Name: highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70
Uploaded: 2019-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Författarna tackar Christina Schwandt, blanka Duvnjak och Nicola Kuhr för deras exceptionella tekniska stöd och Dr Dennis Sohn för hans hjälp med fluorescens Scan. Denna forskning stöddes av ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 till L.C.R. och L.S. Finansiär hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet.

Utredningarna genomfördes enligt de riktlinjer som beskrivs i handledningen för vård och användning av försöksdjur (US National Institutes of Health publikation nr 85-23, reviderad 1996). Alla djurförsök utfördes i enlighet med relevanta institutionella godkännanden (delstatsregeringen Landesamt für natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] referensnummer 84-02.04.2012. A397).
1. beredning av instrument, lösningar och utrustning
<ol><li>Rekonstituera FITC-polysackaros 70 med 0,...

<ol>
	<li>Chronic Kidney Disease Prognosis Consortium, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+estimated+glomerular+filtration+rate+and+albuminuria+with+all-cause+and+cardiovascular+mortality+in+general+population+cohorts:+a+collaborative+meta-analysis.">Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis.</a> Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).</li><li>Mori, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+of+Total+Nephron+Albumin+Filtration+and+Reabsorption+in+Diabetic+Nephropathy.">Increase of Total Nephron Albumin Filtration and Reabsorption in Diabetic Nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 278-289 (2017).</li><li>Amsellem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cubilin+is+essential+for+albumin+reabsorption+in+the+renal+proximal+tubule.">Cubilin is essential for albumin reabsorption in the renal proximal tubule.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (11), 1859-1867 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+dynamic+changes+in+glomerular+permeability+to+macromolecules+during+systemic+angiotensin+II+(ANG+II)+infusion+in+rats.">Rapid, dynamic changes in glomerular permeability to macromolecules during systemic angiotensin II (ANG II) infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 303 (6), F790-F799 (2012).</li><li>Grande, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unaltered+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+caveolin-1+knockout+mice.">Unaltered size selectivity of the glomerular filtration barrier in caveolin-1 knockout mice.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (2), F257-F262 (2009).</li><li>Jeansson, M., Haraldsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+size+and+charge+selectivity+in+the+mouse+after+exposure+to+glucosaminoglycan-degrading+enzymes.">Glomerular size and charge selectivity in the mouse after exposure to glucosaminoglycan-degrading enzymes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 14 (7), 1756-1765 (2003).</li><li>Reis, L. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+features+of+the+urethra+and+urinary+bladder+catheterization+in+female+mice+and+rats.+An+essential+translational+tool.">Anatomical features of the urethra and urinary bladder catheterization in female mice and rats. An essential translational tool.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 26, 106-110 (2011).</li><li>Konigshausen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+increases+glomerular+permeability+by+beta-arrestin+mediated+nephrin+endocytosis.">Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis.</a> Scientific Reports. 6, 39513 (2016).</li><li>Venturoli, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ficoll+and+dextran+vs.+globular+proteins+as+probes+for+testing+glomerular+permselectivity:+effects+of+molecular+size,+shape,+charge,+and+deformability.">Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity: effects of molecular size, shape, charge, and deformability.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 288 (4), F605-F613 (2005).</li><li>Bohrer, M. P., Deen, W. M., Robertson, C. R., Troy, J. L., Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+configuration+on+the+passage+of+macromolecules+across+the+glomerular+capillary+wall.">Influence of molecular configuration on the passage of macromolecules across the glomerular capillary wall.</a> The Journal of General Physiology. 74 (5), 583-593 (1979).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+Effects+of+Tempol,+NOS-,+RhoA-+and+Rac-1-inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: Effects of Tempol, NOS-, RhoA- and Rac-1-inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. , (2018).</li><li>Dolinina, J., Sverrisson, K., Rippe, A., Oberg, C. M., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+inhibition+causes+acute+increases+in+glomerular+permeability+in+vivo,+dependent+upon+reactive+oxygen+species.">Nitric oxide synthase inhibition causes acute increases in glomerular permeability in vivo, dependent upon reactive oxygen species.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), F984-F990 (2016).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+reactive+oxygen+species+(ROS)-dependent+effects+of+IL-1beta,+TNF-alpha,+and+IL-6+on+the+glomerular+filtration+barrier+(GFB)+in+vivo.">Acute reactive oxygen species (ROS)-dependent effects of IL-1beta, TNF-alpha, and IL-6 on the glomerular filtration barrier (GFB) in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 309 (9), F800-F806 (2015).</li><li>Sverrisson, K., Axelsson, J., Rippe, A., Asgeirsson, D., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+size-selective+effects+of+protamine+sulfate+and+hyaluronidase+on+the+rat+glomerular+filtration+barrier+in+vivo.">Dynamic, size-selective effects of protamine sulfate and hyaluronidase on the rat glomerular filtration barrier in vivo.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 307 (10), F1136-F1143 (2014).</li><li>Sverrisson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+fetal+hemoglobin+induces+increases+in+glomerular+permeability:+inhibition+with+alpha1-microglobulin+and+tempol.">Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha1-microglobulin and tempol.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 306 (4), F442-F448 (2014).</li><li>Axelsson, J., Mahmutovic, I., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats+following+laparotomy+and+muscle+trauma.">Loss of size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats following laparotomy and muscle trauma.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 297 (3), F577-F582 (2009).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+sustained+increases+in+glomerular+permeability+following+ANP+infusion+in+rats.">Transient and sustained increases in glomerular permeability following ANP infusion in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 300 (1), F24-F30 (2011).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+hyperglycemia+induces+rapid,+reversible+increases+in+glomerular+permeability+in+nondiabetic+rats.">Acute hyperglycemia induces rapid, reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 298 (6), F1306-F1312 (2010).</li><li>Axelsson, J., Rippe, A., Venturoli, D., Sward, P., Rippe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+early+endotoxemia+and+dextran-induced+anaphylaxis+on+the+size+selectivity+of+the+glomerular+filtration+barrier+in+rats.">Effects of early endotoxemia and dextran-induced anaphylaxis on the size selectivity of the glomerular filtration barrier in rats.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 296 (2), F242-F248 (2009).</li><li>Andersson, M., Nilsson, U., Hjalmarsson, C., Haraldsson, B., Nystrom, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+renal+ischemia-reperfusion+reduces+charge+and+size+selectivity+of+the+glomerular+barrier.">Mild renal ischemia-reperfusion reduces charge and size selectivity of the glomerular barrier.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (6), F1802-F1809 (2007).</li><li>Dolinina, J., Rippe, A., Bentzer, P., Oberg, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperpermeability+after+acute+unilateral+ureteral+obstruction:+effects+of+Tempol,+NOS,+RhoA,+and+Rac-1+inhibition.">Glomerular hyperpermeability after acute unilateral ureteral obstruction: effects of Tempol, NOS, RhoA, and Rac-1 inhibition.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (3), F445-F453 (2018).</li><li>Rosengren, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvascular+protein+transport+in+mice+lacking+endothelial+caveolae.">Transvascular protein transport in mice lacking endothelial caveolae.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 291 (3), H1371-H1377 (2006).</li><li>Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+simultaneous+measurement+of+mouse+systolic+arterial+blood+pressure+by+radiotelemetry+and+tail-cuff+methods.">Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), H2408-H2415 (2004).</li><li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li></ol>

Den presenterade metoden gör det möjligt för prövaren att testa glomerulär permeabilitet hos möss på ett mycket känsligt sätt med hjälp av en Tracer. Med denna metod, kortsiktiga ökningar i glomerulär permeabilitet kan diagnostiseras med endast små mängder av urin. De mest kritiska stegen för att framgångsrikt bemästra denna teknik är 1) utveckla manuell expertis i mus kirurgi, särskilt i kanyleringen av en central ven, 2) Placera urin katetern utan att skada slemhinnan, och 3) manuell expertis vid han...

Funktionella eller strukturella defekter inom den glomerulära filtrerings barriären ökar glomerulär permeabilitet för albumin, vilket resulterar i detektion av albumin i urinen (albuminuri). Albuminuria förutspår kardiovaskulära resultat och är en viktig markör för glomerulär skada1. Även låga nivåer av albuminuri, liggande inom det normala intervallet, är förknippade med en ökad kardiovaskulär risk1.
Under fysiologiska förhållanden, albumin filtreras genom Glomerulus och är nästan helt återabsorberas i det rörformiga systemet2,3. Hos möss utförs detekteringen av albumin i urinen vanligen genom ett albuminenzymlänkat immunosorbent-test (ELISA) från 24 timmar urin uppsamling. Om urin från en 24 h urin insamling eller plats urin används, små skillnader i albuminkoncentrationer kan missas på grund av assay känslighet problem. De flesta forskare, därför, använda djurmodeller där albuminuri induceras av robust njurskada på grund av toxiner, droger, och njur kirurgi.
Därför är konstaterandet av en känslig metod för att upptäcka små och övergående förändringar i glomerulär permeabilitet mycket viktigt för området. Rippe et al. har presenterat en råtta-modell för att testa glomerulär permeabilitet genom att tillämpa en Fluorescent märkt Tracer, nämligen FITC-polysackaros 70 (dvs FITC-Ficoll 70), i storlek med albumin4. Tracerapplikationen möjliggör testning av kortsiktiga förändringar i glomerulär permeabilitet (inom några minuter) och är mycket känslig4. Två studier har använt spår metoden i möss5,6. Trots dess fördelar, denna metod, tyvärr, har nackdelar: det är tekniskt mycket komplexa, radioaktiva, och invasiva. Ytterligare analys av urinen är endast åstadkommas med hjälp av gelfiltrering eller storlek-uteslutning HPLC5,6.
I detta dokument presenterar vi en alternativ, känslig, icke-radioaktiv och snabb metod för att mäta glomerulär permeabilitet hos möss med hjälp av fluorescerande märkt FITC-polysackaros 70. Genom att införa en transuretral kateter, urin insamling är mindre invasiv än urinblåsan punktering, urethrotomy, och suprapubisk kateter ansökan, och tillåter urin insamling minst var 30 min. urinanalys utförs från små mängder (5 μl) med hjälp av en fluorescerande Plattläsare. Spårningskoncentrationer i urinen normaliseras till kreatininkoncentrationer i urinen med hjälp av en enzymatisk kreatininhalt.
Därför, denna nya metod erbjuder ett känsligt verktyg för att studera tidig glomerulär skada med ökad glomerulär permeabilitet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:671px;" width="669">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Motic SMZ168 BL</td>
			<td style="width:77px;">Motic</td>
			<td style="width:101px;">SMZ168BL</td>
			<td style="width:235px;">microscope for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:257px;">KL1500LCD</td>
			<td style="width:77px;">Pulch and Lorenz microscopy</td>
			<td style="width:101px;">150500</td>
			<td>light for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Microfederschere</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">FD100R</td>
			<td>fine scissors</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Durotip Feine Scheren</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BC210R</td>
			<td>for neck cut</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Anatomische Pinzette</td>
			<td style="width:77px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BD215R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Pr&#228;parierklemme</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">BJ008R</td>
			<td>for surgery&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Seraflex</td>
			<td style="width:77px;">Serag Wiessner</td>
			<td style="width:101px;">IC108000</td>
			<td>silk thread</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Ketamine 10%</td>
			<td style="width:77px;">Medistar</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Rompun (Xylazin) 2%</td>
			<td style="width:77px;">Bayer</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/100</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Fine Bore Polythene Tubing ID 0.58mm OD 0.96mm</td>
			<td style="width:77px;">Portex</td>
			<td style="width:101px;">800/100/200</td>
			<td style="width:235px;">Catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Harvard apparatus 11 Plus</td>
			<td style="width:77px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:101px;">70-2209</td>
			<td>syringe pump</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;"></td>
			<td style="width:77px;"></td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">BD Insyte Autoguard</td>
			<td style="width:77px;">BD</td>
			<td style="width:101px;">381823</td>
			<td>&#160;urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Multimode Detector DTX 880</td>
			<td style="width:77px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:257px;">384 well microtiterplate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">262260</td>
			<td style="width:235px;">384 well platte</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Creatinine Assay Kit</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">MAK080</td>
			<td>to measure creatinine concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">96 well plate</td>
			<td style="width:77px;">Nunc</td>
			<td style="width:101px;">260836</td>
			<td>for creatinine assay&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">FITC-labeled polysuccrose 70</td>
			<td style="width:77px;">TBD Consultancy</td>
			<td style="width:101px;">FP70</td>
			<td>FITC-ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:257px;">Angiotensin II</td>
			<td style="width:77px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">A9525</td>
			<td>used to test glomerular permeability</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BP-98A</td>
			<td style="width:77px;">Softron</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for blood pressure measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">OTS 40.3040</td>
			<td style="width:77px;">Medite</td>
			<td style="width:101px;">01-4005-00</td>
			<td>heating plate for mouse surgery</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:257px;">Instillagel 6mL</td>
			<td style="width:77px;">Farco-Pharma GmbH</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>for urinary catheter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:257px;">Exacta</td>
			<td style="width:77px;">Aesculap</td>
			<td style="width:101px;">GT415</td>
			<td>shaver</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly sensitive measurement of glomerular permeability in mice with fluorescein isothiocyanate-polysucrose 70

Förlusten av albumin i urinen (albuminuri) förutspår kardiovaskulära resultat. Under fysiologiska förhållanden, små mängder av albumin filtreras av Glomerulus och återabsorberas i det tubulära systemet upp tills Absorptionsgränsen uppnås. Tidiga ökningar i patologisk albumin filtrering kan därför missas genom att analysera albuminuri. Därför förefaller det fördelaktigt att använda spårämnen för att testa glomerulär permselektivitet. Fluorescent märkt Tracer fluorescein isotiocyanat (FITC)-polysackaros (dvs FITC-Ficoll), kan användas för att studera glomerulär permselektivitet. FITC-polysackaromolekyler filtreras fritt av Glomerulus men inte återabsorberas i det rörformiga systemet. Hos möss och råttor har FITC-polysackaros undersökts i modeller av glomerulär permeabilitet genom att använda tekniskt komplexa procedurer (dvs. radioaktiva mätningar, vätskekromatografi med hög prestanda [HPLC], gelfiltrering). Vi har modifierat och underlättat en FITC-polysackarospårningsbaserade protokoll för att testa tidiga och små ökningar i glomerulär permeabilitet för FITC-polysackaros 70 (storlek av albumin) hos möss. Denna metod möjliggör repetitiva urin analyser med små urin volymer (5 μL). Detta protokoll innehåller information om hur tracerfitc-polysackaros 70 appliceras intravenöst och urin samlas in via en enkel urinkateter. Urin analyseras via en fluorescens-Plattläsare och normaliseras till en urin koncentrations markör (kreatinin), vilket undviker tekniskt komplicerade procedurer.

Som avbildas i figur 2, är metoden för att testa glomerulär permeabilitet hos möss byggs upp i tre faser. Den första fasen kallas förberedelsefasen, där en urinkateter och en central venkateter placeras. Den andra fasen kallas jämvikts fas, börjar med en intravenös bolus injektion av FITC-polysackaros 70 och följt av kontinuerlig infusion av FITC-polysackaros 70 för 60 min. Den sista fasen kallas experimentfasen. I denna fas, infusion av FITC-poly...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70 at JoVE.com

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

Här presenterar vi ett protokoll för att testa glomerulär permeabilitet hos möss med en mycket känslig, icke-radioaktivt spårämne. Denna metod möjliggör repetitiva urin analyser med små urin volymer.

Mycket känslig mätning av glomerulär permeabilitet hos möss med fluorescein isotiocyanat-polysackaros 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom nefrologi området om rollen av glomerular permeabilitet i njursjukdom. Den största fördelen med denna teknik är att små och övergående ökningar av glomerular permeabilitet detekteras genom att använda en fluorescerande bly märkt spårämne. Efter anestesi, placera en urinkateter i honan musen.Placera musen i ryggrecumbency. Dra åt nedre delen av buken och hitta urinrörets ostium. Erhåll plastdelen av katetern på en 22 G-angiokateter och smörj den med xylokaingel.Använd vänster pekfinger för att placera noggrann spänning på nedre delen av buken och introducera katetern tre millimeter i urethral ostium medan paralleller den distala urinröret axeln. Vrid toppen av angiocatheter 180 grader genom att hålla spetsen inom urinrörets ostium och bibehålla axeln av urinröret. Sedan introducerar katetern sju millimeter längre in i musen så att den placeras inom urinblåsan.Placera en 1,5 milliliter brun tub över toppen av angiocatheter att samla urinen. Applicera en milliliter på 0,9%natriumklorid subkutant för att förstärka urinproduktionen. Raka halsen av musen och placera den i recumbency med huvudet mot kirurgen.Hyper förlänga huvudet på musen med ett band. Desinficera nacken med 70%isopropanol. Med hjälp av en pincett och en sax gör en fem millimeter hud snitt under käklinjen.Skär huden ungefär en centimeter i riktning mot bröstbenet tills mitten av bröstbenet nås. Använd en sax. Dissekera försiktigt huden till höger sida av halsen.Gör en rektangulär snitt av huden till höger för att exponera mjukvävnaden i nacken. Var försiktig så att inte halsvenen skadas. Använd en sax och en pincett för att fixera hudflikarna med två klämmor.Använd spetsen på den fina pincett, försiktigt exponera halsvenen genom trubbigt preparat. Om det behövs, ta bort vävnad med fin sax. Undvik skador på vengrenar.Placera och stänga en ligatur med en silke tråd vid den distala delen av den synliga halsvenen som är mot huvudet på musen. Fixera silkestråden med ett band för att sätta spänning på ligaturen. Detta säkerställer liten spänning på halsvenen.Förbered en ligatur runt den proximala delen av halsvenen. Efter det fyller katetern med jämvikts- och fusionslösningen. Fixera katetern med en tejp så att katetern riktar in halsvenen.Kontroll för bubblor för att undvika luftemboli. Lyft halsvenen med fin pincett vid införingsplatsen. Rikta in slangen parallellt med halsvenen och punktera halsvenen som siktar mot lumen.Sätt in för ungefär två till fyra millimeter paralleller axeln av halsvenen. Undvik eventuella raskrörelser. Stäng ligaturen för att fixera katetern.Kontroll för täthet av ligaturen genom att noggrant betrakta genom mikroskopet. Sätt en fuktig svabb över platsen för kirurgi. Placera svansmanschetten längst ner på mussvansen medan musen lägger sig i ryggrecumbency.Starta mätningarna och upprepa dem tio gånger per tidspunkt. Om blodtrycksmätningar inte verkar korrekta och falska data tas fram, justera positionen för svansmanschetten. Innan jämviktsfasen, ändra urinuppsamlingsröret och placera det på is.Vik en svabb och lägg den runt den lilla kärlet kateter som införs i halsvenen. Placera en klämma över svabben för att avskaffa bakåtsträvande blodflödet eller luftemboli. Anslut en 27 G-nål med en milliliter spruta fylld med FITC-bolus till slutet av den lilla kärlet katetern.Öppna klämman och applicera 100 microliter FITC bolus. Stäng klämman igen och anslut den större katetern med den mindre katetern. Öppna klämman igen och starta sprutpumpen med ett flöde på 0,008 milliliter per minut.Fortsätt infusionen i 60 minuter. I denna fas undersöks de effektiva läkemedlen på glomerular permseligivity. Ändra urinröret form tid punkt noll minut till en annan 1,5 milliliter brun rör.Sätt en svabb runt den lilla kärlet katetern och koppla bort den stora katetern från den lilla kärlet katetern. Fyll sprutan med den experimentella faslösningen. Placera den i sprutpumpen och låt infusionspumpen köras så att den stora katetern fylls med försöksfaslösningen.Anslut katetrarna igen samtidigt som luftemboli undviks och klämman öppnas igen. Starta sprutpumpen med flödet av 0,008 milliliter per minut. Fortsätt köra sprutpumpen i 60 minuter och samla urinen inom urinröret därefter.Placera urinröret på is. I denna studie visar fluorescensskanning av inhemsk musurin en topp på 395 nanometer. FITC polysucrose 70 vid en koncentration av 40 mikrogram per milliliter i musurin visar en fluorescens maximal vid 525 nanometer.Musurin stör inte fluorescensmätningen av FITC polysucrose 70. Vid upptagande av 525 nanometer ökande koncentrationer av FITC polysucrose 70 visar en ökad fluorescens intensitet. Denna metod är också kapabel att upptäcka skillnader i glomerular permeabilitet.De vita kolonnerna representerar FITC polysucrose 70 nivåer före starten av angiotensin II stimulering i den experimentella fasen. Efter doseringar i 60 minuter ökade den glomerära permeabiliteten jämfört med kontrollgruppen. angiotensin II tvätta ur minskade glomerular permeabilitet.FITC polysucrose 70 nivåer minskade efter ytterligare 60 minuter av angiotensin II stimulering eller 60 minuter av angiotensin II washout. Ökningen av glomerular permeabilitet på grund av angiotensin II kunde blockeras av en angiotensin II receptor blockerare. Blodtryck som övervakades av metoden med svansmanschett visade inte på signifikanta skillnader mellan de behandlade grupperna av kontroll och angiotensin II.Samtidigt försöker detta förfarande är det viktigt att undvika luftemboli när du byter infusionslösningar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)

Identification and Isolation of Slow-Dividing Cells in Human Glioblastoma Using Carboxy Fluorescein Succinimidyl Ester CFSE

Identifiering och isolering av långsamt delande celler i humant glioblastom Använda karboxifluorescein succinimidylester (CFSE)

Tumor heterogeneity represents a fundamental feature supporting tumor robustness and presents a central obstacle to the development of therapeutic ...

Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Kvantifiering glomerulär permeabilitet av fluorescerande makromolekyler Använda 2-foton mikroskopi i München Wistarråttor

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

En<em&gt; In vivo</em&gt; Analys för att testa Permeabilitet blodkärl

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Halspulsådern Tinkturer för farmakokinetiska och farmakodynamiska Analys av taxaner i möss

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

Automatiserad Mätning av lungemfysem och Liten Airway Remodeling i cigarettrök exponerade möss

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Surgical Models of Gastroesophageal Reflux with Mice

Kirurgiska Modeller av gastroesofageal reflux med möss

Multiple surgical procedures have been reported to induce gastroesophageal reflux in animals. Herein, we report three surgical models with mice aiming to ...

Visualization of Vascular and Parenchymal Regeneration after 70% Partial Hepatectomy in Normal Mice

Visualisering av Vascular och parenkymal Regeneration efter 70% partiell hepatektomi hos normala möss

A modified silicone injection procedure was used for visualization of the hepatic vascular tree. This procedure consisted of in-vivo injection of the ...

Long-term Blood Pressure Measurement in Freely Moving Mice Using Telemetry

Långsiktig blodtrycksmätning i fritt rörliga Möss Använda Telemetry

During the development of new vasoactive agents, arterial blood pressure monitoring is crucial for evaluating the efficacy of the new proposed drugs. ...

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re-Arterialized Rat Partial Liver Transplantation with an in vivo Vessel-Oriented 70% Hepatectomy

Re Arterialized råtta delvis lever Transplantation med i vivo fartyget-orienterade 70% Hepatectomy

Split liver transplantation and living liver donor liver transplantation were developed in the clinic to utilize liver organs in a more efficient manner. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Bedömning av njurfunktion i musmodeller av glomerulär sjukdom

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...