Name: assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins
Uploaded: 2019-01-26T14:45:00
Duration: 8 min 4 s
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提交人感激地感谢 nsf 赠款 nsf-dmr 1807514 下的财政支持。作者感谢 g·巴昌德和 v. vandelinder 提供的 gfp-激素素蛋白。这项工作的部分工作是在综合纳米技术中心进行的, 该中心是洛斯阿拉莫斯国家实验室为美国能源部 (doe) 科学办公室运作的一个科学用户办公室 (合同号)。de-ac52-06na25396) 和桑迪亚国家实验室 (de-ac04-ac04-94al85000)。作者感谢詹妮弗·内夫博士和全维血管组织提供的与 nta 功能化的 peg-ppg-peg 天赋。

1. 解决方案准备
注意: 本协议中使用的三种试剂 (甲苯、二甲基二氯硅烷和二硫代三醇) 毒性很强。使用前, 请参考相关材料安全数据表 (msds)。此外, 该协议的部分内容需要在更高水平的保护下进行, 如图所示, 戴着安全眼镜和两套防护手套。除非另有建议, 实验可以在实验室的长椅上进行, 同时使用所有适当的个人防护设备 (安全眼镜、手套、实验室外套、全长裤子和闭脚鞋)。
注: 本协议中使用的 atp、动蛋白和微管的浓度可以根据每个实验的需要进行修改。但是, 如果进行了改性, 请确保其他试剂的最终浓度保持与以下相同。所有实验均在室温 (~ 25°c) 下进行。
<ol><li>库存解决方案的准备 注: 事先准备好以下解决方案。所有的等价物均可在室温 (~ 25°c) 下制备。<ol>
<li>
brb80 缓冲器 注: 此协议中使用的大多数解决方案的缓冲区都是 brb80。brb80 可大量制备, 并存储在-20°c 的冰柜中。<ol>
<li>在去离子水中溶解24.2 克哌嗪-n、n '-bis(2-乙氨酸) (ipes) 和3.1 克氢氧化钾 (koh), 使其达到800毫升 100 mm 的管道。加入100毫升的 10 mm 氯化镁 (mgcl2) 和100毫升的 10 mL 乙二醇四乙酸 (egta), 以获得1升的最终体积, 用氢氧化钾 (koh) 将 ph 值提高到 8, 有助于 pipes 和 egta 的溶解。 注: brb80 缓冲液中的化学品最终浓度为 80 mm 管、1 mm mgcl2和 1 mm egta。</li>
			<li>使用 koh 和盐酸 (hcl) 将缓冲液的 ph 值调整到6.9。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Atp
		<ol>
<li>在超纯水中制备 100 mL atp 的 1 ml 溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-80°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
gtp
		<ol>
<li>在超纯水中制备 25mm gtp 的500μl 溶液。将溶液移入5μl 的等价物。将等价物存放在-80°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
mgcl2
		<ol>
<li>在超纯水中制备 100 mm mgcl 2的 1 ml 溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
酪 蛋白
		<ol>
<li>称量1克干酪蛋白, 并将其转移到50毫升的锥形离心管中。在试管中加入35毫升 brb80 缓冲液, 溶解酪蛋白粉。</li>
			<li>将溶液放入冷室的翻滚器中, 以便在夜间溶解。此时, 溶液看起来又厚又粘稠。</li>
			<li>将管子垂直放在4°c 的冰箱中, 以便能够解决任何未溶解的大型团块。将上清液转移到新管中。</li>
			<li>在 1, 000 x克的离心机中旋转管道, 以产生更多的沉淀物。再次, 转移到一个新的管上清液。</li>
			<li>使用 0.2μm (最大压力) 过滤器重复过滤溶液。解决方案较厚, 许多筛选器将被堵塞, 因此请重复此步骤, 直到筛选器清除并未堵塞。</li>
			<li>使用 uv/vis 分光光度法测定得到的溶液中酪蛋白浓度, 使用酪蛋白的消光系数为 19 mm-1 * cm-1 , 在 280 nm20.假设酪蛋白的分子量为 23 kda, 则将溶液稀释到 brb80 中20毫克·ml-1的浓度。</li>
			<li>将溶液放入20μl 的等价物, 并将其存放在-20°c 的冷冻机中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
d-葡萄糖
		<ol>
<li>在超纯水中制备 2 m d-葡萄糖的 1 ml 溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
葡萄糖氧化酶
		<ol>
<li>在 brb80 中制备20毫克 * ml-1葡萄糖氧化酶的1毫升溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
过氧化氢 酶
		<ol>
<li>在 brb80 中制备0.8 毫克的1毫升溶液 * ml-1 过氧化氢酶。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
二硫醇 (dtt) 注: 由于 dtt 具有轻微的挥发性和毒性, 请在通风罩下执行以下步骤。<ol>
<li>制备在超纯水中稀释的 1m dtt 溶液1毫升。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
紫杉 醇
		<ol>
<li>制备在 dmso 中稀释的 1 mm 紫杉醇的1毫升溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
二甲基亚硫醚 (dmso) 注: 这些实验中使用的 dmso 是纯的。<ol>
<li>将纯 dmso 的皮包1毫升放入 10μl aliquots。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
磷酸肌酸
		<ol>
<li>在超纯水中制备 0.2 m 磷酸肌酸酯的1毫升溶液。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
肌酸磷酸激酶
		<ol>
<li>准备一个1毫升的解决方案, 200 单位·l-1肌酸磷酸激酶在超纯水中的作用。将溶液移入10μl 的等价物。将等价物存放在-20°c 的冰柜中。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
硫酸镍 (ii)
		<ol>
<li>在超纯水中制备 50 mm 镍 (ii) 硫酸盐溶液500毫升。将溶液存放在室温 (~ 25°c)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
聚乙二醇-块状聚 (丙二醇)-块状聚乙二醇 (乙二醇) (聚乙二醇) (聚乙二醇) 溶液
		<ol>
<li>称重2毫克的 peg-pwg-peg (平均分子量:14 600 g/m·mol-1)-nta 粉末在称重纸上。聚乙二醇-pwg-peg-nta 是用硝酸乙酸 (nta) 组功能化的三块共聚物。有关 peg-ppg-peg-nta 的更多详细信息, 请参阅材料表。</li>
			<li>将粉末转移到 1.5 ml 微离心管中。在管中加入1毫升的库存镍 (ii) 硫酸盐溶液。涡旋, 直到粉末被溶解, 没有可见的团块仍然存在。</li>
			<li>在室温下存放长达一个月。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>在开始实验之前
	<ol>
<li>在水桶里装满冰。</li>
		<li>从1.1.1 节中描述的13种试剂中的每一种试剂中取一个, 1.1.13 上面的, 并将它们添加到桶中, 从而将它们保持在冰上。使用前解冻每种试剂。</li>
	</ol></li>
	<li>微管制备 注: 微管由染料标记冻干小管蛋白的20μg 脂肪聚合而成。染料的激发波长为647纳米。<ol>
<li>
微管生长缓冲液的制备
		<ol>
<li>将21.8μl 的 brb80 缓冲液注入小型 (0.6 ml) 微离心管。加入 1μl的mgcl 2 库存溶液、1μl 的 gtp 库存溶液和1.2μl 的 dmso 库存溶液。 注: 因此, brb80 缓冲液中试剂的最终浓度为 4 mm mgcl2、1 mm gtp 和 5% (v/v) 二甲基亚硫酸盐。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
微管聚合
		<ol>
<li>将6.25μl 的微管生长缓冲液直接加入到标记冻干管蛋白的20μg 的脂肪中。在 30 rps 的情况下, 旋转 5 s 的 aliquot。</li>
			<li>将脂肪在冰上冷却 5分钟, 然后在37°c 孵育 45分钟, 然后进行切片1.3.3。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
微管稳定
		<ol>
<li>在490μl 的 brb80 缓冲液中加入5μl 的紫杉醇溶液。以 30 rps 的速度旋转10秒的解决方案。</li>
			<li>一旦微管的培养时间达到 45分钟, 将聚合微管溶液的5μl 添加到 brb80/aclitaxel 溶液中。 注: 这种100倍稀释、稳定的微管溶液将被称为 mt100。它最多可以使用 5天, 并且可以稀释, 以获得每个实验所需的微管密度。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>动力解决方案
	<ol>
<li>
酶抗褪色、atp 再生系统和 atp
		<ol>
<li>在291μl 的 brb80 缓冲液中加入9.0μl。</li>
			<li>如果实验所需的 atp 浓度低于 1 mm, 将 BRB80/casein 溶液的吡管83μl 注入新的 0.6 ml 微离心管。否则, 将该溶液的液槽85μl 放入新的 0.6 ml 微离心管中。</li>
			<li>在该管中加入1μl 的 d-葡萄糖、1μl 的葡萄糖氧化酶、1μl 的过氧化氢酶和1μl 的 dtt。 注: 这些化学物质构成了酶抗褪色鸡尾酒21 , 它将通过去除溶解氧和淬火反应自由基来减少光漂白。这减少了荧光成像 22,23 过程中激发照明引起的光漂白和微管崩解。</li>
			<li>对于选择 atp 浓度明显低于 1 mm 的实验, 在溶液中加入以下试剂以创建 atp 再生系统: 1 微米的脂肪酸磷酸肌酸溶液和1微米的外代肌酸磷酸激酶溶液。</li>
			<li>在动力溶液中加入1μl 的库存 atp 溶液。轻拍或旋涡的脂肪, 以均匀地分布的化学品。 注: 因此, 溶液中化学物质的最终浓度为10μm 紫杉醇, 0.5 mg·ml-1 酪蛋白 , 20 mm d-葡萄糖, 200μg·ml-1 葡萄糖氧化酶, 8μg·ml-1 过氧化氢酶, 10 mL二硫醇, 2 mm 磷酸肌酸 (如果添加), 2单位·l-1肌酸磷酸激酶 (如果添加) 和 1 mm atp。此解决方案将在以下情况下称为动力解决方案。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
基内辛 注: 这些实验中使用的库存动力学溶液由 g. bachand 在桑迪亚国家实验室综合纳米技术中心制备, 并根据用户协议 (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php) 提供, 此处使用的缓冲液包括40毫米咪唑、300 mm 氯化钠、0.76 克·l-1 egta, 37.2 毫克·l-1 edta, 50 克·l-1蔗糖, 0.2 mm tcep 和 50μm mg-atp。在这一系列实验中, 采用了 rkin430eGFP 因子结构。这是一种由首批430种大鼠在重链中的氨基酸和在尾部24融合的 c 端 hh 标记组成的激素.它在大肠杆菌中表达, 并使用镍-nta 柱纯化。采用55mm-1 · cm-1 在 489 nm 25 下的 gfp-1·mgle-1 的 gfp 消光系数, 并考虑到近年来素是二聚体, 用 uv/vis 分光光度法测定, gfp-激素素的库存溶液浓度为 1.8±0.3μm.<ol>
<li>确定实验所需的因子浓度或表面密度。对于典型的检测, 这种浓度为 20 nm。如果动素浓度需要稀释一百倍以上, 则在含有 0.5 mg·ml-1 酪蛋白的 brb80 溶液中稀释.</li>
			<li>在运动溶液中加入1μl 的动力溶液, 以获得约 20 nm 的最终浓度。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
微
		<ol>
<li>在运动溶液中加入第1.3 节中制备的 mt100 溶液的10μl。 注: 此动力解决方案最多可以使用3小时。之后, 防褪色系统失去其有效性, 因为溶液中的葡萄糖被酶反应耗尽。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 组装流动单元
<ol><li>
清洗盖板
	<ol>
<li>对于流动单元, 使用大盖板 (尺寸:60 毫米 x 25 毫米) 和小盖板 (尺寸:22 毫米 x 22 毫米)19。</li>
		<li>用乙醇冲洗两次, 用超纯水冲洗两次。将盖板在超纯水中涂成 5分钟, 在50–75°c 的温度下, 在烤箱中干燥。</li>
		<li>使用 uv/臭氧清洁剂 (见材料表和制造商的说明), 对每个盖板的一侧进行15分钟的处理, 在室温 (~ 25°c) 和正常大气条件 (1 atm 的压力) 下执行此步骤。</li>
		<li>小心地将每个盖板转向另一侧 (使用子), uv/臭氧也会治疗这一边。</li>
		<li>将盖板再次在超纯水中涂布 5分钟, 然后在50–75°c 的温度下再次在烤箱中干燥。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
处理盖板, 使聚乙二醇-pwg-peg 涂层 注: 本协议这一部分使用的二甲基二氯硅烷和甲苯具有剧毒性, 在烟罩下执行以下步骤, 同时采取以下预防措施: 在其实验室内佩戴两套防护手套和一件长袖衬衫外套。将手套的边缘塞入衬衫的袖子内, 以便在溢出的情况下, 前臂的皮肤不会直接暴露在化学物质中。戴上防护眼镜。<ol>
<li>在475毫升甲苯中稀释25毫升纯二甲基。将每个盖板浸泡在二甲基二氯硅烷和甲苯溶液中15秒。</li>
		<li>用甲苯清洗两次盖板, 在甲醇中清洗三次。使用加压氮气擦干盖板。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
将覆盖物组装成流动细胞
	<ol>
<li>一旦盖板干燥, 将2厘米 x2.5 厘米的双面胶带垂直切割成两条1厘米 x2.5 厘米的条纹。</li>
		<li>将大型盖板放在一个精致的任务雨刮器上, 并沿盖板边缘纵向贴胶带条纹, 在胶带碎片之间创建一个1厘米 x 2.5 厘米的区域。</li>
		<li>将小盖板贴在胶带条纹的顶部, 完成流动单元组件。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 将溶液流入流动单元
<ol><li>将聚乙二醇-pwg-peg 溶液的流动约20μl 流入组装的流动单元。在电池中飞行的体积必须足够大, 以填充房间。在接下来的步骤中, 在交换解决方案时使用相同的卷。</li>
	<li>允许聚乙二醇-pwg-peg 溶液在表面吸收5分钟。将 peg-pwg-peg 溶液与 brb80 缓冲液交换 3次, 将缓冲液流经。将运动液流动到流动细胞中。</li>
	<li>如果计划的实验超过一小时, 请用润滑脂密封流动细胞的边缘, 以防止蒸发。 注: 流单元现在已准备好进行映像。</li>
</ol>4. 成像流动单元
<ol><li>使用目标型全内部反射荧光 (tirf) 设置对微管和电机运动进行成像 (见材料表)。 注: 在这里, 我们使用了带有100x/1.49 数字孔径物镜的显微镜, 使用了两个激光器, 一个波长为 642 nm, 最大功率为 140 mw, 另一种波长为 488 nm, 最大功率为 150 mw。</li>
	<li>在目标上放置一滴浸入式油。</li>
	<li>将流动细胞放置在显微镜平台上, 并将目标提高到目标上的油与流动细胞之间的接触。</li>
	<li>使用显微镜的联锁覆盖系统阻止所有激光泄漏。</li>
	<li>打开激光, 将注意力集中在流动细胞的下表面。微管在647纳米的波长下进行荧光标记和激发。他们将使用642纳米激光成像, 而488纳米激光用于 gfp-运动素电机。</li>
	<li>录制感兴趣的图像或视频。通常情况下, 两个激光通道的激光功率约为 30 mw, 曝光时间为50毫秒。只要流动单元有运动, 就可以记录图像。 注: 激光照明对肉眼有害, 可造成无法弥补的损害。请确保照明区域完全覆盖着不透明的盖子。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Force-Generating+Protein,+Kinesin,+Involved+in+Microtubule-Based+Motility.">Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility.</a> Cell. 42, 39-50 (1985).</li><li>Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Follows+the+Microtubule's+Protofilament+Axis.">Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis.</a> Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).</li><li>Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+shuttles:+directed+motion+of+microtubules+along+nanoscale+kinesin+tracks.">Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks.</a> Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).</li><li>Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. 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H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).</li><li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry.">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

在这项工作中, 我们提出了一个主动纳米尺度系统, 它自组装弱结合的积木来构建自己的轨道。如图 1所示, 滑动微管会从溶液中积累运动, 并将其沉积在表面。在返回溶液之前, 运动电机在微管之后停留很短的时间。因此, 在这个实验中, 激素在3种状态之间交替:
(1) 微管单约束状态: 这是当一个运动第一次与微管结合。它与状态 (2) 保持平衡。
(2) 双约束状态: 在这种情况下, 微管单约束激素也通过其 hi-tag 与表面结合。这种双约束状态允许微管推进。
(3) 单一的表面约束状态: 一种双托运动, 它已经从微管的末端走了出来, 尚未从表面脱盐, 处于这种状态。这些电机可以在图 1 (组合和绿色通道) 中观察到: 它们在微管的尾部后面延伸了几微米, 并形成了其递减的轨迹。
该协议最关键的步骤是在滑块上形成疏水表面。它不仅使用危险化学品, 而且还允许与 nta 组功能化的 peg-ppg-peg 覆盖表面, 从而使激素可逆地结合到表面。另一个重要步骤是用润滑脂密封流动电池。这样可以在不使流动细胞中的液体蒸发的情况下进行长时间成像。
对这一技术的主要修改包括微管浓度的变化、激素浓度和 atp 浓度。改变微管浓度会改变微管在表面滑行的数量。改变在浓度中的运动会改变可以与微管结合的运动学分子的数量。然而, 增加运动蛋白浓度超过本实验中已经定义的量可能会增加背景荧光, 使其更难看到留下的运动轨迹滑翔微管。同时, 将 atp 浓度降低到10μm 以下将显著降低微管的滑动速度。如果需要这种效果, 有必要利用由肌酸磷酸酶和磷酸激酶组成的 atp 再生系统。
这种技术的一个可能的局限性是, 由于系统中的活性因子含量较大, atp 可以快速消耗, 并且在某些条件下实验可能持续不到一个小时。例如, 如果使用比本议定书中提出的更高的激素和五倍高的微管浓度, 就会出现这种情况。
在前面的工作18中, 我们研究了电机沿微管的空间分布, 证明了滑动微管从溶液中积累电机中的运动, 从而增加了电机沿长度的密度。微管布。我们还发现, 微管的滑动稳定性表现出非线性依赖于溶液动力学浓度和微管速度。
该协议为在纳米工程系统中更有效地利用蛋白质电机铺平了道路, 并为进一步研究处于动态平衡的活性纳米系统的设计提供了道路。此外, 该系统的动态特性使其能够成为研究分子成分自愈和动态替代的示范系统, 缩小工程结构和自然结构之间的部分差距。

控制活性纳米系统行为的相互作用一直以长寿命、几乎不可逆的键 1、2、3、4、5、6为特征 ,7,8。一个很好的研究例子是微管运动系统, 在这个系统中, 滑动微管是由电机1,2,3,4中不可逆转的表面结合运动学推动的. 5。在其中, 组件可可逆地相互连接的系统已在理论上研究了 9、10 , 并在 11、12 的宏观范围内实现, 但将这些系统扩展到纳米尺度一直具有挑战性。其中一个主要原因是, 打破和改革各组成部分之间的纽带往往需要环境条件发生重大变化。尽管这些变化是在过去13、14、15 中实施的, 但它们将依靠修改系统本身, 而不是使其适应其环境。设计分子规模的系统, 在不干扰实验进行的整体环境的情况下, 将部件不断组装和重组为结构, 这将为探索广泛的动态行为打开大门16,17岁
在这里, 我们描述并演示了在纳米尺度上动态组装和拆卸系统的详细协议。该系统及其一般行为已在18年初被引入: 微管丝是由可逆表面结合运动-1 电机的轨道推进的。这些运动蛋白是从溶液中招募出来的, 以帮助推动微管向前发展, 然后不久再去除氧。一旦回到解决方案, 他们可以再次被招募来推动一个新的微管。在过去的 13、14、15,打破和改革债券需要改变环境;相反, 我们的流动单元的环境保持不变, 而运动电机与表面相互作用。
该协议将帮助感兴趣的研究人员 (1) 可视化协议的所有步骤, (2) 协助对这种类型的检测进行故障排除。它来自霍华德等人 1993年19年所述的程序。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX 488-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>642 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX&#160;642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlorodimethylsilane solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40140-25ML</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34869-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TI</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP rkin430</td>
			<td>Provided by George Bachand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine Triphosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Sigma Pharmaceuticals</td>
			<td>8089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>656895-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1912-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F108-NTA</td>
			<td>Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular</td>
			<td></td>
			<td>PEG-PPG-PEG-NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-108</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542342-250G</td>
			<td>PEG-PPG-PEG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T324</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte647-labeled</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Ozone Procleaner</td>
			<td>BioForce Nanosciences</td>
			<td>PC440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;Puradisc syringe filters</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA67840402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS Camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>sCMOS 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins

该协议描述了如何创建运动素动力分子航天飞机与弱和可逆的连接的运动在表面。与以前的方案不同的是, 在这个系统中, 微管从溶液中吸收运动素运动, 并将其放置在表面上。这些激素反过来又会促进微管沿表面滑行, 然后再脱皮回散装溶液中, 从而可以再次被招募。这种连续的组装和拆卸导致了系统中惊人的动态行为, 比如通过滑行微管形成临时运动轨迹。
在整个实验过程中, 将介绍几种实验方法: 紫外-可见分光光度法将用于测定试剂的库存溶液的浓度, 覆盖物将首先经过臭氧和紫外线 (uv) 处理, 然后进行硅烷化在安装到流动细胞之前, 总的内部反射荧光 (tirf) 显微镜将用于同时成像电机和微管丝中的运动。

在这些实验中, 我们对1.3.2 部分制备的微管进行了1000倍的稀释。激素浓度为 20 nm, atp 浓度为 1 mm。使用 tirf 显微镜进行成像。与运动型电机分别成像了微管: 用 647 nm 激光 (图 1, 红色) 激发时可以看到微管, 用488纳米激光激发时可以看到 gfp-激酶 (图 1, 绿色)。与红光和绿光激发之间的时间小于1秒。帧之间的时间为 10秒, 微管显示出稳定的滑翔。微管的平均滑动速度约为 800 nm\。微管表面密度为400毫米-2。在几个微米的时间里, 运动素 (绿色) 的轨迹似乎延伸到微管 (红色) 的后端以外。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59068/59068fig1.jpg"> 图 1: 由微弱的表面结合运动在电机中推动的滑动微管.随着微管的前进, 它们从溶液中积累了电机的运动。这些电机在两种状态之间交替: 单绑在微管上, 双界到微管和表面。当双结合电机到达微管末端时, 电机被留在后面, 并缓慢地从表面分离, 关闭速率约为0.1 s-1。因此, 运动素电机的轨迹仍然存在于微管的后面。顶行: 红色 (微管) 通道。中间行: 绿色 (运动) 通道。底部行: 联合红色 (微管) 和绿色 (gfp-激素) 通道。刻度栏: 20μm. 请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59068/59068fig1large.jpg" target="_blank">点击这里查看这个数字的更大版本.</a>

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Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

由可逆连接的运动素提供动力的分子穿梭机的组装

我们提出了一个协议, 以建立分子航天飞机, 其中表面粘附的运动蛋白推动染料标记微管。激素与表面的弱相互作用使它们能够可逆地附着在表面上。这就创建了一个纳米系统, 该系统可显示其组件的动态组装和拆卸, 同时保留其功能。

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

该协议意义重大，因为它为进一步研究处于动态平衡的纳米级生物系统的设计打开了大门。这项技术填补了工程结构与自然结构之间的部分空白，因为它能够研究我们可以称之为"自我修复"或分子成分的动态替代。首次尝试这种技术最重要的建议是确保实验者遵循所有安全规程。首先，准备文本协议中概述的库存解决方案。将BRP80缓冲器移液器21.8微升放入小型微型离心管。加入 1 微升氯化镁库存溶液、1 微升 GTP 库存溶液和 1.2 微升的 DMSO 库存溶液，完成微管生长缓冲液的制备。要开始微管聚合，将6.25微升微管生长缓冲液直接加入20微克的冻干管状曲;标注在647纳米时兴奋。40 RPS 的漩涡 5 秒。冷却冰上的等分 5 分钟。然后，在37摄氏度下孵育45分钟。要开始微管稳定，在BRBR80缓冲液的490微升中加入5微升的分石塔塞尔溶液。在 30 RPS 下旋转溶液 10 秒。微管的45分钟孵育时间上升后，在BRBR80和paclitaxel混合物中加入5微升，以创建MT100溶液。首先，在 291 微升的 BRB80 缓冲器中添加 9.0 微升的等分卡明溶液。将BRP80卡明溶液的移液器83微升放入新的6毫升微离心管中。加入1微升D-葡萄糖、葡萄糖氧化酶、乳酸酶、DTT、磷酸肌酸和磷酸激酶。然后，在动力解决方案中添加 1 微升的库存 ATP 溶液。轻拂，或涡流等分，以均匀分布的化学物质。接下来，在动力溶液中加入1微升的已准备激酶溶液，使最终浓度为20纳米摩尔。向动力解决方案添加 10 微升 MT100 解决方案。对于流动单元，请使用大盖玻片和小盖玻片。用乙醇冲洗所有盖玻片两次，用超纯水冲洗两次。在超纯水中对洗涤的盖玻片进行声波处理 5 分钟。然后，在 50 至 75 摄氏度的温度下将盖玻片干燥在烤箱中。使用紫外线臭氧清洁剂在室温和正常大气条件下处理每个盖玻片的一侧 15 分钟。使用钳子，翻转每个盖玻片，并使用紫外线臭氧治疗未经处理的一面。在超纯水中对经过处理的盖玻片进行声波处理 5 分钟。然后，在50至75摄氏度的温度下在烤箱中干燥。接下来，请使用文本协议中概述的保护装备。将每个盖玻片浸入盐水溶液中 15 秒。用甲苯清洗盖玻片两次，用甲醇清洗三次。使用加压氮气干燥盖玻片。盖玻片干燥后，切一块 2 厘米或 2.5 厘米的双面胶带。将这块垂直切成两块 1 厘米，由 2.5 厘米条状。将大盖玻片放在精致的任务刮水器上，将胶带贴到它上，沿着边缘长度，在胶带片之间形成 1 厘米 2.5 厘米的面积。将小盖玻片贴在胶带条上，以完成流动单元组件。首先，将PEG-PPG-PEG溶液的约20微升液流入组装的流单元。让溶液在表面上吸收5分钟，然后，通过将缓冲液流入三次，用20微升BRBR80缓冲液交换该溶液。将运动溶液的20微升流入流动单元。在此之后，用润滑脂密封流动单元的边缘，以防止蒸发，如果计划的实验时间超过一小时。使用目标型总内花光显微镜执行成像。在目标上放置一滴浸入油。接下来，将流动单元放在显微镜平台上。并提出目标，直到目标上的油与流动单元之间接触。使用显微镜的联锁盖系统阻止所有激光逸出。然后，打开激光，使用 642 纳米激光对流单元的下表面进行聚焦，对微管进行成像，使用 488 纳米激光对 GFP Kinesin 电机进行成像。录制感兴趣的图像或视频。只要流动细胞中具有活动性，就可以记录图像。本研究提出了一个主动纳米尺度系统，它自组装弱结合的构建基块来构建自己的轨道。使用 tirf 显微镜，滑翔微管与激宁电机分开成像。使用 647 纳米激光激发时，微管可见。当使用 488 纳米激光兴奋时，GFPkinesin 是可见的。激发与红绿灯之间的时间不到一秒。可以看到，滑翔微管从溶液中积累激辛电机，并沉积在表面上。在返回溶液之前，Kinesin电机在微管的后，会保持一小段时间。在运动溶液的抗淡度中具有正确的试剂浓度是非常重要的，否则，光漂白会导致实验失败。该技术为在纳米级工程系统中更有效地使用蛋白质电机铺平了道路。因此，能够设计和研究更复杂的纳米结构。

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