Name: assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins
Uploaded: 2019-01-26T14:45:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins at JoVE.com

Forfatterne parlamentsarbejdet finansiel støtte under NSF grant NSF-DMR 1807514. Forfatterne takke G. Bachand og V. Vandelinder for at give normal god landbrugspraksis-kinesin protein. Dette arbejde var udført, delvist på Center for integreret nanoteknologi, en Office of Science bruger Facility drives for os afdeling af Energy (DOE) Office of Science ved Los Alamos National Laboratory (kontrakt nr. DE-AC52-06NA25396) og Sandia National Laboratories (con-tarmkanalen nr. 97 DE-AC04-94AL85000). Forfatterne takke Dr. Jennifer Neff og AllVivo kardiovaskulære for deres gave på PIND-PPG-PIND functionalized med NTA.

1. løsning forberedelse
Forsigtig: Tre af de reagenser, der anvendes i denne protokol (toluen, dimethyldichlorsilan og dithiothreitol) er meget giftige. Skal du kontakte de relevante materiale sikkerhedsdatablade (MSDS) før brug. Dele af denne protokol skal desuden udføres under et højere beskyttelsesniveau, bære sikkerhedsbriller og to sæt af beskyttende handsker som angivet. Medmindre andet tilrådes, kan forsøgene udføres på laboratoriet bænke mens du bruger alle de passende personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, laboratoriekittel, fuld længde bukser og lukket tå sko).
Bemærk: Koncentrationen af ATP, kinesin og mikrotubuli, der bruges i denne protokol kan blive ændret givet behov for hvert forsøg. Men hvis ændret, skal du sikre at de endelige koncentrationer af andre reagenser forbliver det samme som givet nedenfor. Alle eksperimenter blev udført ved stuetemperatur, (~ 25 ° C).
<ol><li>Forberedelse af stamopløsninger Bemærk: Forberede og alikvot følgende løsninger på forhånd. Alle delprøver kan tilberedes ved stuetemperatur (~ 25 ° C).<ol>
<li>
BRB80 buffer Bemærk: Buffer for de fleste af de løsninger, der anvendes i denne protokol er BRB80. BRB80 kan tilberedes i store mængder og opbevares i en-20 ° C fryser.<ol>
<li>Opløse 24,2 g piperazin-Nielsen, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (rør) og 3,1 g kaliumhydroxid (KOH) i 800 mL deioniseret vand at gøre 800 mL 100 mM rør. Tilsættes 100 mL 10 mM magnesiumchlorid (MgCl2) og 100 mL 10 mM ethylenglycol tetraacetic syre (EGTA) for at få en endelige mængden af 1 L. avl til pH 8 med kaliumhydroxid (KOH) kan hjælpe i opløsningen af rør og EGTA. NOTE: De endelige koncentrationer af kemikalier i BRB80 buffer er 80 mM rør, 1 mM MgCl2og 1 mM EGTA.</li>
			<li>Justere pH buffer til 6,9 ved hjælp af KOH og saltsyre (HCl).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ATP
		<ol>
<li>Forberede en 1 mL opløsning af 100 mM ATP i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i et-80 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
GTP
		<ol>
<li>Forberede en 500 μl opløsning af 25 mM GTP i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning til 5 μl delprøver. Gemme delprøver i et-80 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
MgCl2
		<ol>
<li>Forberede en 1 mL opløsning af 100 mM MgCl2 i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kasein
		<ol>
<li>Der afvejes 1 g tørre kasein og overføre det til en 50 mL konisk centrifugeglas. Tilføje 35 mL af BRB80 buffer til glasset til kasein pulveret opløses.</li>
			<li>Sted løsning i en tørretumbler i et koldt rum til at opløse natten over. På dette tidspunkt, vil løsningen ser tyk og tyktflydende.</li>
			<li>Forlade røret oprejst i 4 ° C køleskab til at tillade nogen store uopløst klumper at bilægge. Overføre supernatanten til en ny tube.</li>
			<li>Dreje røret i en centrifuge på 1.000 x g at sammenpresse ud mere bundfald. Igen, overføre supernatanten til en ny tube.</li>
			<li>Gentagne gange filtrere løsning med 0,2 μm (7 bar maksimalt pres) filtre. Løsningen bliver tyk, mange filtre vil få tilstoppet, så Gentag dette trin, indtil filtret er klar og unclogged.</li>
			<li>Bestemme koncentrationen af kasein i den resulterende løsning ved hjælp af UV/Vis spektrofotometri, ved hjælp af kaseins extinction koefficient af 19 mM-1∙cm-1 på 280 nm20. Antager en molekylevægt af 23 kDa for kasein, fortyndes løsning til en koncentration af 20 mg∙mL-1 i BRB80.</li>
			<li>Med pipette overfoeres løsning til 20 μL delprøver og gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
D-glukose
		<ol>
<li>Forberede en 1 mL opløsning af 2 M D-glucose i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Glucose stavbakterier
		<ol>
<li>Forberede en 1 mL opløsning af 20 mg∙mL-1 glucose stavbakterier i BRB80. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Katalase
		<ol>
<li>Forberede en 1 mL opløsning af 0,8 mg∙mL-1 katalase i BRB80. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Dithiothreitol (DTT) Bemærk: Da DTT er lidt flygtige og giftige, skal du udføre følgende trin under et stinkskab.<ol>
<li>Forberede en 1 mL opløsning af 1 M DTT fortyndet i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Paclitaxel
		<ol>
<li>Forberede en 1 mL opløsning af 1 mM paclitaxel fortyndet i DMSO. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Dimethylsulfoxid (DMSO) Bemærk: DMSO disse forsøgsdyr er ren.<ol>
<li>Afpipetteres 1 mL ren DMSO i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kreatin phosphat
		<ol>
<li>Forberede en 1 mL oploesning af 0,2 M kreatin fosfat i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kreatin phosphokinase
		<ol>
<li>Forberede en 1 mL opløsning af 200 units· L-1 kreatin phosphokinase i ultrarent vand. Med pipette overfoeres løsning i 10 μL delprøver. Gemme delprøver i en-20 ° C fryser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Nikkel (II) sulfat
		<ol>
<li>Forberede 500 mL af en oploesning af 50 mM nikkel (II) sulfat i ultrarent vand. Gemme løsning ved stuetemperatur (~ 25 ° C).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Poly(ethylene glycol)-blok-poly(propylene glycol)-blok-poly(ethylene glycol) (PIND-PPG-PLØK) løsning
		<ol>
<li>Afvejes 2 mg af PEG-PPG-PEG (nummer gennemsnitlig molekylevægt: 14,600 g∙mol-1)-NTA pulver på vejer papir. PIND-PPG-PIND-NTA er triblock copolymer functionalized med en nitrilotrieddikesyre syre (NTA) gruppe. Henvises til Tabel af materialer for flere detaljer om PIND-PPG-PIND-NTA.</li>
			<li>Overføre pulveret i en 1,5 mL microcentrifuge rør. Der tilsættes 1 mL af stamopløsningen nikkel (II) sulfat til røret. Vortex indtil pulveret er opløst og ingen synlige klumper forblive.</li>
			<li>Butik i op til én måned ved stuetemperatur.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Før du starter et eksperiment
	<ol>
<li>Fyld en spand med is.</li>
		<li>Tage en prøve fra hver af de 13 reagenser beskrevet i punkt 1.1.1 til 1.1.13 ovenfor og tilføje dem til spanden, således at holde dem på is. Tø hver af reagenser før brug.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikrotubulus forberedelse Bemærk: Mikrotubuli var polymeriserede fra en 20 μg alikvot af dye-mærket frysetørrede tubulin. Excitation bølgelængden af farvestoffet er af 647 nm.<ol>
<li>
Forberedelse af mikrotubulus vækst buffer
		<ol>
<li>Med pipette overfoeres 21,8 μL BRB80 buffer ind i en lille (0,6 mL) microcentrifuge tube. Tilføj 1 μL MgCl2 stamopløsning, 1 μL af GTP stamopløsningen og 1,2 μL af DMSO stamopløsningen. Bemærk: Således de endelige koncentrationer af reagenser i BRB80 buffer er 4 mM MgCl2, 1 mM GTP og 5% (v/v) dimethylsulfoxid.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Mikrotubulus polymerisering
		<ol>
<li>Tilføje 6,25 μL mikrotubulus vækst buffer direkte ind i en 20 μg alikvot af mærket frysetørrede tubulin. Vortex alikvot for 5 s til 30 rps.</li>
			<li>Cool alikvot i isbad i 5 min før inkubation ved 37 ° C i 45 min og fortsætte til afsnit 1.3.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Mikrotubulus stabilisering
		<ol>
<li>Tilsættes 5 μl af opløsningen aliquoted paclitaxel 490 μL BRB80 buffer. Vortex løsning for 10 s på 30 rps.</li>
			<li>Når 45 min inkubation for mikrotubuli er op, tilsættes 5 μl polymeriseret mikrotubulus løsningens BRB80/paclitaxel løsning. Bemærk: Denne 100-fold fortyndet, stabiliseret, mikrotubulus løsning vil blive benævnt MT100. Det kan bruges i op til 5 dage, og det kan fortyndes for at opnå den ønskede mikrotubulus tæthed for hvert forsøg.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Motilitet løsning
	<ol>
<li>
Enzymatisk antifade, ATP regenererende system og ATP
		<ol>
<li>Tilføje 9.0 μL aliquoted kasein løsning til 291 μL BRB80 buffer.</li>
			<li>Hvis den ønskede ATP koncentrationen for eksperimentet er lavere end 1 mM, afpipetteres 83 μL af BRB80/kasein løsningen ind i en ny 0,6 mL microcentrifuge rør. Ellers, afpipetteres 85 μL af denne løsning i en ny 0,6 mL microcentrifuge rør.</li>
			<li>Tilføje 1 μL af D-glucose, 1 μL af glucose stavbakterier, 1 μL af katalase og 1 μL af DTT til at tube. Bemærk: Disse kemikalier udgør en enzymatisk antifade cocktail21 , der vil reducere photobleaching ved at fjerne opløst ilt og dæmper reaktive radikaler. Dette reducerer photobleaching og mikrotubulus nedbrydning forårsaget af excitation belysning under fluorescens imaging22,23.</li>
			<li>For eksperimenter, hvor ATP koncentrationen er valgt til at være betydeligt lavere end 1 mM, Tilføj de følgende reagenser til opklaring hen til skabe en ATP-regenererende system: 1 μL aliquoted kreatin fosfat løsning og 1 μL aliquoted kreatin phosphokinase løsning.</li>
			<li>Tilføje 1 μL af stamopløsningen ATP til motilitet løsning. Svirp eller vortex alikvot homogen måde distribuere kemikalier. NOTE: Den endelige koncentration af kemikalier i løsningen er således 10 μM paclitaxel, 0,5 mg·mL1 kasein, 20 mM D-glucose, 200 μg·mL1 glucose stavbakterier, 8 μg·mL1 katalase, 10 mM dithiothreitol, 2 mM kreatin phosphat (hvis tilføjet), 2 Units· L1 kreatin phosphokinase (hvis tilføjet), og 1 mM ATP. Denne løsning vil herefter blive omtalt som motilitet løsning.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kinesin Bemærk: Stock kinesin løsningen anvendes i disse eksperimenter er udarbejdet af G. Bachand på Center for integreret nanoteknologi på Sandia National Laboratories og stillet til rådighed under en brugeraftale (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). den buffer, der bruges her består af 40 mM imidazol, 300 mM NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37,2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 saccharose, 0,2 mM TCEP og 50 μM Mg-ATP. Til denne serie af eksperimenter, blev rkin430eGFP kinesin konstruktion brugt. Dette er en kinesin bestående af de første 430 aminosyrer i rotte kinesin tunge kæde sammenvokset til eGFP og en C-terminale hans-tag på halen domæne24. Det blev udtrykt i Escherichia coli og renset ved hjælp af en Ni−NTA kolonne. Koncentrationen af stamopløsningen normal god landbrugspraksis-kinesin var 1,8 ± 0,3 μM, bestemt af UV/Vis spektrofotometri, ved hjælp af en udslettelse koefficient for normal god landbrugspraksis i 55 mM-1·cm-1 på 489 nm25, og under hensyntagen til at kinesin er en dimer.<ol>
<li>Bestemme den ønskede kinesin koncentration eller overflade tæthed for eksperimentet. For typiske assays, denne koncentration er 20 nM. Hvis kinesin koncentration skal fortyndes mere end en hundredfold, fortynde det i en opløsning af BRB80, der indeholder 0,5 mg·mL-1 af kasein.</li>
			<li>Tilføje 1 µL af kinesin løsning til motilitet løsning for at få en endelig koncentration på omkring 20 nM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Mikrotubuli
		<ol>
<li>Tilsættes 10 μL MT100 løsning parat i afsnit 1.3 motilitet løsning. Bemærk: Denne motilitet løsning kan bruges i op til 3 timer. Efter tid mister det antifade system sin effektivitet fordi glukose i løsningen er forarmet af enzymatisk reaktion.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. montering flow celler
<ol><li>
Vask af coverslips
	<ol>
<li>For flow celler, bruge en stor coverslip (dimension: 60 mm x 25 mm) og en lille en (dimensioner: 22 mm x 22 mm)19.</li>
		<li>Skyl alle coverslips to gange med ethanol og to gange med ultrarent vand. Der sonikeres coverslips i ultrarent vand i 5 min. tørre dem i en ovn ved en temperatur på 50-75 ° C.</li>
		<li>Ved hjælp af en UV/ozon renere (Se Tabel af materialer og producentens anvisninger), behandle én side af hver coverslip i 15 min. udføre dette trin kan ved stuetemperatur (~ 25 ° C) og i normale atmosfæriske tilstand (tryk på 1 atm).</li>
		<li>Slå forsigtigt hver coverslip til den anden side (med pincet) og UV/ozon behandling af denne side.</li>
		<li>Der sonikeres coverslips i ultrarent vand igen for 5 min før tørring dem igen i ovnen ved en temperatur på 50-75 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Behandling af coverslips for at aktivere PIND-PPG-PIND belægning Bemærk: Dimethyldichlorsilan og toluen anvendes i denne del af protokollen er meget giftigt, skal du udføre følgende trin under et stinkskab, samtidig med at tage følgende forholdsregler: bære to sæt af beskyttende handsker og en langærmet skjorte under deres lab frakke. Tuck kanterne af handsker inde ærmerne af skjorten, således at ingen hud fra underarmene er direkte udsat for kemikalier i tilfælde af et spild. Bære beskyttelsesbriller.<ol>
<li>Fortyndet 25 mL ren dimethyldichlorsilan i 475 mL toluen. Fordyb hver coverslip i opløsningen dimethyldichlorsilan og toluen i 15 sekunder.</li>
		<li>Vask af coverslips, to gange i toluen og tre gange i methanol. Tørre coverslips ved hjælp af tryk kvælstof.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Samle coverslips til flow celler
	<ol>
<li>Når coverslips er tørre, skåret en 2 cm x 2,5 cm stykke dobbeltsidet tape vertikalt i to 1 cm x 2,5 cm striber.</li>
		<li>Sætte det store coverslip på en delikat opgave visker og stick tape striber på langs kanten af coverslip til at oprette et 1 cm x 2,5 cm område mellem stykker tape.</li>
		<li>Holde den lille coverslip på toppen af tape striber til slut flow celle forsamling.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. flyder løsningerne i en flow-celle
<ol><li>Flyde omkring 20 μL PIND-PPG-PIND løsning i cellen samlet flow. Den diskenhed, der er fløjet i cellen må være stor nok til at fylde salen. I de næste skridt, bruge den samme volumen når udveksling af løsninger.</li>
	<li>Mulighed for PIND-PPG-PIND løsning til at absorbere på overfladen i 5 minutter. Udveksle PIND-PPG-PIND løsningen med BRB80 buffer 3 gange af flydende buffer i. Flow motilitet løsningen ind i flow-cellen.</li>
	<li>Forsegle kanterne af cellen flow med fedt at forhindre fordampning, hvis den planlagte eksperiment er længere end en time. Bemærk: Cellen flow er nu klar til afbildning.</li>
</ol>4. imaging en flow-celle
<ol><li>Udføre imaging ved hjælp af et mål-type total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) setup for både mikrotubuli og kinesin motorer (Se Tabel af materialer). Bemærk: Her, vi brugte et mikroskop med en 100 x / 1,49 numerisk blænde mål linse, ved hjælp af to lasere, én med en bølgelængde på 642 nm og en maksimal effekt på 140 mW, og en anden med bølgelængde på 488 nm og en maksimal effekt på 150 mW.</li>
	<li>Anbring en dråbe immersionsolie på målet.</li>
	<li>Placere cellen flow på mikroskop-platformen og bringe målsætningen, indtil der er kontakt mellem olien på målet og flow-cellen.</li>
	<li>Bruge den mikroskop interlock cover system til at blokere alle laserlys i at flygte.</li>
	<li>Tænd laseren og fokusere på den nedre overflade af cellen flow. Mikrotubuli er fluorescently mærket og ophidset ved en bølgelængde på 647 nm. De vil være afbildet med en 642 nm laser, mens en 488 nm laser bruges til normal god landbrugspraksis-kinesin motorer.</li>
	<li>Optage billeder eller videoer af interesse. Laser power er typisk omkring 30 mW og en eksponeringstid på 50 ms for både laser kanaler. Billeder kan registreres, så længe der er motilitet i cellen flow. Bemærk: Laser belysningsstyrke er skadeligt for det blotte øje og kan forårsage uoprettelig skade. Sørg for at det belyste område er helt dækket med en uigennemsigtig låg.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Force-Generating+Protein,+Kinesin,+Involved+in+Microtubule-Based+Motility.">Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility.</a> Cell. 42, 39-50 (1985).</li><li>Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Follows+the+Microtubule's+Protofilament+Axis.">Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis.</a> Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).</li><li>Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+shuttles:+directed+motion+of+microtubules+along+nanoscale+kinesin+tracks.">Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks.</a> Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).</li><li>Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+bundle+formation+driven+by+ATP:+the+effect+of+concentrations+of+kinesin,+streptavidin+and+microtubules.">Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules.</a> Nanotechnology. 21, 145603 (2010).</li><li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+Expressed+in+Insect+Cells+Improves+Microtubule+in+Vitro+Gliding+Performance,+Long-Term+Stability+and+Guiding+Efficiency+in+Nanostructures.">Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).</li><li>Whitesides, G. M., Grzybowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+at+all+scales.">Self-assembly at all scales.</a> Science. 295, 2418-2421 (2002).</li><li>Ringler, P., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+proteins+into+designed+networks.">Self-assembly of proteins into designed networks.</a> Science. 302, 106-109 (2003).</li><li>Boncheva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+self-assembly+of+three-dimensional+surfaces+from+planar+sheets.">Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).</li><li>England, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissipative+adaptation+in+driven+self-assembly.">Dissipative adaptation in driven self-assembly.</a> Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).</li><li>Fialkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+Implementations+of+Dissipative+(Dynamic)+Self-Assembly.">Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).</li><li>Boncheva, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+systems+having+a+design+stimulated+by+the+vertebrate+spine.">Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).</li><li>Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+self-assembly+in+a+thousand-robot+swarm.">Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm.</a> Science. 345, 795-799 (2014).</li><li>Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+structural+composites+with+electromagnetic+functionality.">Self-healing structural composites with electromagnetic functionality.</a> Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).</li><li>Ghosh, S. K., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Self-Healing Materials. , 1-28 (2009).</li><li>Burnworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optically+healable+supramolecular+polymers.">Optically healable supramolecular polymers.</a> Nature. 472, (2011).</li><li>Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-Based+Nanomaterials:+Exploiting+Nature's+Dynamic+Biopolymers.">Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).</li><li>Gao, Y. W., Lei, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+scale+effects+on+the+mechanical+behaviors+of+protein+microtubules+based+on+the+nonlocal+elasticity+theory.">Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).</li><li>Lam, A. T. -. C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibly+Bound+Kinesin-1+Motor+Proteins+Propelling+Microtubules+Demonstrate+Dynamic+Recruitment+of+Active+Building+Blocks.">Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks.</a> Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).</li><li>Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L., Yada, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins in Food Processing (Second Edition). , 49-92 (2018).</li><li>Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regenerating+system+for+studies+of+phosphoryl+transfer+from+ATP.">A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP.</a> Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).</li><li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry.">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

I dette arbejde præsenterer vi en aktiv nanoskala system som self samler svagt-bindende byggesten for at konstruere sit eget spor. Som vist i figur 1, svæveflyvning mikrotubuli akkumulere kinesin motorer fra løsning og deponere dem på overfladen. Kinesin motors forbliver i kølvandet på mikrotubulus for en kort periode før han vendte tilbage til løsning. Således i dette eksperiment motorer kinesin alternativ mellem 3 stater:
(1) en mikrotubulus single-bundet tilstand: Dette er, når en kinesin først bindes til en mikrotubulus. Den findes i ligevægt med staten (2).
(2) en dobbelt-bundet tilstand: i dette tilfælde en mikrotubulus single-bundet kinesin også binder sig til den overflade via sin hans-tag. Denne dobbelt-bundet tilstand giver til mikrotubulus fremdrift.
(3) en enkelt overflade-bundet tilstand: et dobbelt-bundet kinesin, der har gået ud i slutningen af en mikrotubulus og har ikke endnu desorberet fra overfladen er i denne tilstand. Disse motorer kan ses i figur 1 (kombineret og grønne kanaler): de udvide bag halen af mikrotubulus for flere mikrometer og danne sin faldende trail.
Det mest afgørende skridt i denne protokol er dannelsen af den hydrofobe overflade på diaset. Ikke kun bruger den farlige kemikalier, men det giver også mulighed for PIND-PPG-PIND functionalized med gruppen NTA til pels overfladen, som derefter tillader kinesin reversibelt bindes til overfladen. Et andet vigtigt skridt forsegling cellen flow med fedt. Dette giver mulighed for forlænget tænkelig uden væske i flow celle fordamper.
De primære ændringer til denne teknik består af skiftende mikrotubulus koncentration, kinesin koncentration og ATP koncentrationen. Ændre mikrotubulus koncentration vil ændre antallet af mikrotubuli glider på overfladen. Ændring af kinesin koncentration vil ændre antallet af kinesin molekyler, der kan bindes til en mikrotubulus. Men øget kinesin koncentration over de beløb, der allerede er defineret i dette eksperiment kan øge baggrund fluorescens, hvilket gør det sværere at se de kinesin stier efterladt svæveflyvning mikrotubuli. I mellemtiden vil sænke ATP koncentrationer under 10 µM signifikant fald mikrotubulus svæveflyvning hastighed. Hvis denne effekt ønskes, er det nødvendigt at udnytte en ATP regenererende system bestående af kreatin fosfatase og phosphokinase.
En eventuel begrænsning af denne teknik er, at på grund af det store aktive kinesin indholdet af systemet, ATP kan hurtigt forbruges, og eksperimenter kan vare mindre end en time i visse betingelser. Dette ville for eksempel være tilfældet, hvis en brugt en dobbelt højere kinesin koncentration og fem gange højere mikrotubulus koncentration end hvad er præsenteret i denne protokol.
I vores tidligere arbejde18, vi studerede den geografiske fordeling af kinesin motors langs mikrotubuli, bevise at svæveflyvning mikrotubuli akkumulerer kinesin motorer fra løsning, som medfører en forøgelse af tætheden af motors langs længden af den mikrotubulus. Vi fandt også, at mikrotubuli gliding stabilitet viste en ikke-lineær afhængighed af løsning kinesin koncentration og mikrotubulus hastighed.
Præsenteres protokollen baner vejen for en mere effektiv udnyttelse af protein motorer i nanoskala manipuleret systemer og til yderligere undersøgelse i udformningen af aktive nanosystemer, som er i dynamisk ligevægt. Desuden, den dynamiske karakter af dette system gør det muligt at tjene som en model til at studere selvhelende og dynamisk udskiftning af molekylære komponenter, lukke en del af kløften mellem konstruerede og naturlige strukturer.

De interaktioner, der regulerer funktionen af aktive nanosystemer har altid været præget af langlivet, næsten uoprettelige obligationer1,2,3,4,5,6 ,7,8. En velundersøgte eksempel på dette er mikrotubulus-kinesin system, hvor gliding mikrotubuli er fremdrives ved uigenkaldeligt overflade-bundet kinesin motorer1,2,3,4, 5. Systemer, hvori komponenterne er reversibelt forbundet til hinanden har været undersøgt teoretisk9,10 og gennemføres på overordnet11,12, men skalering disse systemer ned til den nanoskala har været udfordrende. En af de vigtigste grunde til dette er at bryde og reformere obligationer mellem komponenter ofte kræver store ændringer i de miljømæssige forhold. Selvom sådanne ændringer er blevet gennemført i de sidste13,14,15, ville de afhængige ændre selve systemet i stedet for at tilpasse den til sine omgivelser. Designe Molekylær-skala systemer hvor komponenter løbende samle og omorganisere i strukturer uden at forstyrre det generelle miljø, hvori forsøgene finder sted vil åbne døren til udforskningen af en bred vifte af dynamisk adfærd 16 , 17.
Her, vi beskriver og viser detaljerede protokollen for at oprette en dynamisk samling og adskillelse system fungerer på nanoskalaen. Systemet og dets generelle opførsel er blevet indført tidligere18: mikrotubulus filamenter er fremdrives ved spor af reversibelt overflade-bundet kinesin-1 motorer. Disse kinesin motor proteiner er rekrutteret fra løsning til at hjælpe fremdrive mikrotubuli frem, før desorbing igen kort tid bagefter. Når tilbage i løsning, kan de ansættes igen til at fremdrive en ny mikrotubulus. I de sidste13,14,,kræves15, breaking og reform af obligationer miljømæssige ændringer; Derimod forbliver miljø for vores flow celle uændret, mens kinesin motors interagere med overfladen.
Denne protokol vil hjælpe interesserede forskere til (1) visualisere alle trin i protokollen, og (2) hjælpe med fejlfinding af denne type analyse. Det er afledt af de procedurer, der er beskrevet i Howard et al. 199319.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX 488-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>642 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX&#160;642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlorodimethylsilane solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40140-25ML</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34869-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TI</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP rkin430</td>
			<td>Provided by George Bachand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine Triphosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Sigma Pharmaceuticals</td>
			<td>8089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>656895-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1912-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F108-NTA</td>
			<td>Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular</td>
			<td></td>
			<td>PEG-PPG-PEG-NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-108</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542342-250G</td>
			<td>PEG-PPG-PEG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T324</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte647-labeled</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Ozone Procleaner</td>
			<td>BioForce Nanosciences</td>
			<td>PC440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;Puradisc syringe filters</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA67840402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS Camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>sCMOS 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins

Denne protokol beskriver, hvordan du opretter kinesin-drevne molekylære pendulfart med en svag og reversible udlæg i kinesins overflade. I modsætning til tidligere protokoller i dette system, mikrotubuli rekruttere kinesin motor proteiner fra løsningen og placere dem på en overflade. Kinesins vil til gengæld lette gliding af mikrotubuli langs overfladen før desorbing tilbage i bulk løsning, således at være til rådighed til at blive ansat igen. Denne kontinuerlige montering og demontering fører til slående dynamiske opførsel i systemet, såsom dannelsen af midlertidige kinesin stier af svæveflyvning mikrotubuli.
Flere eksperimentelle metoder vil blive beskrevet i hele dette eksperiment: UV-Vis spektrofotometri vil blive brugt til at bestemme koncentrationen af stamopløsninger af reagenser, coverslips vil først blive ozon og ultraviolet (UV) behandlet og derefter TOT silaniseret før monteres i flow celler og total interne reflection fluorescens bruges (JOHANNAS) mikroskopi til samtidigt billede kinesin motors og mikrotubulus filamenter.

I disse eksperimenter, vi brugte en 1,000 gange fortynding af mikrotubuli forberedt i punkt 1.3.2. Kinesin koncentration var 20 nM, og ATP koncentrationen var 1 mM. Imaging blev udført ved hjælp af JOHANNAS mikroskopi. Svæveflyvning mikrotubuli var særskilt afbildet fra kinesin motorer: mikrotubuli blev synlig ved excitation med en 647 nm laser (figur 1, red), og normal god landbrugspraksis-kinesin var synlig, når ophidset med en 488 nm laser (figur 1, grøn). Tiden mellem magnetisering med det røde og grønne lys var mindre end 1 s. Tiden mellem rammer var 10 s. mikrotubuli vises stabil svæveflyvning. Den gennemsnitlige mikrotubulus svæveflyvning hastighed var omkring 800 nm/s. Mikrotubulus overflade tætheden var 400 mm-2. Spor af kinesin (grøn) syntes at overskride den efterstillede slutningen af mikrotubuli (rød) til flere mikrometer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59068/59068fig1.jpg"> Figur 1: svæveflyvning mikrotubuli fremdrives ved svagt overflade-bundet kinesin motors. Som mikrotubuli bevæger os fremad, ophobes de kinesin motorer fra løsning. Disse motorer veksler mellem to stater: single-bundet til en mikrotubulus, og dobbelt-bundet til både mikrotubulus og overfladen. Når en dobbelt bundet motor når enden af en mikrotubulus, motoren er efterladt og desorbs langsomt fra overfladen med en off på ca 0,1 s-1. Som et resultat, forbliver stier af kinesin motors bag mikrotubuli. Øverste række: rød (mikrotubulus) kanal. Mellemste række: grøn (kinesin) kanal. Nederste række: kombineret rød (mikrotubulus) og grønne (normal god landbrugspraksis-kinesin) kanal. Skalalinjen: 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59068/59068fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins at JoVE.com

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

Montering molekylære pendulfart drevet af reversibelt vedhæftet Kinesins

Vi præsenterer en protokol for at opbygge molekylære pendulkørsler, hvor overflade-overholdt kinesin motor proteiner fremdrive dye-mærket mikrotubuli. Svage interaktioner i kinesins med overfladen giver deres reversible tilknytning til det. Dette skaber en nanoskala system, der udstiller dynamisk samling og demontering af dens komponenter samtidig bevare dens funktionalitet.

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Denne protokol er vigtig, fordi den åbner døren for yderligere undersøgelser i udformningen af biologiske nanoskalasystemer, der er i dynamisk ligevægt. Denne teknik udfylder en del af kløften mellem manipulerede og naturlige strukturer, fordi det gør det muligt at studere, hvad vi kunne kalde, selvhelbredende 'eller den dynamiske udskiftning af molekylære komponenter. Det vigtigste råd til at prøve denne teknik for første gang er at sikre, at eksperimentatoren følger alle sikkerhedsprotokoller.Først skal du forberede lagerløsningerne som beskrevet i tekstprotokollen. Pipette 21,8 mikroliter BRB80 Buffer i et lille mikrocentrifugerør. Der tilsættes 1 mikroliter af magnesiumchloridlageropløsningen, 1 mikroliter af GTP-lageropløsningen og 1,2 mikroliter af DMSO-lageropløsningen for at afslutte klargøring af mikroubulevækstbufferen.Til at begynde mikrotubule polymerisering, tilføje 6,25 mikroliter af mikrotubule vækst buffer direkte ind i en 20 mikrogram aliquot af frysetørret tubulin;mærket til at være ophidset på 647 nanometer. Vortex på 40 RPS i 5 sekunder. Afkøl aliquot på is i 5 minutter.Derefter inkuberes ved 37 grader Celsius i 45 minutter. For at begynde microtubule stabilisering, tilsættes 5 mikroliter af aliquoted paclitaxel løsning til 490 mikroliters af BRB80 buffer. Vortex løsningen ved 30 RPS i 10 sekunder.Når de 45 minutters inkubation for mikrotubuli er op, tilsættes 5 mikroliter af denne opløsning til BRB80, og paclitaxel blandingen, at skabe MT100 løsning. Først tilsættes 9,0 mikroliter af den aliquoterede caseinopløsning til 291 mikroliter BRB80-buffer. Pipette 83 mikroliter af BRB80-caseinopløsningen til et nyt mikrocentrifugerør på 6 milliliter.Tilsæt 1 mikroliter D-glukose, glukose oxidase, katalase, DTT, kreatin fosfat, og fosforkinase. Derefter tilsættes 1 mikroliter af bestanden ATP løsning til motilitet løsning. Svirp, eller vortex aliquot at homogent distribuere kemikalier.Dernæst tilsættes 1 mikroliter af forberedt kinesinopløsning til motilitetsopløsningen, således at den endelige koncentration er 20 nanomolar. Tilføj 10 mikroliter af MT100-opløsningen til motilitetsopløsningen. For flowceller skal du bruge både en stor dæksling og en lille dækslæb.Skyl alle dækslæderne to gange med ethanol og to gange med ultrarent vand. Sonikere de vaskede coverslips i ultrapure vand i 5 minutter. Tør derefter dækslerne i en ovn ved en temperatur mellem 50 og 75 grader Celsius.Brug en UV-ozonrenser til at behandle den ene side af hver dækslet i 15 minutter ved stuetemperatur og under normale atmosfæriske forhold. Brug pincet, flip hver coverslip og bruge UV-ozon til at behandle den ubehandlede side så godt. Sonikere de behandlede coverslips i ultrarent vand i 5 minutter.Tør dem derefter i en ovn ved en temperatur mellem 50 og 75 grader Celsius. Dernæst don beskyttelsesudstyr som skitseret i tekstprotokollen. Hver dækslæb skal nedsænkes i saltvandsopløsning i 15 sekunder.Dækslingerne vaskes to gange i toluen og tre gange i methanol. Brug nitrogen under tryk til at tørre dækslerne. Når dækslæberne er tørre, skæres et stykke dobbeltsidet tape, der er 2 centimeter med 2,5 centimeter.Skær dette stykke i halve lodret i to 1 centimeter med 2,5 centimeter strimler. Sæt den store dækslæd på en delikat opgave visker og holde båndstrimlerne til det, længde-wise langs kanterne for at skabe en 1 centimeter med 2,5 centimeter område mellem stykkerne af tape. Sæt den lille dækslæd på toppen af båndstrimlerne for at afslutte flowcellesamlingen.Først skal du flyde ca. 20 mikroliter af PEG-PPG-PEG-løsningen ind i den samlede flowcelle. Lad opløsningen absorbere på overfladen i 5 minutter, derefter udveksle denne løsning med 20 mikroliter BRB80 buffer tre gange ved at flyde bufferen i. Flow 20 mikroliter af motilitetsopløsningen ind i flowcellen.Derefter forsegles flowcellens kanter med fedt for at forhindre fordampning, hvis det planlagte eksperiment er længere end en time. Udfør billeddannelsen ved hjælp af en samlet intern florescencemikroskopi af objektivtypen. Placer en dråbe nedsænkning olie på målet.Dernæst placere flow celle på mikroskop platform. Og bringe målet op, indtil der er kontakt mellem olien på målet og flowcellen. Brug mikroskopets interlock cover system til at blokere alt laserlys i at slippe ud.Tænd derefter for laseren og fokuser på den nederste overflade af flowcellen ved hjælp af en 642 nanometerlaser for at afbilde mikrotubuliene og en 488 nanometerlaser for at afbilde GFP-kinesinmotorerne. Optag billeder eller videoer af interesse. Billeder kan optages, så længe der er motilitet i flowcellen.I denne undersøgelse præsenteres et aktivt nanoskalasystem, som selv samler svagt bindende byggesten for at konstruere sit eget spor. Ved hjælp af tirf mikroskopi, gliding mikrotubuli er separat afbildet fra kinesin motorer. Mikrotubuli er synlige ved excitation med en 647 nanometerlaser.Og GFP kinesin er synlige, når ophidset med en 488 nanometer laser. Tiden mellem excitation og det røde og grønne lys var mindre end et sekund. Som det kan ses, svævende mikrotubuli ophobes kinesin motorer fra opløsning og deponere dem på overfladen.Kinesinmotorerne forbliver i kølvandet på mikrotubulerne i en kort periode, før de vender tilbage til opløsningen. Det er meget vigtigt at have den korrekte koncentration af reagenser i antifade af motilitet opløsning, ellers, foto blegning ville forårsage forsøget til at mislykkes. Denne teknik baner vejen for en mere effektiv anvendelse af proteinmotorer i nanoskala ingeniørsystemer.Således gør det muligt at designe og studere mere komplekse nanostrukturer.

Research

JoVE Journal

Engineering

Molecular Beam Mass Spectrometry With Tunable Vacuum Ultraviolet (VUV) Synchrotron Radiation

Molecular Beam Mass Spectrometry With Tunable Vacuum Ultraviolet VUV Synchrotron Radiation

Molekylær Beam massespektrometri Med Tunable Vacuum Ultraviolet (VUV) synkrotronstråling

Tunable soft ionization coupled to mass spectroscopy is a powerful method to investigate isolated molecules, complexes and clusters and their spectroscopy ...

Ultrahigh Density Array of Vertically Aligned Small-molecular Organic Nanowires on Arbitrary Substrates

Ultrahøj Density Array of lodretstillede Små-molekylære organiske nanotråde på vilkårlige Substrater

In  recent years &pi;-conjugated  organic semiconductors have emerged as the active material in a number of  diverse applications including large-area, ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Rumlig adskillelse af molekylære konformatorer og klynger

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Measurement and Analysis of Atomic Hydrogen and Diatomic Molecular AlO, C2, CN, and TiO Spectra Following Laser-induced Optical Breakdown

Measurement and Analysis of Atomic Hydrogen and Diatomic Molecular AlO, C2, CN, and TiO Spectra Following Laser-induced Optical Breakdown

Måling og analyse af Atomic Brint og diatomiske Molekylær AlO, C<sub&gt; 2.</sub&gt;, CN, og TiO Spectra flg. Laser-induceret Optisk Fordeling

In this work, we present time-resolved measurements of atomic and diatomic spectra following laser-induced optical breakdown. A typical LIBS arrangement ...

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Proton Transfer og proteinkonformation Dynamics i Lysfølsomme Proteiner af Time-løst Step-scan Fourier-transform infrarød spektroskopi

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Undersøgelse Single Molecule Vedhæftning af Atomic force spektroskopi

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Probing C84-embedded Si Substrate Using Scanning Probe Microscopy and Molecular Dynamics

Probing C84-embedded Si Substrate Using Scanning Probe Microscopy and Molecular Dynamics

sondering C<sub&gt; 84</sub&gt; -embedded Si Underlag Brug Scanning Probe Microscopy og Molecular Dynamics

This paper reports an array-designed C84-embedded Si substrate fabricated using a controlled self-assembly method in an ultra-high vacuum chamber. The ...

Quantitative Hardness Measurement by Instrumented AFM-indentation

Kvantitativ Hårdhed Måling af Instrumenteret AFM-indrykning

In this work, a combination of amplitude-modulated non-contact atomic force microscopy and atomic force spectroscopy is applied for instrumented hardness ...

Plasma-assisted Molecular Beam Epitaxy of N-polar InAlN-barrier High-electron-mobility Transistors

Plasma-assisteret Molecular Beam Epitaxy af N-polar InAlN-barriere High-elektron-mobilitet Transistorer

Plasma-assisted molecular beam epitaxy is well suited for the epitaxial growth of III-nitride thin films and heterostructures with smooth, abrupt ...

Preparation of Liquid Crystal Networks for Macroscopic Oscillatory Motion Induced by Light

Forberedelse af flydende krystal netværk for makroskopisk oscillerende bevægelse fremkaldt af lys

A strategy based on doped liquid crystalline networks is described to create mechanical self-sustained oscillations of plastic films under continuous ...