glomerular mediante el uso de procedimientos técnicamente complejos (es decir, mediciones radiactivas, cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC], filtración de gel). Hemos modificado y facilitado un protocolo basado en trazador de policrorosa FITC para probar aumentos tempranos y pequeños en la permeabilidad glomerular a FITC-policrorosa 70 (tamaño de la albúmina) en ratones. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina (5 l). Este protocolo contiene información sobre cómo se aplica por vía intravenosa el trazador FITC-policrorosa 70 y la orina se recoge a través de un simple catéter urinario. La orina se analiza a través de un lector de placas de fluorescencia y se normaliza a un marcador de concentración de orina (creatinina), evitando así procedimientos técnicamente complejos.

Como se muestra en la Figura2, el método para probar la permeabilidad glomerular en ratones se construye en tres fases. La primera fase se denomina fase de preparación, en la que se colocan un catéter urinario y un catéter venoso central. La segunda fase se denomina fase de equilibrio, comenzando con una inyección intravenosa en bolo de FITC-policrorosa 70 y seguida de la perfusión continua de FITC-policrorosa 70 durante 60 min. La última fase se denom...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Aquí, presentamos un protocolo para probar la permeabilidad glomerular en ratones usando un trazador no radioactivo altamente sensible. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina.

Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nefrología sobre el papel de la permeabilidad glomerular en la enfermedad renal. La principal ventaja de esta técnica es que se detectan pequeños y transitorios aumentos de la permeabilidad glomerular mediante el uso de un trazador con plomo fluorescente etiquetado. Después de la anestesia, coloque un catéter urinario en el ratón femenino.Coloque el ratón en la reclinación dorsal. Apriete la parte inferior del abdomen y encuentre el ostium uretral. Obtener la parte de plástico del catéter de un angiocatéter de 22 G y lubricarlo con gel de xylocaína.Utilice el dedo índice izquierdo para colocar una tensión cuidadosa en la parte inferior del abdomen e introducir el catéter tres milímetros en el ostium uretral mientras se parale hacia el eje uretral distal. Gire la parte superior del angiocatéter 180 grados manteniendo la punta dentro del ostium uretral y manteniendo el eje de la uretra. Luego, introduzca el catéter siete milímetros más en el ratón para que se coloque dentro de la vejiga.Coloque un tubo marrón de 1,5 mililitros sobre la parte superior del angiocatéter para recoger la orina. Aplicar un mililitro de 0,9% de cloruro de sodio por vía subcutánea para mejorar la producción de orina. Afeite el cuello del ratón y colóquelo en recumbencia con la cabeza hacia el cirujano.Hyper extiende la cabeza del ratón con una cinta. Desinfectar el cuello con 70%isopropanol. Usando una pinza y un par de tijeras hacer una incisión de piel de cinco milímetros debajo de la mandíbula.Corte la piel aproximadamente un centímetro en la dirección del esternón hasta que se alcance el centro del esternón. Usa unas tijeras. Diseccione cuidadosamente la piel al lado derecho del cuello.Haga una incisión rectangular de la piel a la derecha para exponer el tejido blando del cuello. Tenga cuidado de no dañar la vena yugular. Usa un par de tijeras y una pinza para fijar las solapas de la piel con dos abrazaderas.Usando la punta de la pinza fina, exponga cuidadosamente la vena yugular mediante una preparación contundente. Si es necesario, retire el tejido con tijeras finas. Evite lesiones en las ramas de las venas.Colocar y cerrar una ligadura con un hilo de seda en la parte distal de la vena yugular visible que está hacia la cabeza del ratón. Fije el hilo de seda con una cinta para poner tensión en la ligadura. Esto asegura una ligera tensión en la vena yugular.Preparar una ligadura alrededor de la parte proximal de la vena yugular. Después de eso, llene el catéter con la solución de equilibrio y fusión. Fije el catéter con una cinta adhesiva para que el catéter alinee la vena yugular.Control de burbujas para evitar la embolia aérea. Levante la vena yugular con pinzas finas en el lugar de inserción. Alinee el tubo paralelo a la vena yugular y perfore la vena yugular apuntando al lumen.Insertar para aproximadamente dos a cuatro milímetros en paralelo al eje de la vena yugular. Evite cualquier movimiento rápido. Cierre la ligadura para fijar el catéter.Control de la estanqueidad de la ligadura mediante una visión cuidadosa a través del microscopio. Ponga un hisopo húmedo sobre el lugar de la cirugía. Coloque el manguito de la cola en la parte inferior de la cola del ratón mientras el ratón se encuentra en la reclinación dorsal.Inicie las mediciones y repítelas diez veces por punto de tiempo. Si las mediciones de la presión arterial no parecen correctas y se producen datos falsos, ajuste la posición del manguito de cola. Antes de la fase de equilibrio, cambie el tubo de recolección urinaria y colóquelo sobre hielo.Doble un hisopo y colóquelo alrededor del catéter del recipiente pequeño que se introduce en la vena yugular. Coloque una abrazadera sobre el hisopo para abolir el flujo sanguíneo retrógrado o la embolia aérea. Conecte una aguja de 27 G con una jeringa de un mililitro llena con el bolo FITC al final del catéter del vaso pequeño.Abra la abrazadera y aplique el bolo FITC de 100 microlitrotro. Cierre la abrazadera de nuevo y conecte el catéter más grande con el catéter más pequeño. Vuelva a abrir la abrazadera e inicie la bomba de la jeringa con un caudal de 0,008 mililitros por minuto.Continúe la perfusión durante 60 minutos. En esta fase, se investigan los fármacos eficaces sobre la selectividad de la perm glomerular. Cambie el tubo urinario del punto de tiempo cero minuto a otro tubo marrón de 1,5 mililitros.Coloque un hisopo alrededor del catéter del vaso pequeño y desconecte el catéter grande del catéter del vaso pequeño. Llene la jeringa con la solución de fase experimental. Colóquelo en la bomba de la jeringa y deje que la bomba de perfusión funcione para que el catéter grande se llene con la solución de fase experimental.Vuelva a conectar los catéteres evitando la embolia de aire y vuelva a abrir la abrazadera. Encienda la bomba de la jeringa a un caudal de 0,008 mililitros por minuto. Continúe ejecutando la bomba de jeringa durante 60 minutos y recoja la orina dentro del tubo urinario a partir de entonces.Coloque el tubo de orina sobre hielo. En este estudio, la exploración por fluorescencia de orina nativa de ratón muestra un pico de 395 nanómetros. La polisurosa FITC 70 a una concentración de 40 microgramos por mililitro en orina de ratón muestra un máximo de fluorescencia a 525 nanómetros.La orina del ratón no altera la medición de fluorescencia de la polisurosa FITC 70. A la admisión de 525 nanómetros el aumento de las concentraciones de polisuquida FITC 70 muestra un aumento de la intensidad de la fluorescencia. Este método también es capaz de detectar diferencias en la permeabilidad glomerular.Las columnas blancas representan la polisuquida FITC 70 niveles antes del inicio de la estimulación de la angiotensina II en la fase experimental. Después de dosis durante 60 minutos, la permeabilidad glomerular aumentó en comparación con el grupo de control. la angiotensina II lamina reduce la permeabilidad glomerular.Los niveles de polisuquida FITC 70 disminuyeron después de 60 minutos adicionales de estimulación de la angiotensina II o 60 minutos de lavado con angiotensina II. El aumento de la permeabilidad glomerular debido a la angiotensina II podría ser bloqueado por un bloqueador de receptores de angiotensina II. La presión arterial monitoreada por el método del manguito de cola no mostró diferencias significativas entre los grupos tratados con control y angiotensina II.Al intentar este procedimiento es importante evitar la embolia de aire al cambiar las soluciones de perfusión.

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

La identificación y aislamiento de Slow división de las células de glioblastoma humano utilizando carboxi fluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Investigación

Medicina

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Cuantificación de la permeabilidad glomerular de macromoléculas fluorescentes mediante microscopía 2-Photon en Munich Ratas Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Un<em&gt; In vivo</em&gt; Ensayo de prueba de permeabilidad Vasos Sanguíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Infusiones de la arteria carótida para farmacocinéticas y farmacodinámicas Análisis de taxanos en ratones

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Medición automática de enfisema pulmonar y la pequeña vía aérea Remodelación de cigarrillos sin humo Ratones expuestos

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Modelos quirúrgicos de reflujo gastroesofágico con ratones

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

La visualización del parénquima vascular y la regeneración después del 70% hepatectomía parcial en ratones normales

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

A largo plazo de medida de la presión arterial en ratones con libertad de movimientos mediante telemetría

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Volver a arterializada rata parcial trasplante del hígado con una en vivo orientada al barco 70% hepatectomía

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Evaluación de la función renal en modelos de ratón de la enfermedad Glomerular

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...