Name: assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins
Uploaded: 2019-01-26T14:45:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins at JoVE.com

המחברים להכיר בהכרת תודה תמיכה כספית תחת גרנט NSF NSF-DMR 1807514. המחברים תודה Bachand ג Vandelinder (פ') למתן חלבון קינזין GFP. עבודה זו בוצעה, בין השאר, במרכז ננוטכנולוגיה משולב, Office של מדע המשתמש מתקן מופעל עבור Office לנו מחלקת האנרגיה (DOE) של המדע על ידי המעבדה הלאומית לוס אלמוס (חוזה לא. DE-AC52-06NA25396), מעבדות סנדיה הלאומית (קון-בדרכי מס 97 דה-AC04-94AL85000). המחברים תודה ד ר ג'ניפר נף, AllVivo עילאיים שלהם מתנה של פג-PPG-יתד functionalized עם נ. ת.

<ol>
	<li>Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Force-Generating+Protein,+Kinesin,+Involved+in+Microtubule-Based+Motility.">Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility.</a> Cell. 42, 39-50 (1985).</li><li>Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Follows+the+Microtubule's+Protofilament+Axis.">Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis.</a> Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).</li><li>Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+shuttles:+directed+motion+of+microtubules+along+nanoscale+kinesin+tracks.">Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks.</a> Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).</li><li>Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+bundle+formation+driven+by+ATP:+the+effect+of+concentrations+of+kinesin,+streptavidin+and+microtubules.">Microtubule bundle formation driven by ATP: the effect of concentrations of kinesin, streptavidin and microtubules.</a> Nanotechnology. 21, 145603 (2010).</li><li>Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+Expressed+in+Insect+Cells+Improves+Microtubule+in+Vitro+Gliding+Performance,+Long-Term+Stability+and+Guiding+Efficiency+in+Nanostructures.">Kinesin-1 Expressed in Insect Cells Improves Microtubule in Vitro Gliding Performance, Long-Term Stability and Guiding Efficiency in Nanostructures.</a> IEEE Transactions on Nanobioscience. 15, 62-69 (2016).</li><li>Whitesides, G. M., Grzybowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+at+all+scales.">Self-assembly at all scales.</a> Science. 295, 2418-2421 (2002).</li><li>Ringler, P., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+proteins+into+designed+networks.">Self-assembly of proteins into designed networks.</a> Science. 302, 106-109 (2003).</li><li>Boncheva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+self-assembly+of+three-dimensional+surfaces+from+planar+sheets.">Magnetic self-assembly of three-dimensional surfaces from planar sheets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 3924-3929 (2005).</li><li>England, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissipative+adaptation+in+driven+self-assembly.">Dissipative adaptation in driven self-assembly.</a> Nature Nanotechnology. 10, 919 (2015).</li><li>Fialkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+Implementations+of+Dissipative+(Dynamic)+Self-Assembly.">Principles and Implementations of Dissipative (Dynamic) Self-Assembly.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110, 2482-2496 (2006).</li><li>Boncheva, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+systems+having+a+design+stimulated+by+the+vertebrate+spine.">Self-healing systems having a design stimulated by the vertebrate spine.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 42, 2644-2647 (2003).</li><li>Rubenstein, M., Cornejo, A., Nagpal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+self-assembly+in+a+thousand-robot+swarm.">Programmable self-assembly in a thousand-robot swarm.</a> Science. 345, 795-799 (2014).</li><li>Plaisted, T. A., Vakil Amirkhizi, A., Arbelaez, D., Nemat-Nasser, S. C., Nemat-Nasser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+structural+composites+with+electromagnetic+functionality.">Self-healing structural composites with electromagnetic functionality.</a> Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers. 5054, 372-381 (2003).</li><li>Ghosh, S. K., Ghosh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Self-Healing Materials. , 1-28 (2009).</li><li>Burnworth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optically+healable+supramolecular+polymers.">Optically healable supramolecular polymers.</a> Nature. 472, (2011).</li><li>Bachand, G. D., Spoerke, E. D., Stevens, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-Based+Nanomaterials:+Exploiting+Nature's+Dynamic+Biopolymers.">Microtubule-Based Nanomaterials: Exploiting Nature's Dynamic Biopolymers.</a> Biotechnology and Bioengineering. 112, 1065-1073 (2015).</li><li>Gao, Y. W., Lei, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+scale+effects+on+the+mechanical+behaviors+of+protein+microtubules+based+on+the+nonlocal+elasticity+theory.">Small scale effects on the mechanical behaviors of protein microtubules based on the nonlocal elasticity theory.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, 467-471 (2009).</li><li>Lam, A. T. -. C., Tsitkov, S., Zhang, Y., Hess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibly+Bound+Kinesin-1+Motor+Proteins+Propelling+Microtubules+Demonstrate+Dynamic+Recruitment+of+Active+Building+Blocks.">Reversibly Bound Kinesin-1 Motor Proteins Propelling Microtubules Demonstrate Dynamic Recruitment of Active Building Blocks.</a> Nano Letters. 18, 1530-1534 (2018).</li><li>Howard, J., Hunt, A. J., Baek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+microtubule+movement+driven+by+single+kinesin+molecules.">Assay of microtubule movement driven by single kinesin molecules.</a> Methods in Cell Biology. 39, 137-147 (1993).</li><li>Huppertz, T., Fox, P. F., Kelly, A. L., Yada, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proteins in Food Processing (Second Edition). , 49-92 (2018).</li><li>Wettermark, G., Borglund, E., Brolin, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regenerating+system+for+studies+of+phosphoryl+transfer+from+ATP.">A regenerating system for studies of phosphoryl transfer from ATP.</a> Analytical Biochemistry. 22, 211-218 (1968).</li><li>Vigers, G. P. A., Coue, M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Microtubules+Break+Up+Under+Illumination.">Fluorescent Microtubules Break Up Under Illumination.</a> Journal of Cell Biology. 107, 1011-1024 (1988).</li><li>Brunner, C., Hess, H., Ernst, K. -. H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).</li><li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry.">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבודה זו, אנו מציגים מערכת ננו הפעיל את עצמי איזה מרכיב מחייב חלש אבני הבניין לבניית מסלול משלה. כפי שמוצג באיור1, דאייה microtubules קינזין מוטורס מהפתרון ולצבור להפקיד אותם על פני השטח. . המנועים קינזין נשארים בעקבות microtubule לתקופה קצרה של זמן לפני שחזר פתרון. לפיכך, בניסוי זה, קינזין מנועים חלופי בין 3 מדינות:
(1) יחיד מכורך microtubule מדינה: זה כאשר קינזין תחילה נקשר microtubule. הוא קיים ב שיווי משקל עם המדינה (2).
(2) מצב כפול מכורך: במקרה זה, קינזין יחיד מכורך microtubule גם נקשר פני השטח באמצעות את התג שלו. מצב כפול מכורך זה מאפשר microtubule הנעה.
(3) מצב השטח מכורך יחיד: קינזין כפול מכורך הלך מסוף microtubule, הוא לא desorbed עדיין מפני השטח שנמצא במצב זה. מנועים אלה ניתן לראות באיור 1 (ערוצים משולב וירוק): הם להרחיב מאחורי הזנב של microtubule עבור מספר מיקרומטר ויוצרים את העקבות שמפחית שלו.
השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא היווצרות של פני השטח הידרופובי בשקופית. לא רק זה להשתמש כימיקלים מסוכנים, אלא זה גם מאפשר את פג-PPG-יתד functionalized עם הקבוצה נ כדי להרגיע את השטח, המאפשר ואז את קינזין לאגד הפיכה אל פני השטח. צעד חשוב נוסף הוא איטום התא זרימה עם גריז. דבר זה מאפשר הדמיה ממושך ללא נוזלי מתאדים תא הזרימה.
השינויים העיקריים טכניקה זו מורכבות משתנה ריכוז microtubule קינזין ריכוז, ריכוז ATP. שינוי microtubule ריכוז ישתנה מספר microtubules גלישה על פני השטח. שינוי קינזין ריכוז ישתנה מספר מולקולות קינזין ניתן לאגד microtubule. עם זאת, הגדלת ריכוז קינזין מעל הסכומים שכבר הגדרת בניסוי זה יכול להגדיל רקע זריחה, וכך קשה יותר לראות את השבילים קינזין נשאר מאחור דאייה microtubules. בינתיים, הורדת ריכוז ATP מתחת 10 מיקרומטר באופן משמעותי יקטן microtubule גלישה מהירות. אם אפקט זה רצוי, זה הכרחי לנצל של ATP נוצר מחדש מערכת המורכבת פוספטאז קריאטין ו- phosphokinase.
מגבלה אפשרי של טכניקה זו היא כי, בשל התכנים קינזין פעיל גדול של המערכת, מ- ATP ניתן לצרוך במהירות, ניסויים עלולה להימשך פחות משעה בתנאים מסוימים. זה יהיה למשל המקרה אם אחד בשימוש ריכוז קינזין כפולה גבוה יותר, מחומשת ריכוז microtubule גבוה יותר מאשר מה מוצג פרוטוקול זה.
שלנו הקודם העבודה18, למדנו את התפוצה המרחבית של מנועים קינזין לאורך microtubules, מוכיח הדאייה microtubules לצבור קינזין מוטורס מהפתרון, וכתוצאה מכך גידול של הצפיפות של מנועים לאורכו של microtubule. מצאנו גם כי הדאייה יציבות microtubules' המחישו מבנין לא לינארית על פתרון קינזין מהירות ריכוז לבין microtubule.
פרוטוקול הציג סוללת את הדרך לשימוש יעיל יותר של חלבון מוטורס במערכות הננומטרי הנדסה לאחור ועבור לחקירה נוספת בעיצוב של nanosystems פעילים הנמצאים בשיווי משקל דינמי. יתר על כן, באופי הדינמי של מערכת זו מאפשרת לשרת כמערכת מודל לימוד הריפוי העצמי ודינאמיים החלפת רכיבים מולקולריים, סגירת חלק הפער בין מבנים הנדסה וטבעי.

האינטראקציות המסדירים את אופן הפעולה של פעיל nanosystems תמיד יש מתאפיינת מאריכים, כמעט בלתי הפיך אג ח1,2,3,4,5,6 7, ,8. דוגמה למד היטב של זה היא מערכת microtubule-קינזין, איפה הדאייה microtubules מונעות על ידי בלתי הפיך משטח מכורך קינזין מוטורס1,2,3,4, 5. מערכות שבו הרכיבים הפיכה מחוברים אחד לשני כבר למד באופן תיאורטי9,10 , בתאריך11,macroscale12, אך קנה מידה של מערכות אלה למטה ננו כבר מאתגר. אחת הסיבות המרכזיות לכך היא שבירת הזה, רפורמה הקשרים בין רכיבי לעיתים קרובות דורשת שינוי גדול בתנאי הסביבה. למרות שינויים אלו יושמו14,13,האחרונות15, הם סומכים על שינוי המערכת עצמה ולא על התאמתה לסביבה שלה. תכנון מערכות בקנה מידה מולקולרי שבו הרכיבים ללא הרף להרכיב ולארגן לתוך מבנים מבלי להפריע לסביבה הכוללת שבה מתקיימים הניסויים יפתח את הדלת אל חקר מגוון רחב של התנהגויות דינמיות 16 , 17.
כאן, אנו מתארים ומדגימים את פרוטוקול מפורט ליצירה באופן דינמי וההספק של פירוק מערכת תפקוד ננו. את המערכת ואת כללי ההתנהגות שלה כבר הציג קודמת18: חוטים microtubule מונעות על ידי רצועות של הפיכה במשטח מכורך קינזין-1 מוטורס. חלבונים אלה קינזין מוטוריים הן גויסו הפתרון כדי לסייע להניע microtubules לפנים, לפני desorbing שוב זמן קצר לאחר מכן. לאחר חזרה בפתרון, הם יכול להיות גויסו שוב כדי להניע microtubule חדש. העבר13,14,15, מבזק, רפורמה של איגרות החוב הנדרש שינויים סביבתיים; לעומת זאת, הסביבה של התא הזרימה שלנו יישאר ללא שינוי, בעוד לרוורס קינזין אינטראקציה עם פני השטח.
פרוטוקול זה יעזור גם לחוקרים (1) להמחיש את כל השלבים של הפרוטוקול, ו- (2) לסייע בפתרון בעיות מסוג זה וזמינותו. אותו יש כבר נגזר בהליכים המתוארים תחת הווארד et al. 199319.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX 488-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>642 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX&#160;642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlorodimethylsilane solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40140-25ML</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34869-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TI</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP rkin430</td>
			<td>Provided by George Bachand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine Triphosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Sigma Pharmaceuticals</td>
			<td>8089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>656895-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1912-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F108-NTA</td>
			<td>Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular</td>
			<td></td>
			<td>PEG-PPG-PEG-NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-108</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542342-250G</td>
			<td>PEG-PPG-PEG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T324</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte647-labeled</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Ozone Procleaner</td>
			<td>BioForce Nanosciences</td>
			<td>PC440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;Puradisc syringe filters</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA67840402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS Camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>sCMOS 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מאפיק קינזין הסעות מולקולרית עם קובץ מצורף חלשים ובלתי הפיך של kinesins השטח. בניגוד פרוטוקולים הקודמים, במערכת זו, microtubules לגייס מהחלבונים מנוע קינזין הפתרון ולמקם אותם על משטח. Kinesins, בתורו, יקל את לגלש של microtubules לאורך פני השטח לפני desorbing חזרה אל הפתרון בתפזורת, ובכך להיות זמין בכדי להתגייס שוב. זה מתמשך הרכבה ופירוק מוביל בולט התנהגות דינמית במערכת, כגון היווצרות של שבילים קינזין זמני על ידי גלישה microtubules.
מספר שיטות נסיוניות יתוארו לאורך כל הניסוי הזה: ספקטרופוטומטר UV-Vis ישמש כדי לקבוע הריכוז של פתרונות מניות של ריאגנטים, coverslips יהיה קודם האוזון, אולטרה סגול (UV) התייחסו ולאחר מכן silanized לפני נטענת לתוך תאי זרימה, זריחה גמורה מיקרוסקופ (TIRF) שישמש בו-זמנית בתמונה קינזין מוטורס microtubule חוטים.

בניסויים אלה, השתמשנו 1,000 פעמים לדילול microtubules מוכן בסעיף 1.3.2. ריכוז קינזין היה 20 ננומטר, ריכוז ATP היה 1 מ מ. הדמיה בוצעה באמצעות מיקרוסקופ TIRF. הדאייה microtubules היו בנפרד עם תמונה של מוטורס קינזין: microtubules היו גלויים על עירור עם 647 ננומטר לייזר (איור 1, אדום), ה-GFP-קינזין היה גלוי כשהוא מתרגש עם 488 ננומטר לייזר (איור 1, ירוק). הזמן בין עירור עם אור אדום וירוק היה פחות מ- 1 s. הזמן בין מסגרות היה ש-microtubules ס' 10 מוצג הדאייה יציב. Microtubule הממוצע גלישה מהירות היה שנהנתם 800 nm בשנייה. צפיפות המשטח microtubule היה 400 מ-2. עקבות קינזין (ירוק) הופיע להרחיב מעבר לסוף נגרר microtubules (אדום) עבור מספר מיקרומטר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59068/59068fig1.jpg"> איור 1: דאייה microtubules מונעות על-ידי מנועים קינזין משטח מכורך חלש. כפי microtubules להתקדם, נצברות קינזין מוטורס מהפתרון. מנועים אלה לסירוגין בין שתי מדינות: יחיד-מוכרחים microtubule ולאחר כפול מכורך את microtubule והן את פני השטח. כאשר מנוע מאוגד כפול מגיע לסוף microtubule, המנוע נשאר מאחור, לאט desorbs מפני השטח עם שיעור כיבוי של s 0.1 כ-1. כתוצאה מכך, שבילים של מנועים קינזין להישאר מאחור microtubules. שורה עליונה: הערוץ האדום (microtubule). בשורה האמצעית: הערוץ הירוק (קינזין). שורה תחתונה: בשילוב אדום (microtubule) וערוץ ירוק (GFP-קינזין). סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59068/59068fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins at JoVE.com

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

הרכבת המעבורות מולקולרי מופעל על ידי הפיכה מצורף Kinesins

אנו מציגים את פרוטוקול לבנות מעבורות מולקולרית, היכן חלבונים מנוע קינזין דבקה משטח להניע microtubules צבען מתויג. אינטראקציות חלשות של kinesins עם המשטח מאפשר ההחזקה הפיך שלהם אליו. זה יוצר מערכת ננו אשר מוצגים דינמי הרכבה ופירוק של מרכיביו תוך שמירה על הפונקציונליות שלו.

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא פותח את הדלת לחקירה נוספת בתכנון של מערכות ביולוגיות ננומטריות כי הם ב שיווי משקל דינמי. טכניקה זו ממלאת חלק מהפער בין מבנים מהונדסים וטבעיים משום שהיא מאפשרת לחקור את מה שאנו יכולים לקרוא לו, ריפוי עצמי' או החלפה דינמית של רכיבים מולקולריים. העצה החשובה ביותר לנסות טכניקה זו בפעם הראשונה היא לוודא כי הניסוי של ביצוע כל פרוטוקולי הבטיחות.תחילה, הכן את פתרונות המלאי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פיפטה 21.8 מיקרוליטר של חיץ BRB80 לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה קטן. הוסף מיקרוליטר אחד של פתרון מלאי מגנזיום כלוריד, 1 מיקרוליטר של פתרון מניית GTP, ו 1.2 microliters של פתרון המניות DMSO כדי לסיים את הכנת מאגר הצמיחה microtubule.כדי להתחיל פילמור microtubule, להוסיף 6.25 microliters של מאגר צמיחה microtubule ישירות לתוך 20 מיקרוגרם aliquot של צינורלין ליופילי;שכותרתו להתרגש ב 647 ננומטר. וורטקס ב 40 RPS במשך 5 שניות. מצננים את האליקוט על הקרח במשך 5 דקות.לאחר מכן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. כדי להתחיל ייצוב microtubule, להוסיף 5 microliters של פתרון paclitaxel aliquoted ל 490 microliters של מאגר BRB80. מערבולת הפתרון ב 30 RPS במשך 10 שניות.לאחר 45 דקות של דגירה עבור microtubules הוא למעלה, להוסיף 5 microliters של פתרון זה BRB80, ותערובת paclitaxel, כדי ליצור את הפתרון MT100. ראשית, להוסיף 9.0 microliters של פתרון קסטין aliquoted כדי 291 microliters של מאגר BRB80. פיפטה 83 מיקרוליטרים של פתרון קנקין BRB80 לתוך צינור חדש 6 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה.הוסף 1 מיקרוליטר של גלוקוז D, אוקסידאז גלוקוז, קטלאז, DTT, קריאטין פוספט ופוספוקינאז. לאחר מכן, להוסיף 1 microliter של פתרון ATP המניה לפתרון תנועתיות. פליק, או מערבולת האליקוט כדי להפיץ הומוגנית את הכימיקלים.לאחר מכן, להוסיף 1 microliter של פתרון kinesin מוכן לפתרון תנועתיות, כך הריכוז הסופי הוא 20 nanomolar. הוסף 10 מיקרוליטרים של פתרון MT100 לפתרון תנועתיות. עבור תאי זרימה, השתמש הן בכיסוי גדול והן בכיסוי קטן.שוטפים את כל הכיסויים פעמיים עם אתנול ופעמיים עם מים אולטרה-חמים. Sonicate את הכיסויים שטף במים אולטרה חום במשך 5 דקות. לאחר מכן, לייבש את הכיסויים בתנור בטמפרטורה שבין 50 ל 75 מעלות צלזיוס.השתמשו במנקה UV-ozone לטיפול בצד אחד של כל כיסוי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ובתנאים אטמוספריים רגילים. באמצעות פינצטה, להפוך כל כיסוי ולהשתמש UV-אוזון לטיפול בצד מטופל גם כן. Sonicate את כיסויים מטופלים במים אולטרה חום במשך 5 דקות.לאחר מכן, לייבש אותם בתנור בטמפרטורה בין 50 ל 75 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דון ציוד מגן כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לטבול כל כיסוי בתמיסת מלח במשך 15 שניות.לשטוף את הכיסויים פעמיים בטולואן ושלוש פעמים במתנול. השתמש בחנקן בלחץ כדי לייבש את כיסויי. לאחר כיסויים יבשים, לחתוך חתיכת קלטת דו צדדית כי הוא 2 ס"מ על ידי 2.5 ס"מ.חותכים את החתיכה הזאת לחצי אנכית לשתי רצועות 1 ס"מ על ידי 2.5 ס"מ. שים את כיסוי גדול על מגב משימה עדין ותדביק את רצועות הסרט אליו, אורך חכם לאורך הקצוות כדי ליצור 1 ס"מ על ידי 2.5 סנטימטר שטח בין חתיכות של קלטת. תקע את הכיסוי הקטן על גבי רצועות הקלטת כדי לסיים את הרכבת תא הזרימה.ראשית, הזרם כ-20 מיקרוליטרים של פתרון PEG-PPG-PEG לתא הזרימה שהורכב. תן לפתרון לספוג על פני השטח במשך 5 דקות, ולאחר מכן, להחליף פתרון זה עם 20 microliters של מאגר BRB80 שלוש פעמים על ידי זרימת המאגר פנימה זרימה 20 microliters של פתרון תנועתיות לתוך תא הזרימה.לאחר מכן, לאטום את הקצוות של תא הזרימה עם גריז כדי למנוע אידוי אם הניסוי המתוכנן הוא יותר משעה. בצע את ההדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פנימית כוללת מסוג אובייקטיבי. מניחים טיפה של שמן טבילה על המטרה.לאחר מכן, מקם את תא הזרימה על פלטפורמת המיקרוסקופ. ולהביא את המטרה עד שיש מגע בין השמן על המטרה לבין תא הזרימה. השתמש במערכת הכיסוי המשולבת של המיקרוסקופ כדי לחסום את כל אור הלייזר מלברוח.לאחר מכן, הפעל את הלייזר והתמקד במשטח התחתון של תא הזרימה באמצעות לייזר 642 ננומטר כדי לדמיין את המיקרוטובולים, ולייזר 488 ננומטר כדי לדמיין את מנועי הקינסין GFP. הקלט את התמונות או הסרטונים המעניינים. ניתן להקליט תמונות כל עוד יש תנועתיות בתא הזרימה.במחקר זה מוצגת מערכת ננומטרית פעילה, המרכיבה בעצמה אבני בניין מחייבות חלשות לבניית מסלול משלה. באמצעות מיקרוסקופ tirf, microtubules גלישה הם בנפרד בתמונה מן מנועי kinesin. Microtubules נראים על גירוי עם לייזר 647 ננומטר.ואת קינסין GFP נראים כאשר נרגשים עם לייזר 488 ננומטר. הזמן שבין העירור לאור האדום והירוק היה פחות משנייה אחת. כפי שניתן לראות, microtubules גלישה לצבור מנועי kinesin מן הפתרון ולהפקיד אותם על פני השטח.מנועי הקינסין נשארים בעקבות המיקרוטובולים לתקופה קצרה לפני שהם חוזרים לפתרון. חשוב מאוד לקבל את הריכוז הנכון של reagents ב antifade של פתרון תנועתיות, אחרת, הלבנת תמונה יגרום הניסוי להיכשל. טכניקה זו סוללת את הדרך לשימוש יעיל יותר במנועי חלבון במערכות מהנדסים ננומטריות.כך, מאפשר תכנון וחקר של ננו-מבנים מורכבים יותר.

Research

JoVE Journal

Engineering

Molecular Beam Mass Spectrometry With Tunable Vacuum Ultraviolet (VUV) Synchrotron Radiation

Molecular Beam Mass Spectrometry With Tunable Vacuum Ultraviolet VUV Synchrotron Radiation

ספקטרומטריית מסת קרן מולקולרית עם קרינת אולטרה סגולה אבק מתכוונן (VUV) Synchrotron

Tunable soft ionization coupled to mass spectroscopy is a powerful method to investigate isolated molecules, complexes and clusters and their spectroscopy ...

Ultrahigh Density Array of Vertically Aligned Small-molecular Organic Nanowires on Arbitrary Substrates

מערך צפיפות ultrahigh של nanowires אורגני קטן מולקולרי בציר אנכי על מצעים שרירותיים

In  recent years &pi;-conjugated  organic semiconductors have emerged as the active material in a number of  diverse applications including large-area, ...

Spatial Separation of Molecular Conformers and Clusters

הפרדה מרחבית של קונפורמרים מולקולריים ואשכולות

Gas-phase molecular physics and physical chemistry experiments commonly use supersonic expansions through pulsed valves for the production of cold ...

Measurement and Analysis of Atomic Hydrogen and Diatomic Molecular AlO, C2, CN, and TiO Spectra Following Laser-induced Optical Breakdown

Measurement and Analysis of Atomic Hydrogen and Diatomic Molecular AlO, C2, CN, and TiO Spectra Following Laser-induced Optical Breakdown

מדידה וניתוח של מימן אטומי והמולקולרי דו האטומי ALO, C<sub&gt; 2</sub&gt;, CN, וההתפלגות מושרה הלייזר הבא TIO הספקטרום אופטית

In this work, we present time-resolved measurements of atomic and diatomic spectra following laser-induced optical breakdown. A typical LIBS arrangement ...

Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy

העברת פרוטון והחלבון Dynamics קונפורמציה בחלבונים רגישים לאור בזמן נפתר-Step-לסרוק פורייה-להפוך ספקטרוסקופית אינפרא אדום

Monitoring the dynamics of protonation and protein backbone conformation changes during the function of a protein is an essential step towards ...

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Probing C84-embedded Si Substrate Using Scanning Probe Microscopy and Molecular Dynamics

Probing C84-embedded Si Substrate Using Scanning Probe Microscopy and Molecular Dynamics

גשוש C<sub&gt; 84</sub&gt; -embedded Si המצע באמצעות סריקת בדיקה מיקרוסקופית דינאמיקה מולקולארית

This paper reports an array-designed C84-embedded Si substrate fabricated using a controlled self-assembly method in an ultra-high vacuum chamber. The ...

Quantitative Hardness Measurement by Instrumented AFM-indentation

מדידת קשיות כמוני יד מאובזרת AFM-הזחה

In this work, a combination of amplitude-modulated non-contact atomic force microscopy and atomic force spectroscopy is applied for instrumented hardness ...

Plasma-assisted Molecular Beam Epitaxy of N-polar InAlN-barrier High-electron-mobility Transistors

Beam Epitaxy המולקולרית בסיוע פלזמה של N-קוטבי InAlN-מחסום טרנזיסטורים-ניידות גבוהה-אלקטרון

Plasma-assisted molecular beam epitaxy is well suited for the epitaxial growth of III-nitride thin films and heterostructures with smooth, abrupt ...

Preparation of Liquid Crystal Networks for Macroscopic Oscillatory Motion Induced by Light

הכנה של גביש נוזלי רשתות מאקרוסקופית תנועה מתנדנדות המושרה על ידי אור

A strategy based on doped liquid crystalline networks is described to create mechanical self-sustained oscillations of plastic films under continuous ...