Name: assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins
Uploaded: 2019-01-26T14:45:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins at JoVE.com

De auteurs mijn dankbaarheid uitspreken voor financiële steun uit hoofde van NSF grant NSF-DMR-1807514. De auteurs bedanken G. vrijgezel en V. Vandelinder voor het verstrekken van het GFP-kinesin-eiwit. Dit werk werd uitgevoerd, ten dele, bij het Center for geïntegreerde nanotechnologieën, een Office van wetenschap gebruiker faciliteit geëxploiteerd voor de Office of Science van ons Department of Energy (DOE) door Los Alamos National Laboratory (contract neen. DE-AC52-06NA25396) en Sandia National Laboratories (con-darmkanaal no. 97 DE-AC04-94AL85000). De auteurs bedanken Dr. Jennifer Neff en AllVivo Vascular voor hun gift van PEG-PPG-PEG matiemaatschappij met NTA.

1. oplossing voorbereiding
Let op: Drie van de in dit protocol (tolueen, dimethyldichlorosilane en dithiothreitol) gebruikte reagentia zijn zeer giftig. Raadpleeg de relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Delen van dit protocol moeten bovendien worden uitgevoerd onder een hoger beschermingsniveau, veiligheidsbril en twee sets van beschermende handschoenen dragen, zoals aangegeven. Tenzij anders geadviseerd, kunnen de experimenten worden uitgevoerd op lab banken tijdens het gebruik van alle de passende persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en schoenen van gesloten-teen).
Opmerking: De concentraties van de ATP, kinesin en microtubuli die worden gebruikt in dit protocol kunnen worden aangepast gezien de behoeften van elk experiment. Echter, als gewijzigd, zorg ervoor dat de eindconcentraties van de andere reagentia hetzelfde als in bepaalde blijven hieronder. Alle experimenten werden uitgevoerd bij kamertemperatuur, (~ 25 ° C).
<ol><li>Voorbereiding van stamoplossingen Opmerking: Bereiden en aliquot de volgende oplossingen vooraf. Alle aliquots kunnen bereid worden bij kamertemperatuur (~ 25 ° C).<ol>
<li>
BRB80 buffer Opmerking: De buffer voor de meeste van de oplossingen die in dit protocol worden gebruikt is BRB80. BRB80 kan worden bereid in grote hoeveelheden en opgeslagen in een vriezer van-20 ° C.<ol>
<li>Los 24.2 g van piperazine-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (buizen) en 3.1 g van kaliumhydroxide (KOH) in 800 mL in gedeïoniseerd water om 800 mL 100 mM buizen. 100 mL 10 mM magnesiumchloride (MgCl2) en 100 mL 10 mM ethyleen glycol Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) te krijgen een eindvolume van 1 L. Raising pH 8 met kaliumhydroxide (KOH) kan helpen bij de ontbinding van de buizen en de EGTA toevoegen. Opmerking: De eindconcentraties van chemische stoffen in de buffer van de BRB80 zijn 80 mM buizen, 1 mM MgCl2en 1 mM EGTA.</li>
			<li>Breng de pH van de buffer 6.9 met behulp van KOH en zoutzuur (HCl).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ATP
		<ol>
<li>Bereid een 1 mL oplossing van 100 mM ATP in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer-80 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
GTP
		<ol>
<li>Bereid een 500 μL oplossing van 25 mM GTP in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 5 μl aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer-80 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
MgCl2
		<ol>
<li>Bereid een 1 mL oplossing van 100 mM MgCl2 in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Caseïne
		<ol>
<li>Weeg 1 g van droge caseïne en overbrengen naar een tube van 50 mL conische centrifuge. 35 mL BRB80 buffer aan de buis te ontbinden de caseïnepoeder toevoegen.</li>
			<li>Plaats de oplossing in een tumbler in een koude kamer te ontbinden 's nachts. De oplossing ziet er op dit punt, voor dik en viskeus is.</li>
			<li>Laat de buis rechtop in een koelkast 4 ° C te voorzien in een grote onopgeloste bosjes te regelen. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis.</li>
			<li>Draai de buis in een centrifuge op 1.000 x g tot pellet uit meer precipitaten. Nogmaals, het supernatant naar een nieuwe buis overbrengen.</li>
			<li>Herhaaldelijk Filtreer de oplossing met behulp van 0,2 micrometer (7 bar maximale druk) filters. De oplossing wordt dik, veel filters zal verstopt raken, dus Herhaal deze stap totdat het filter duidelijk is en unclogged.</li>
			<li>Bepaal de concentratie van de caseïne in de resulterende oplossing om met UV/Vis-spectrofotometrie, met behulp van caseïne van uitsterven coëfficiënt van 19 mM-1∙cm-1 op 280 nm20. Ervan uitgaande dat een moleculair gewicht van 23 kDa voor caseïne, Verdun de oplossing tot een concentratie van 20 mg∙mL-1 in BRB80.</li>
			<li>Pipetteer de oplossing in 20 μL aliquots en de aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
D-Glucose
		<ol>
<li>Bereid een 1 mL oplossing van 2 M D-glucose in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Glucose-oxidase
		<ol>
<li>Bereid een 1 mL oplossing van 20 mg∙mL-1 glucose-oxidase in BRB80. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Katalase
		<ol>
<li>Bereid een 1 mL oplossing van 0.8 mg∙mL-1 katalase in BRB80. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Dithiothreitol (DTT) Opmerking: Aangezien DTT iets vluchtige en giftige is, voer de volgende stappen uit onder een zuurkast.<ol>
<li>Bereid een 1 mL oplossing van 1 M DTT in ultrazuiver water verdund. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Paclitaxel
		<ol>
<li>Bereid een 1 mL oplossing van 1 mM paclitaxel verdund in DMSO. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Dimethylsulfoxide (DMSO) Opmerking: De DMSO gebruikt in deze experimenten is puur.<ol>
<li>Pipet 1 mL puur DMSO in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Creatine fosfaat
		<ol>
<li>Bereid een 1 mL oplossing van 0,2 M creatine fosfaat in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Creatine phosphokinase
		<ol>
<li>Bereid een 1 mL oplossing van 200 units· L-1 creatine phosphokinase in ultrazuiver water. Pipetteer de oplossing in 10 μL aliquots. De aliquots opslaan in een vriezer van-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Nikkel (II) sulfaat
		<ol>
<li>500 mL van een oplossing van 50 mM nikkel (II) sulfaat in ultrazuiver water voor te bereiden. Bewaar de oplossing op kamertemperatuur (~ 25 ° C).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Poly(Ethylene glycol)-blok-poly(propylene glycol)-blok-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG) oplossing
		<ol>
<li>Weeg 2 mg PEG-PPG-PEG (nummer gemiddeld molecuulgewicht: 14.600 g∙mol-1)-NTA poeder op het gewicht van papier. PEG-PPG-PEG-NTA is de triblock-copolymeer matiemaatschappij met een nitrilotriacetic zuur (NTA) groep. Verwijzen naar de Tabel van materialen voor meer informatie over de PEG-PPG-PEG-NTA.</li>
			<li>Breng het poeder in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. 1 mL van de stockoplossing van nikkel (II) sulfaat toevoegen aan de buis. Vortex tot poeder is opgelost en geen zichtbare bosjes blijven.</li>
			<li>Winkel voor maximaal een maand bij kamertemperatuur.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Voordat u begint een experiment
	<ol>
<li>Vul een emmer met ijs.</li>
		<li>Neem één monster uit elk van de 13 reagentia beschreven in de punten 1.1.1 tot en met 1.1.13 boven en voeg ze toe aan de emmer, dus houden ze op het ijs. Ontdooi elk van de reagentia vóór gebruik.</li>
	</ol></li>
	<li>Microtubulus voorbereiding Opmerking: Microtubuli waren polymeervorm van een 20 μg hoeveelheid kleurstof-geëtiketteerden gelyofiliseerd tubuline. De golflengte van de excitatie van de kleurstof is van 647 nm.<ol>
<li>
Voorbereiding van de microtubuli groei buffer
		<ol>
<li>Pipetteer 21,8 μL van BRB80 buffer in een klein (0,6 mL)-microcentrifuge buis. 1 μL van de stockoplossing van MgCl2 , 1 μL van de stockoplossing van GTP en 1.2 μL van de stockoplossing van DMSO toevoegen. Opmerking: De eindconcentraties van de reagentia in de buffer van de BRB80 zijn dus 4 mM MgCl2, 1 mM GTP en 5% (v/v) dimethylsulfoxide.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Microtubuli polymerisatie
		<ol>
<li>Voeg 6,25 μL van microtubulus groei buffer direct in een hoeveelheid van 20 μg van gelabelde gelyofiliseerd tubuline. Vortex het afgepipetteerde deel voor 5 s bij 30 rps.</li>
			<li>Koel het afgepipetteerde deel op het ijs gedurende 5 minuten vóór het incuberen bij 37 ° C gedurende 45 minuten en gaat u verder met sectie 1.3.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Microtubulus stabilisatie
		<ol>
<li>Voeg toe 5 μL van de oplossing aliquoted paclitaxel aan 490 μL van BRB80 buffer. Vortex de oplossing voor 10 s bij 30 rps.</li>
			<li>Zodra de 45 min van incubatie gedurende de microtubuli zijn up, toevoegen 5 μL van de gepolymeriseerde microtubulus-oplossing aan de BRB80/paclitaxel oplossing. Opmerking: Deze oplossing 100-fold verdunde, gestabiliseerd, microtubulus zal worden hierna MT100. Het kan tot maximaal 5 dagen worden gebruikt, en het kan worden verdund om te verkrijgen van de gewenste microtubulus-dichtheid voor elk experiment.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Motility oplossing
	<ol>
<li>
Enzymatische antifade, ATP regenereren systeem en ATP
		<ol>
<li>9.0 μL van de aliquoted caseïne-oplossing toevoegen aan 291 μL van BRB80 buffer.</li>
			<li>Als de gewenste concentratie van het ATP voor het experiment lager dan 1 mM, Pipetteer 83 μL van de BRB80/caseïne-oplossing in een nieuwe 0,6 mL microcentrifuge buis is. Anderszins, Pipetteer 85 μL van die oplossing in een nieuwe 0,6 mL microcentrifuge buis.</li>
			<li>Voeg 1 μL van D-glucose, 1 μL van glucose-oxidase, 1 μL van katalase en 1 μL van DTT aan die buis. Opmerking: Deze chemische stoffen vormen een enzymatische antifade cocktail21 die photobleaching verminderen door het verwijderen van zal opgeloste zuurstof en blussen reactieve radicalen. Dit vermindert photobleaching en microtubulus desintegratie, veroorzaakt door de verlichting van de excitatie tijdens fluorescentie22,23imaging.</li>
			<li>Experimenten waarin de ATP-concentratie wordt gekozen aanzienlijk lager is dan 1 mM, voegt toe de volgende reagentia aan de oplossing voor het maken van een ATP-regenereren-systeem: 1 μL van de oplossing aliquoted creatine fosfaat en 1 μL van de aliquoted creatine phosphokinase de oplossing.</li>
			<li>1 μL van de stockoplossing van ATP toevoegen aan de oplossing van de motiliteit. Flick of vortex het afgepipetteerde deel homogeen verdelen de chemische stoffen. Opmerking: De uiteindelijke concentratie van chemische stoffen in de oplossing zijn dus 10 μM paclitaxel, 0.5 mg·mL−1 caseïne, 20 mM D-glucose, 200 μg·mL−1 glucose oxidase, 8 μg·mL−1 katalase, dithiothreitol van 10 mM, 2 mM creatine fosfaat (als toegevoegd), 2 units· L−1 creatine phosphokinase (als toegevoegd), en 1 mM ATP. Deze oplossing zal worden hierna te noemen de motiliteit oplossing.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kinesin Opmerking: De voorraad kinesin-oplossing gebruikt bij deze experimenten is voorbereid door G. vrijgezel in het midden voor geïntegreerde nanotechnologieën op Sandia National Laboratories en beschikbaar gesteld onder een gebruikersovereenkomst (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). de buffer gebruikt hier bestaat uit 40 mM imidazool, 300 mM NaCl, 0,76 g· L-1 EGTA, 37.2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 sacharose, 0,2 mM TCEP en 50 μM Mg-ATP. Voor deze serie van experimenten, werd de structuur van de kinesin van de rkin430eGFP gebruikt. Dit is een kinesin bestaande uit de eerste 430 aminozuren van rat kinesin zware ketting gesmolten eGFP en een C-terminal zijn-tag op de staart domein24. Het kwam tot uitdrukking in Escherichia coli en gezuiverd met behulp van een Ni−NTA kolom. De concentratie van de stockoplossing GFP-kinesin was 1.8 ± 0,3 μM zoals bepaald door UV/Vis-spectrofotometrie, met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven voor GFP van 55 mM-1•cm-1 op 489 nm25, en rekening houdend met die kinesin is een dimeer.<ol>
<li>Bepalen de gewenste kinesin concentratie of oppervlak dichtheid voor het experiment. Deze concentratie is voor typische testen, 20 nM. Als de concentratie van de kinesin moet worden verdund moet meer dan een awreken, het verdund in een oplossing van BRB80 dat 0,5 mg·mL-1 voor caseïne bevat.</li>
			<li>Voeg 1 µL van kinesin oplossing aan de motiliteit oplossing om een eindconcentratie van ongeveer 20 nM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Microtubuli
		<ol>
<li>Voeg toe 10 μL van de MT100 oplossing bereid in punt 1.3 tot de oplossing van de motiliteit. Opmerking: Deze beweeglijkheid oplossing kan worden gebruikt voor maximaal 3 uur. Na die tijd verliest het antifade systeem zijn doeltreffendheid aangezien de glucose in de oplossing is uitgeput door de enzymatische reactie.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. monteren van de stroom-cellen
<ol><li>
Wassen van de coverslips
	<ol>
<li>Voor stroom cellen, gebruikt u een grote dekglaasje aan (dimensie: 60 x 25 mm) en een kleine (afmetingen: 22 x 22 mm)19.</li>
		<li>Spoel alle coverslips tweemaal met ethanol en tweemaal met ultrazuiver water. Bewerk de ultrasone trillingen ten de coverslips in ultrazuiver water voor 5 min. ze drogen in een oven bij een temperatuur van 50-75 ° C.</li>
		<li>Met behulp van een UV/ozon schoner (Zie Tabel van materialen en aanwijzingen van de fabrikant), behandeling van één zijde van elke dekglaasje aan voor 15 min. deze stap kunt uitvoeren, bij kamertemperatuur (~ 25 ° C) en in normale atmosferische toestand (druk van 1 atm).</li>
		<li>Zorgvuldig zet elke dekglaasje aan naar de andere kant (met pincet) en UV/ozon behandelen die kant ook.</li>
		<li>Bewerk ultrasone trillingen ten de coverslips in ultrazuiver water opnieuw gedurende 5 minuten vóór het drogen ze opnieuw in de oven bij een temperatuur van 50-75 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Behandeling van de coverslips om te schakelen van PEG-PPG-PEG coating Opmerking: De dimethyldichlorosilane en de tolueen gebruikt in dit deel van het protocol wordt zeer giftig, volgt onder een zuurkast, terwijl de volgende voorzorgsmaatregelen nemen: het dragen van twee sets van beschermende handschoenen en een lange mouwen shirt onder hun lab vacht. Plooi de randen van de handschoenen in de mouwen van het shirt zodat geen huid van de onderarmen rechtstreeks aan de chemische stoffen die in het geval van een morsen blootstaat. Beschermende bril.<ol>
<li>Verdun 25 mL van pure dimethyldichlorosilane in 475 mL tolueen. Elke dekglaasje aan in de dimethyldichlorosilane en tolueen oplossing onderdompelen gedurende 15 seconden.</li>
		<li>Wassen de coverslips tweemaal in tolueen en drie keer in methanol. Droog de coverslips met behulp van hydrofoor stikstof.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage van coverslips in cellen van de stroom
	<ol>
<li>Zodra de coverslips droog zijn, snij een 2 x 2,5 cm stukje dubbelzijdig tape verticaal in twee 1 x 2,5 cm strepen.</li>
		<li>De grote dekglaasje aan zetten de Wisser van een delicate taak en plak de tape strepen in de lengte langs de randen van het dekglaasje aan een 1 x 2,5 cm ruimte tussen de stukjes tape te creëren.</li>
		<li>Plak de klein dekglaasje aan op de top van de strepen van de band tot het einde van de vergadering van de cel van de stroom.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. stroomt de oplossingen in een flow-cel
<ol><li>Stroom ongeveer 20 μL van de PEG-PPG-PEG-oplossing in de cel geassembleerde stroom. Het volume dat is gevlogen in de cel moet groot genoeg zijn om de kamer te vullen. In de volgende stappen gebruiken hetzelfde volume als de oplossingen uit te wisselen.</li>
	<li>Zorgen voor de oplossing van de PEG-PPG-PEG te vangen op het oppervlak voor 5 minuten. De PEG-PPG-PEG-oplossing met BRB80 buffer 3 keer langs stroomt de buffer in uitwisselen. De motiliteit oplossing uitmonden in de cel van de stroom.</li>
	<li>Het zegel van de randen van de cel van de stroom met vet om te voorkomen dat de verdamping, als de geplande experiment langer dan een uur is. Opmerking: De stroom-cel is nu klaar om te worden beeld.</li>
</ol>4. imaging een stroom-cel
<ol><li>Het uitvoeren van de beeldvorming die met behulp van een doelstelling-type totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) setup voor zowel de microtubuli, en de motoren van de kinesin (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Hier, we gebruikten een microscoop met een 100 x / 1,49 de lens van de doelstelling van het numerieke opening, met behulp van twee lasers, één met een golflengte van 642 nm en een maximaal vermogen van 140 mW, en een ander met een golflengte van 488 nm en een maximumvermogen van 150 mW.</li>
	<li>Breng een druppel van immersie-olie op het doel.</li>
	<li>Plaats van de cel van de stroom op het platform van de Microscoop en brengen de doelstelling tot er contact tussen de olie op het doel en de stroom-cel is.</li>
	<li>Gebruik van de Microscoop vergrendeling cover systeem voor het blokkeren van alle laserlicht ontsnappen.</li>
	<li>Zet de laser en zich richten op het onderste oppervlak van de cel van de stroom. De microtubuli fluorescently zijn geëtiketteerd en opgewonden bij een golflengte van 647 nm. Zij zal worden beeld met behulp van een 642 nm laser terwijl een 488 nm laser wordt gebruikt voor het GFP-kinesin motoren.</li>
	<li>Het opnemen van de beelden of video's van belang. De kracht van de laser is meestal ongeveer 30 mW en een belichtingstijd van 50 ms voor zowel laser kanalen. Beelden kunnen opgenomen worden voor zolang er beweeglijkheid in de cel van de stroom. Opmerking: De laser verlichting is schadelijk voor het blote oog en kan onherstelbare schade veroorzaken. Gelieve ervoor te zorgen dat de verlichte gebied volledig met een ondoorzichtige deksel bedekt is.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Force-Generating+Protein,+Kinesin,+Involved+in+Microtubule-Based+Motility.">Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility.</a> Cell. 42, 39-50 (1985).</li><li>Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Follows+the+Microtubule's+Protofilament+Axis.">Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis.</a> Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).</li><li>Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+shuttles:+directed+motion+of+microtubules+along+nanoscale+kinesin+tracks.">Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks.</a> Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).</li><li>Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+bundle+formation+driven+by+ATP:+the+effect+of+concentrations+of+kinesin,+streptavidin+and+microtubules.">Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules.</a> Nanotechnology. 21, 145603 (2010).</li><li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+Expressed+in+Insect+Cells+Improves+Microtubule+in+Vitro+Gliding+Performance,+Long-Term+Stability+and+Guiding+Efficiency+in+Nanostructures.">Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).</li><li>Whitesides, G. M., Grzybowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+at+all+scales.">Self-assembly at all scales.</a> Science. 295, 2418-2421 (2002).</li><li>Ringler, P., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+proteins+into+designed+networks.">Self-assembly of proteins into designed networks.</a> Science. 302, 106-109 (2003).</li><li>Boncheva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+self-assembly+of+three-dimensional+surfaces+from+planar+sheets.">Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).</li><li>England, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissipative+adaptation+in+driven+self-assembly.">Dissipative adaptation in driven self-assembly.</a> Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).</li><li>Fialkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+Implementations+of+Dissipative+(Dynamic)+Self-Assembly.">Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).</li><li>Boncheva, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+systems+having+a+design+stimulated+by+the+vertebrate+spine.">Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).</li><li>Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+self-assembly+in+a+thousand-robot+swarm.">Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm.</a> Science. 345, 795-799 (2014).</li><li>Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+structural+composites+with+electromagnetic+functionality.">Self-healing structural composites with electromagnetic functionality.</a> Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).</li><li>Ghosh, S. K., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Self-Healing Materials. , 1-28 (2009).</li><li>Burnworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optically+healable+supramolecular+polymers.">Optically healable supramolecular polymers.</a> Nature. 472, (2011).</li><li>Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-Based+Nanomaterials:+Exploiting+Nature's+Dynamic+Biopolymers.">Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).</li><li>Gao, Y. W., Lei, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+scale+effects+on+the+mechanical+behaviors+of+protein+microtubules+based+on+the+nonlocal+elasticity+theory.">Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).</li><li>Lam, A. T. -. C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibly+Bound+Kinesin-1+Motor+Proteins+Propelling+Microtubules+Demonstrate+Dynamic+Recruitment+of+Active+Building+Blocks.">Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks.</a> Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).</li><li>Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L., Yada, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins in Food Processing (Second Edition). , 49-92 (2018).</li><li>Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regenerating+system+for+studies+of+phosphoryl+transfer+from+ATP.">A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP.</a> Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).</li><li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry.">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit werk presenteren wij een actieve nanoschaal systeem welke zelf zwak-bindende bouwstenen monteert voor de bouw van een eigen nummer. Zoals aangegeven in Figuur 1, glijden van microtubuli accumuleren kinesin motoren van oplossing en stort ze op het oppervlak. De motoren van de kinesin blijven in de nasleep van de microtubuli voor een korte periode van tijd voordat hij terugkeerde naar oplossing. Dus, in dit experiment, kinesin motoren alternatieve tussen 3 bepaalt:
(1) een microtubulus single-gebonden staat: dit is wanneer een kinesin eerst aan een microtubulus bindt. Het bestaat in evenwicht met staat (2).
(2) een dubbel-gebonden staat: in dit geval, een microtubulus single-gebonden kinesin ook bindt aan de oppervlakte via haar zijn-tag. Deze dubbel-gebonden staat voorziet microtubulus voortstuwing.
(3) een eenheidsstaat oppervlak-gebonden: een dubbel-gebonden kinesin die uit het einde van de microtubuli heeft gelopen en heeft nog niet uit het oppervlak gedesorbeerde is in deze toestand. Deze motoren kunnen worden waargenomen in Figuur 1 (gecombineerd en groene kanalen): ze breiden achter de staart van de microtubuli voor verschillende micrometers en vormen zijn afnemende spoor.
De meest kritische stap van dit protocol is de vorming van de hydrophobic oppervlakte op de dia. Niet alleen maakt het gebruik van gevaarlijke chemische stoffen, maar het maakt het ook mogelijk de PEG-PPG-PEG matiemaatschappij met de groep van de NTA jas van het oppervlak, waarmee vervolgens de kinesin omkeerbaar binden aan het oppervlak. Een andere belangrijke stap is de stroom cel afdichten met vet. Dit zorgt voor langdurige imaging zonder de vloeistof in de verdamping van de cel van de stroom.
De primaire wijzigingen aan deze techniek bestaan uit microtubulus concentratie, kinesin concentratie en ATP concentratie wijzigen. Microtubulus concentratie wijzigt, zal het aantal microtubuli glijden over het oppervlak. Kinesin concentratie wijzigt, zal het aantal kinesin moleculen die zich aan de microtubuli binden kan. Echter, verhoging van de concentratie van de kinesin boven de bedragen die al zijn gedefinieerd in dit experiment zou kunnen vergroten achtergrond fluorescentie, waardoor het moeilijker om te zien de kinesin paden achtergelaten zweefvliegen microtubuli. Ondertussen, verlaging van de concentraties van de ATP beneden 10 µM zal leiden tot aanzienlijke afname microtubulus zweefvliegen snelheid. Als dit effect gewenst is, is het noodzakelijk gebruik te maken van een ATP regenereren systeem bestaande uit creatine fosfatase en phosphokinase.
Een mogelijke beperking van deze techniek is dat, als gevolg van de grote actieve kinesin inhoud van het systeem, de ATP kan snel worden verbruikt, en experimenten minder dan een uur in bepaalde voorwaarden duren kunnen. Dit zou bijvoorbeeld het geval als een tweeledig hogere kinesin concentratie en vijfvoudige hogere microtubulus concentratie dan wat wordt gepresenteerd in dit protocol gebruikt.
In onze eerdere werk18, studeerde we de ruimtelijke verdeling van kinesin motoren langs de microtubuli, waaruit blijkt dat zweefvliegen microtubuli accumuleren kinesin motoren van oplossing, resulterend in een verhoging van de dichtheid van motoren langs de lengte van de Microtubulus. We vonden ook dat de microtubuli glijden stabiliteit aangetoond een niet-lineaire afhankelijkheid van de oplossing kinesin concentratie en microtubulus-snelheid.
Het gepresenteerde protocol effent de weg voor een efficiënter gebruik van eiwit motors in nanoschaal engineered systemen en voor verder onderzoek in het ontwerp van actieve nanosystems die in dynamisch evenwicht. Bovendien, de dynamische aard van dit systeem maakt het mogelijk om te dienen als een modelsysteem voor het bestuderen van zelfhelend en dynamische vervanging van moleculaire componenten, deel van de kloof tussen ontwikkelde en natuurlijke structuren te sluiten.

Het bestuur van het gedrag van actieve nanosystems interacties hebben altijd gekenmerkt door langlevende, bijna onomkeerbaar obligaties1,2,3,4,5,6 ,7,8. Een goed bestudeerde voorbeeld hiervan is de microtubuli-kinesin systeem, waar glijden microtubuli worden aangedreven door onherroepelijk oppervlak-gebonden kinesin motoren1,2,3,4, 5. Systemen waarin de componenten omkeerbaar zijn verbonden met elkaar geweest studeerde theoretisch9,10 en verwezenlijkt de situering11,12, maar schalen van deze systemen tot de nanoschaal is uitdagend. Een van de belangrijkste redenen hiervoor is dat breken en hervormen van de banden tussen de onderdelen vaak vereist een grote verandering in de milieuomstandigheden. Hoewel dergelijke wijzigingen zijn doorgevoerd in de afgelopen13,14,15, zou zij vertrouwen op het systeem zelf te wijzigen in plaats van aan te passen aan zijn omgeving. Ontwerpen van moleculaire schaal systemen waarin onderdelen voortdurend verzamelen en reorganiseren in structuren zonder verstoring van het algemene klimaat waarin de experimenten plaatsvinden zal de deur openzetten voor de verkenning van een breed scala van dynamische gedrag 16 , 17.
Hier, we beschrijven en demonstreren van het gedetailleerd protocol voor het maken van een dynamisch montage en demontage van systeem werking op nanoschaal. Het systeem en de algemene werking geweest geïntroduceerde eerdere18: microtubulus filamenten worden aangedreven door sporen van omkeerbaar oppervlak-gebonden kinesin-1 motoren. Deze kinesin motor eiwitten worden gerekruteerd uit de oplossing helpen voortbewegen microtubuli vooruit, voordat de desorbing weer kort daarna. Eenmaal terug in oplossing, kunnen zij opnieuw voor het voortbewegen van een nieuwe microtubulus worden aangeworven. In de afgelopen13,14,verplicht15, de breaking en hervorming van obligaties milieu wijzigingen; daarentegen is het milieu van onze cel stroom blijft ongewijzigd, terwijl de kinesin motoren met het oppervlak interageren.
Dit protocol zal helpen interesse onderzoekers (1) visualiseren van alle stappen van het protocol, en (2) bijstaan bij het oplossen van dit soort assay. Het is afgeleid van de procedures die in Howard et al. 199319beschreven.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX 488-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>642 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX&#160;642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlorodimethylsilane solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40140-25ML</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34869-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TI</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP rkin430</td>
			<td>Provided by George Bachand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine Triphosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Sigma Pharmaceuticals</td>
			<td>8089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>656895-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1912-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F108-NTA</td>
			<td>Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular</td>
			<td></td>
			<td>PEG-PPG-PEG-NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-108</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542342-250G</td>
			<td>PEG-PPG-PEG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T324</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte647-labeled</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Ozone Procleaner</td>
			<td>BioForce Nanosciences</td>
			<td>PC440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;Puradisc syringe filters</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA67840402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS Camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>sCMOS 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins

Dit protocol wordt beschreven hoe u van shuttles op moleculaire kinesin-aangedreven met een zwak en omkeerbare gehechtheid van de kinesins aan het oppervlak. In tegenstelling tot eerdere protocollen, in dit systeem, microtubuli werven kinesin motor proteïnen uit oplossing en leg ze op een oppervlak. De kinesins, op zijn beurt, vergemakkelijkt het glijden van de microtubuli langs het oppervlak vóór de desorbing terug in de bulk-oplossing, dus wordt beschikbaar opnieuw worden aangeworven. Deze continue montage en demontage leidt tot opvallend dynamisch gedrag in het systeem, zoals de totstandkoming van tijdelijke kinesin routes door het glijden van de microtubuli.
Verschillende experimentele methoden worden beschreven in dit experiment: UV-Vis spectrofotometrie wordt gebruikt voor het bepalen van de concentratie van stamoplossingen van reagentia, coverslips zullen eerst ozon en ultraviolet (UV) behandeld en vervolgens gesilaneerde voordat wordt gemonteerd in de cellen van de stroom en totale interne reflectie fluorescentie worden microscopie (TIRF) gebruikt voor het gelijktijdig beeld kinesin motoren en door samensmelting van filamenten microtubulus.

In deze experimenten, gebruikten we een 1.000 keer verdunning van de microtubuli bereid in punt 1.3.2. De concentratie van de kinesin was 20 nM, en de ATP-concentratie is 1 mM. Imaging werd uitgevoerd met behulp van microscopie van TIRF. Zweefvliegen microtubuli werden afzonderlijk beeld van de kinesin motoren: microtubuli waren zichtbaar na excitatie met een 647 nm laser (Figuur 1, rood), en het GFP-kinesin was zichtbaar wanneer opgewekt met een 488 nm laser (Figuur 1, groen). De tijd tussen excitatie met het rood en groen licht was minder dan 1 s. De tijd tussen frames was dat 10 s. microtubuli weergegeven stabiele glijden. De gemiddelde microtubulus zweefvliegen snelheid was ongeveer 800 nm/s. De oppervlakte microtubulus-dichtheid was 400 mm-2. Sporen van kinesin (groen) bleek verder reiken dan het afsluitende einde van de microtubuli (rood) voor verschillende micrometers.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59068/59068fig1.jpg"> Figuur 1: zweefvliegen microtubuli aangedreven door motoren van zwak oppervlak-gebonden kinesin. Als microtubuli vooruit, accumuleren ze kinesin motoren van de oplossing. Deze motoren afwisselend twee staten: single-gebonden aan de microtubuli, en dubbel-gebonden aan zowel de microtubulus en het oppervlak. Wanneer een dubbel gebonden motor het einde van de microtubuli bereikt, de motor is achtergelaten en langzaam desorbs van het oppervlak met een weg tarief van ongeveer 0,1 s-1. Dientengevolge, blijven routes van kinesin motoren achter de microtubuli. Bovenste rij: rood (microtubulus) kanaal. Middelste rij: groen (kinesin) kanaal. Onderste rij: combinatie van rood (microtubulus) en groene (GFP-kinesin) kanaal. Schaal bar: 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59068/59068fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins at JoVE.com

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

Monteren van moleculaire Shuttles Powered by omkeerbaar aangesloten Kinesins

We presenteren een protocol om te bouwen van moleculaire/naar vliegveld, waar kinesin oppervlak-in acht genomen motor eiwitten voortbewegen kleurstof-gelabelde microtubuli. Zwakke interacties van de kinesins met het oppervlak kunnen hun omkeerbare gehechtheid aan het. Dit creëert een nanoschaal-systeem dat dynamische montage en demontage van de onderdelen met behoud van zijn functionaliteit vertoont.

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Dit protocol is belangrijk omdat het de deur opent voor verder onderzoek in het ontwerp van biologische systemen op nanoschaal die in dynamisch evenwicht verkeren. Deze techniek vult een deel van de kloof tussen gemanipuleerde en natuurlijke structuren, omdat het de studie van wat we zouden kunnen noemen, zelfherstellen'of de dynamische vervanging van moleculaire componenten mogelijk maakt. Het belangrijkste advies voor het uitproberen van deze techniek voor de eerste keer is ervoor te zorgen dat de experimentator alle veiligheidsprotocollen volgt.Bereid eerst de voorraadoplossingen voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Pipette 21.8 microliters van BRB80 Buffer in een kleine microcentrifuge buis. Voeg 1 microliter van de magnesiumchloridevoorraadoplossing, 1 microliter van de GTP-voorraadoplossing en 1,2 microliter van de DMSO-voorraadoplossing toe om de groeibuffer van microtubuli klaar te maken.Om te beginnen met microtubuli polymerisatie, voeg 6,25 microliter microliter microtubulier groeibuffer direct in een 20 microgram aliquot van lyophilized tubulin;gelabeld te worden opgewekt op 647 nanometer. Vortex op 40 RPS gedurende 5 seconden. Koel de aliquot 5 minuten af op ijs.Dan, incubeer op 37 graden Celsius gedurende 45 minuten. Om te beginnen met microtubuli stabilisatie, voeg 5 microliters van de aliquoted paclitaxel oplossing tot 490 microliters van BRB80 buffer. Vortex de oplossing op 30 RPS voor 10 seconden.Zodra de 45 minuten van incubatie voor de microtubuli is, voeg 5 microliter van die oplossing aan de BRB80, en paclitaxel mengsel, om de MT100 oplossing te creëren. Voeg eerst 9,0 microliter van de aliquoted casein-oplossing toe aan 291 microliters brb80-buffer. Pipette 83 microliter van de BRB80 caseïneoplossing in een nieuwe 6 milliliter microcentrifugebuis.Voeg 1 microliter D-glucose, glucoseoxidase, catalase, DTT, creatinefosfaat en fosphokinase toe. Voeg vervolgens 1 microliter van de stock ATP-oplossing toe aan de beweeglijkheidsoplossing. Flick, of vortex de aliquot om homogeen te distribueren van de chemische stoffen.Voeg vervolgens 1 microliter voorbereide kinesineoplossing toe aan de beweeglijkheidsoplossing, zodat de uiteindelijke concentratie 20 nanomolar is. Voeg 10 microliter van de MT100-oplossing toe aan de beweeglijkheidsoplossing. Gebruik voor stroomcellen zowel een grote coverslip als een kleine coverslip.Spoel alle covers twee maal met ethanol en twee maal met ultrazuiver water. Sonicate de gewassen coverslips in ultrazuiver water gedurende 5 minuten. Droog vervolgens de coverslips in een oven bij een temperatuur tussen 50 en 75 graden Celsius.Gebruik een UV-ozonreiniger om één kant van elke afdekking gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en in normale atmosferische omstandigheden te behandelen. Met behulp van een pincet, flip elke coverslip en gebruik UV-ozon om de onbehandelde kant te behandelen ook. Soniceer de behandelde coverslips gedurende 5 minuten in ultrazuiver water.Droog ze vervolgens in een oven op een temperatuur tussen de 50 en 75 graden Celsius. Trek vervolgens beschermende kleding aan zoals beschreven in het tekstprotocol. Dompel elke coverslip 15 seconden onder in een zoutoplossing.Was de covers twee maal in tolueen en drie keer in methanol. Gebruik onder druk genomen stikstof om de coverslips te drogen. Zodra de coverslips droog zijn, snijd een stuk van dubbelzijdige tape die is 2 centimeter door 2,5 centimeter.Snijd dit stuk verticaal doormidden in twee stroken van 1 centimeter bij 2,5 centimeter. Leg de grote coverslip op een delicate taakwisser en plak de tape strips aan, lengte-wijs langs de randen om een 1 centimeter bij 2,5 centimeter gebied tussen de stukjes tape te creëren. Plak de kleine coverslip op de tape strips om de flow cell assemblage af te maken.Eerst stroom ongeveer 20 microliter van de PEG-PPG-PEG-oplossing in de geassembleerde stroomcel. Laat de oplossing 5 minuten op het oppervlak absorberen en wissel deze oplossing vervolgens drie keer uit met 20 microliters BRB80-buffer door de buffer naar binnen te stromen. Stroom 20 microliters van de beweeglijkheidsoplossing in de stroomcel.Sluit hierna de randen van de stroomcel af met vet om verdamping te voorkomen als het geplande experiment langer dan een uur duurt. Voer de beeldvorming uit met behulp van een objectieve-type totale interne florescentiemicroscopie. Plaats een druppel onderdompelingsolie op het doel.Plaats vervolgens de stroomcel op het microscoopplatform. En breng het doel tot er contact is tussen de olie op het doel en de stroomcel. Gebruik het interlock coversysteem van de microscoop om te voorkomen dat al het laserlicht ontsnapt.Schakel vervolgens de laser in en focus op het onderste oppervlak van de stroomcel met behulp van een laser van 642 nanometer om de microtubuli in beeld te brengen, en een laser van 488 nanometer om de GFP-kinesinmotoren in beeld te brengen. Neem de afbeeldingen of video's van belang. Beelden kunnen worden opgenomen zolang er beweeglijkheid in de stroomcel.In deze studie wordt een actief nanoschaalsysteem gepresenteerd, dat zelf zwak bindende bouwstenen assembleert om een eigen spoor te bouwen. Met behulp van tirf microscopie, glijdende microtubuli worden afzonderlijk afgebeeld van de kinesine motoren. Microtubuli zijn zichtbaar bij excitatie met een laser van 647 nanometer.En de GFP kinesin zijn zichtbaar wanneer enthousiast met een 488 nanometer laser. De tijd tussen opwinding en het rode en groene licht was minder dan een seconde. Zoals te zien is, zweefvliegen microtubuli accumuleren kinesine motoren van oplossing en deponeren ze op het oppervlak.De kinesin motoren blijven in het kielzog van de microtubuli voor een korte periode van tijd alvorens terug te keren naar oplossing. Het is zeer belangrijk om de juiste concentratie van reagentia in de antifade van de beweeglijkheidsoplossing te hebben, anders zou het bleken van foto's ervoor zorgen dat het experiment mislukt. Deze techniek maakt de weg vrij voor een efficiënter gebruik van eiwitmotoren in nanoschaalingeniesystemen.Dus, waardoor het ontwerp en de studie van meer complexe nanostructuren.

Research

JoVE Journal

Engineering

Molecular Beam Mass Spectrometry With Tunable Vacuum Ultraviolet (VUV) Synchrotron Radiation

Molecular Beam Mass Spectrometry With Tunable Vacuum Ultraviolet VUV Synchrotron Radiation

Moleculaire Beam massaspectrometrie met afstelbare Vacuum Ultraviolet (VUV) Synchrotron Radiation

Tunable soft ionization coupled to mass spectroscopy is a powerful method to investigate isolated molecules, complexes and clusters and their spectroscopy ...

Ultrahigh Density Array of Vertically Aligned Small-molecular Organic Nanowires on Arbitrary Substrates

Ultrahoge dichtheid Array of verticaal uitgelijnd klein-moleculaire biologische Nanodraden inzake willekeurige Substrates

In  recent years &pi;-conjugated  organic semiconductors have emerged as the active material in a number of  diverse applications including large-area, ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

Ruimtelijke scheiding van moleculaire conformers en clusters

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Measurement and Analysis of Atomic Hydrogen and Diatomic Molecular AlO, C2, CN, and TiO Spectra Following Laser-induced Optical Breakdown

Measurement and Analysis of Atomic Hydrogen and Diatomic Molecular AlO, C2, CN, and TiO Spectra Following Laser-induced Optical Breakdown

Meting en analyse van atomair waterstof en Diatomic Moleculaire AlO, C<sub&gt; 2</sub&gt;, CN, en TiO Spectra Following Laser-induced Optische Breakdown

In this work, we present time-resolved measurements of atomic and diatomic spectra following laser-induced optical breakdown. A typical LIBS arrangement ...

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

Proton Transfer en eiwitconformatie Dynamiek in lichtgevoelige eiwitten door Tijdsgeresolveerde Step-scan Fourier-Transform Infrared Spectroscopy

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Probing C84-embedded Si Substrate Using Scanning Probe Microscopy and Molecular Dynamics

Probing C84-embedded Si Substrate Using Scanning Probe Microscopy and Molecular Dynamics

probing C<sub&gt; 84</sub&gt; Ingebedde Si-substraat met behulp van Scanning Probe Microscopy and Molecular Dynamics

This paper reports an array-designed C84-embedded Si substrate fabricated using a controlled self-assembly method in an ultra-high vacuum chamber. The ...

Quantitative Hardness Measurement by Instrumented AFM-indentation

Kwantitatieve Hardheid Meting door Instrumented AFM-inspringen

In this work, a combination of amplitude-modulated non-contact atomic force microscopy and atomic force spectroscopy is applied for instrumented hardness ...

Plasma-assisted Molecular Beam Epitaxy of N-polar InAlN-barrier High-electron-mobility Transistors

-Plasma ondersteunde Moleculaire bundel epitaxie van N-polaire InAlN-barrière High-elektron-mobiliteit Transistors

Plasma-assisted molecular beam epitaxy is well suited for the epitaxial growth of III-nitride thin films and heterostructures with smooth, abrupt ...

Preparation of Liquid Crystal Networks for Macroscopic Oscillatory Motion Induced by Light

Voorbereiding van vloeibare kristallen netwerken macroscopische oscillerende beweging door licht geïnduceerde

A strategy based on doped liquid crystalline networks is described to create mechanical self-sustained oscillations of plastic films under continuous ...