Name: assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins
Uploaded: 2019-01-26T14:45:00
Duration: 8 min 4 s
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Los autores agradece apoyo financiero bajo subvención de NSF 1807514 NSF-DMR. Los autores agradecen a G. Bachand y V. Vandelinder para proporcionar la proteína GFP-kinesin. Este trabajo fue realizado, en parte, en el centro de nanotecnologías integradas, una de ciencia usuario oficina funcionó para la oficina nosotros Departamento de energía (DOE) de la ciencia por Los Alamos National Laboratory (contrato no. DE-AC52-06NA25396) y los laboratorios nacionales Sandia (con-tracto Nº 97 DE-AC04-94AL85000). Los autores agradecen su regalo de PEG-PPG-PEG funcionalizado con NTA Dr. Jennifer Neff y AllVivo vasculares.

1. preparación de la solución
PRECAUCIÓN: Tres de los reactivos usados en este protocolo (tolueno, dimetildiclorosilano y Ditiotreitol) son altamente tóxicos. Consulte las hojas de datos de seguridad material (MSDS) antes de su uso. Además, partes de este protocolo deben realizarse bajo un mayor nivel de protección, usar gafas de seguridad y dos juegos de guantes de protección como se indica. A menos que se aconseje lo contrario, los experimentos pueden realizarse en bancos de laboratorio durante el uso de todos los equipos de protección personal (gafas, guantes, bata, pantalón largo y zapatos cerrados).
Nota: Las concentraciones de ATP, kinesin y microtúbulos, que se utilizan en el presente Protocolo pueden ser modificadas dadas las necesidades de cada experimento. Sin embargo, si modifica, asegúrese de que las concentraciones finales de los otros reactivos se mantienen tal como se indica a continuación. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente, (~ 25 ° C).
<ol><li>Preparación de soluciones stock Nota: Preparar y alícuota las siguientes soluciones de antemano. Alícuotas de todos pueden ser preparados a temperatura ambiente (~ 25 ° C).<ol>
<li>
Buffer BRB80 Nota: El buffer para la mayoría de las soluciones utilizadas en el presente Protocolo es BRB80. BRB80 puede ser preparada en grandes cantidades y almacenados en un congelador de-20 ° C.<ol>
<li>Disolver 24,2 g de piperazina-N, N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (pipas) y 3,1 g de hidróxido de potasio (KOH) en 800 mL de agua desionizada para hacer 800 mL de tuberías de 100 mM. Añadir 100 mL de 10 mM cloruro de magnesio (MgCl2) y 100 mL de ácido de 10 m m etilenglicol tetraacético (EGTA) para obtener un volumen final de 1 L. el levantar el pH a 8 con hidróxido de potasio (KOH) puede ayudar en la disolución de los tubos y EGTA. Nota: Las concentraciones finales de los productos químicos en el buffer de BRB80 son tubos de 80 mM, 1 mM MgCl2y 1 mM EGTA.</li>
			<li>Ajustar el pH del buffer a 6.9 utilizando KOH y ácido clorhídrico (HCl).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ATP
		<ol>
<li>Preparar una solución de 1 mL 100 mm ATP en agua ultrapura. La solución en 10 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-80 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
GTP
		<ol>
<li>Preparar una solución μL 500 25 mm GTP en agua ultrapura. La solución en 5 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-80 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
MgCl2
		<ol>
<li>Preparar una solución de 1 mL de 100 mM de MgCl2 en agua ultrapura. La solución en 10 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Caseína
		<ol>
<li>Pesar 1 g de caseína seca y transfiéralo a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL. Añadir 35 mL de tampón de BRB80 al tubo para disolver el polvo de caseína.</li>
			<li>Coloque la solución en un vaso en una cámara fría para disolver la noche. En este punto, la solución se verá espeso y viscoso.</li>
			<li>Dejar el tubo verticalmente en una nevera de 4 ° C para permitir cualquier sin disolver grumos grandes resolver. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.</li>
			<li>Girar el tubo en una centrifugadora a 1.000 x g para que sedimenten fuera más precipitados. Una vez más, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.</li>
			<li>Repetidamente filtrar la solución 0,2 μm (7 bar de presión máxima) filtros. La solución siendo gruesa, muchos filtros conseguir estorbados, así que repiten este paso hasta que el filtro esté claro y libre de obstrucciones.</li>
			<li>Determinar la concentración de caseína en la solución resultante mediante espectrofotometría UV/Vis, con coeficiente de extinción de caseína de 19 mM-1∙cm-1 a 280 nm20. Suponiendo un peso molecular de 23 KD para caseína, diluir la solución a una concentración de 20 mg∙mL-1 en BRB80.</li>
			<li>Pipeta de la solución en 20 alícuotas μL y almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
D-glucosa
		<ol>
<li>Preparar una solución de 1 mL de 2 M D-glucosa en agua ultrapura. La solución en 10 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Glucosa oxidasa
		<ol>
<li>Preparar una solución de 1 mL de 20 mg∙mL-1 glucosa oxidasa en BRB80. La solución en 10 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Catalasa
		<ol>
<li>Preparar una solución de 1 mL de 0,8 mg∙mL-1 catalasa en BRB80. La solución en 10 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Ditiotreitol (DTT) Nota: Puesto que la TDT es un poco volátil y tóxico, por favor realice los siguientes pasos bajo una campana de humos.<ol>
<li>Preparar una solución de 1 mL de 1 M diluida en agua ultrapura de la TDT. La solución en 10 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Paclitaxel
		<ol>
<li>Preparar una solución de 1 mL de 1 mM paclitaxel diluida en DMSO. La solución en 10 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Dimetil sulfóxido (DMSO) Nota: El DMSO utilizado en estos experimentos es puro.<ol>
<li>Pipetee 1 mL de DMSO puro en 10 alícuotas μL. Almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Fosfato de creatina
		<ol>
<li>Preparar una solución de 1 mL de 0.2 M fosfato de creatina en agua ultrapura. La solución en 10 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Creatina-fosfocinasa
		<ol>
<li>Preparar una solución de 1 mL de units· 200 L-1 la fosfocinasa de creatina en agua ultrapura. La solución en 10 alícuotas μL de pipeta. Almacenar las alícuotas en un congelador de-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Sulfato de níquel (II)
		<ol>
<li>Preparar 500 mL de una solución de sulfato de níquel (II) de 50 mM en agua ultrapura. Almacenar la solución a temperatura ambiente (~ 25 ° C).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Solución de Poly(Ethylene glycol)-bloque-poly(propylene glycol)-bloque-poly(ethylene glycol) (PEG-PPG-PEG)
		<ol>
<li>Pesar 2 mg de PEG-PPG-PEG (peso molecular promedio en número: 14.600 g∙mol-1)-polvo NTA en el peso de papel. PEG-PPG-PEG-NTA es el copolímero en tribloque funcionalizado con un grupo de (NTA) ácido nitrilotriacético. Consulte la Tabla de materiales para más detalles sobre PEG-PPG-PEG-NTA.</li>
			<li>Transferir el polvo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 1 mL de la solución madre de sulfato de níquel (II) al tubo. Vortex hasta que el polvo es disuelto y sin grumos visibles permanecen.</li>
			<li>Tienda durante un mes a temperatura ambiente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Antes de comenzar un experimento
	<ol>
<li>Llene un balde con hielo.</li>
		<li>Tomar una alícuota de cada uno de los 13 reactivos descritos en las secciones de 1.1.1 a la 1.1.13 por encima y añadir a la cubeta, así manteniéndolos en el hielo. Descongelar cada uno de los reactivos antes de usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de microtúbulos Nota: Microtúbulos se polimerizan de una alícuota de 20 μg de marcado tinte liofilizado tubulina. La longitud de onda de excitación del tinte es de 647 nm.<ol>
<li>
Preparación del buffer de crecimiento microtubular
		<ol>
<li>Pipeta de 21,8 μL de tampón de BRB80 en una microcentrífuga de pequeña (0.6 mL) del tubo. Añadir 1 μL de la solución madre de MgCl2 y 1 μL de la solución madre de GTP 1,2 μL de la solución madre de DMSO. Nota: Por lo tanto, las concentraciones finales de los reactivos en el buffer de BRB80 son 4 mM MgCl2, 1 mM GTP y dimetilsulfóxido 5% (v/v).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Polimerización de microtúbulos
		<ol>
<li>Añadir 6,25 μL de tampón de crecimiento microtubular directamente en una alícuota de 20 μg de tubulina liofilizado etiquetado. Vórtice de la alícuota de 5 s en 30 rps.</li>
			<li>Enfríe la alícuota en hielo durante 5 minutos antes de incubar a 37 ° C por 45 min y continuar a la sección 1.3.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Estabilización de microtúbulos
		<ol>
<li>Añadir 5 μL de la solución de paclitaxel alícuotas a 490 μL de tampón de BRB80. Vórtice la solución durante 10 s en 30 rps.</li>
			<li>Una vez encima de lo 45 min de incubación para los microtúbulos, añadir 5 μL de la solución de microtúbulos polimerizados a la solución de BRB80/paclitaxel. Nota: Esta solución 100-fold microtúbulos diluido, estabilizado, se ser sucesivo MT100. Se puede utilizar hasta 5 días, y puede ser diluido para obtener la densidad deseada de microtúbulos para cada experimento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de movilidad
	<ol>
<li>
Antifade enzimático, sistema de regeneración de ATP y ATP
		<ol>
<li>Añadir 9,0 μL de la solución de caseína alícuotas a 291 μL de tampón de BRB80.</li>
			<li>Si la concentración de ATP deseada para el experimento es inferior a 1 mM, pipeta 83 μL de la solución de BRB80 de la caseína en un nuevo tubo de microcentrífuga de 0.6 mL. Por otra parte, pipeta 85 μL de esta solución en un tubo nuevo de microcentrífuga de 0.6 mL.</li>
			<li>Añadir 1 μL de D-glucosa, 1 μL de glucosa oxidasa, 1 μL de catalasa y 1 μL de la TDT a ese tubo. Nota: Estos productos químicos constituyen un enzimático cóctel antifade21 que reducirá el fotoblanqueo quitando disuelto radicales reactivos de oxígeno y enfriamiento. Esto reduce el fotoblanqueo y microtúbulos desintegración causada por la iluminación de excitación durante22,23la proyección de imagen de la fluorescencia.</li>
			<li>Para los experimentos en los que la concentración de ATP es elegida para ser significativamente inferior a 1 mM, añadir los siguientes reactivos a la solución para crear un sistema de regeneración de ATP: 1 μL de la solución de fosfato de creatina alícuotas y 1 μL de la creatina alícuotas solución de fosfocinasa.</li>
			<li>Añadir 1 μL de la solución madre de ATP a la solución de movilidad. Flick o vórtice la alícuota para distribuir homogéneamente los productos químicos. Nota: Por lo tanto, la concentración final de los productos químicos en la solución son 10 μM paclitaxel, 0,5 mg·mL−1 caseína, 20 mM D-glucosa, 200 μg·mL−1 glucosa oxidasa 8 μg·mL−1 catalasa, dithiothreitol de 10 mM, 2 mM creatina fosfato (si se añaden), 2 Units· L−1 creatina-fosfocinasa, (si) y 1 mM ATP. Esta solución va ser sucesivo la solución de movilidad.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Kinesin Nota: La solución stock kinesin utilizada en estos experimentos es preparada por G. Bachand en el centro de nanotecnologías integradas en Sandia National Laboratories y disponible bajo un acuerdo de usuario (https://cint.lanl.gov/becoming-user/call-for-proposals.php). el buffer utilizado aquí consiste en imidazol de 40 mM, 300 mM de NaCl, 0.76 g· L-1 EGTA, 37.2 mg· L-1 EDTA, 50 g· L-1 sacarosa, TCEP de 0,2 mM y μM 50 Mg-ATP. Para esta serie de experimentos, se utilizó el rkin430eGFP kinesin constructo. Se trata de una quinesina que consiste de los primeros 430 aminoácidos de cadena pesada de la quinesina rata fusionado a eGFP y una C terminal su-etiqueta en el dominio de cola24. Se expresó en Escherichia coli y había purificado usando una columna de Ni−NTA. La concentración de la solución madre de GFP-kinesin fue 1,8 ± 0,3 μM según lo determinado por espectrofotometría UV/Vis, con un coeficiente de extinción para GFP de 55 mM-1·cm-1 489 nm25, y teniendo en cuenta quinesina es un dímero.<ol>
<li>Determinar la densidad de concentración o superficie de quinesina deseada para el experimento. Para los ensayos de típico, esta concentración es de 20 nM. Si la concentración de quinesina debe diluirse más centuplicado, diluirla en una solución de BRB80 que contiene 0.5 mg·mL-1 de caseína.</li>
			<li>Añadir 1 μl de solución de quinesina a la solución de movilidad para obtener una concentración final de aproximadamente 20 nM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Microtúbulos
		<ol>
<li>Añada 10 μL de la solución MT100 preparada en la sección 1.3 para la solución de movilidad. Nota: Esta solución de movilidad se puede utilizar hasta 3 horas. Después de ese tiempo, el sistema antifade pierde su efectividad porque se agota la glucosa en la solución de la reacción enzimática.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. montaje de las celdas de flujo
<ol><li>
Lavar los cubreobjetos
	<ol>
<li>Para las células de flujo, utilizar un cubreobjetos grande (dimensión: 60 x 25 mm) y pequeño (dimensiones: 22 x 22 mm)19.</li>
		<li>Enjuague los cubreobjetos dos veces con etanol y dos veces con agua ultrapura. Someter a ultrasonidos el cubreobjetos en agua ultrapura para secar 5 minutos en un horno a una temperatura de entre 50 y 75 ° C.</li>
		<li>La utilización de un UV/ozono limpieza (véase Tabla de materiales y las instrucciones del fabricante), tratar a un lado de cada cubreobjetos para 15 minutos realizar este paso puede a temperatura ambiente (~ 25 ° C) y en condiciones atmosféricas normales (presión de 1 atm).</li>
		<li>Gire cuidadosamente cada cubreobjetos a su otro lado (con pinzas) y de UV/ozono tratar ese lado también.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos el cubreobjetos en agua ultrapura nuevamente por 5 min antes de secarlas nuevamente en el horno a una temperatura de entre 50 y 75 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tratar el cubreobjetos para habilitar la capa de PEG-PPG-PEG Nota: El dimetildiclorosilano y tolueno utilizado en esta parte del Protocolo de ser altamente tóxico, realice los pasos siguientes bajo una campana de humos, teniendo las siguientes precauciones: llevar dos juegos de guantes y una camiseta de manga larga debajo de su laboratorio capa. Meta los bordes de los guantes de las mangas de la camisa para que no la piel de los antebrazos se expone directamente a los productos químicos en caso de un derrame. Usar gafas de protección.<ol>
<li>Diluir 25 mL de dimetildiclorosilano puro en 475 mL de tolueno. Sumerja cada cubreobjetos en la solución de dimetildiclorosilano y tolueno durante 15 segundos.</li>
		<li>Lavar los cubreobjetos en tolueno y tres veces en metanol. Seque el cubreobjetos con nitrógeno a presión.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montaje de cubreobjetos en células de flujo
	<ol>
<li>Una vez seco el cubreobjetos, cortar un trozo de 2 cm x 2,5 cm de cinta de doble cara verticalmente rayas dos de 1 x 2,5 cm.</li>
		<li>Poner el cubreobjetos grande en un limpiador delicado de la tarea y las rayas de la cinta del palillo longitudinalmente a lo largo de los bordes del cubreobjetos para crear un área de 1 cm x 2,5 cm entre los trozos de cinta.</li>
		<li>Palo pequeño cubreobjetos encima de las rayas de la cinta para terminar el montaje de la célula de flujo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. fluir las soluciones en una celda de flujo
<ol><li>Flujo aproximadamente 20 μL de la solución de PEG-PPG-PEG en la célula de flujo montado. El volumen que ha volado en la célula tiene que ser lo suficientemente grande para llenar la cámara. En los pasos siguientes, use el mismo volumen al cambiar las soluciones.</li>
	<li>Permiten la solución de PEG-PPG-PEG absorber en la superficie por 5 minutos. Intercambio de la solución de PEG-PPG-PEG con tampón de BRB80 3 veces por que fluye el buffer. Flujo de la solución de movilidad en la celda de flujo.</li>
	<li>Sellar los bordes de la celda de flujo con grasa para evitar la evaporación si el experimento planificado tiene más de una hora. Nota: La celda de flujo está ahora lista para ser fotografiada.</li>
</ol>4. imagen de una celda de flujo
<ol><li>Realizar la proyección de imagen usando una configuración de fluorescencia (TIRF) de tipo de objetivo de reflexión interna total para los motores de kinesin (véase Tabla de materiales) y los microtúbulos. Nota: Aquí, se utilizó un microscopio con 100 x / 1.49 lente del objetivo de la apertura numérica, con dos láseres, uno con una longitud de onda de 642 nm y una potencia máxima de 140 mW y otro con longitud de onda de 488 nm y una potencia máxima de 150 mW.</li>
	<li>Coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo.</li>
	<li>Coloque la celda de flujo en la plataforma de microscopio y el objetivo hasta que hay contacto entre el aceite en el objetivo y la célula de flujo.</li>
	<li>Uso cubierta de entrecierre del microscopio para bloquear toda la luz láser salga.</li>
	<li>Encienda el láser y centrarse en la parte inferior de la célula de flujo. Los microtúbulos son fluorescencia etiquetados y excitó a una longitud de onda de 647 nm. Ellos serán reflejadas usando un láser 642 mientras un 488 nm láser se utiliza para los motores de GFP-kinesin.</li>
	<li>Grabar las imágenes o videos de interés. Por lo general, la potencia del láser es de aproximadamente 30 mW y un tiempo de exposición de 50 ms para los dos canales de láser. Imágenes pueden grabarse para como es la motilidad de la célula de flujo. Nota: La iluminación del laser es dañino para el ojo desnudo y puede causar daños irreparables. Por favor, asegúrese de que el área iluminada se cubre completamente con una tapa opaca.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vale, R. D., Reese, T. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Novel+Force-Generating+Protein,+Kinesin,+Involved+in+Microtubule-Based+Motility.">Identification of a Novel Force-Generating Protein, Kinesin, Involved in Microtubule-Based Motility.</a> Cell. 42, 39-50 (1985).</li><li>Ray, S., Meyhofer, E., Milligan, R. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Follows+the+Microtubule's+Protofilament+Axis.">Kinesin Follows the Microtubule's Protofilament Axis.</a> Journal of Cell Biology. 121, 1083-1093 (1993).</li><li>Dennis, J. R., Howard, J., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+shuttles:+directed+motion+of+microtubules+along+nanoscale+kinesin+tracks.">Molecular shuttles: directed motion of microtubules along nanoscale kinesin tracks.</a> Nanotechnology. 10, 232-236 (1999).</li><li>Kawamura, R., Kakugo, A., Osada, Y., Gong, J. 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H., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifetime+of+biomolecules+in+hybrid+nanodevices.">Lifetime of biomolecules in hybrid nanodevices.</a> Nanotechnology. 15, S540-S548 (2004).</li><li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry.">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> EMBO Journal. 20, 5101-5113 (2001).</li><li>Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+and+its+mutants+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 73, 2782-2790 (1997).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este trabajo, presentamos un sistema activo de nanoescala que uno mismo arma débil enlace bloques para la construcción de su propia pista. Como se muestra en la figura 1, deslizamiento de microtúbulos se acumulan kinesin motores de solución y depositar en la superficie. Los motores de quinesina siguen en la estela de los microtúbulos por un corto período de tiempo antes de volver a la solución. Así, en este experimento, kinesin motores alternativos entre 3 Estados:
(1) un estado de solo-limite de microtúbulos: esto es cuando una quinesina se une primero a un microtúbulo. Existe en equilibrio con el estado (2).
(2) un estado de doble destino: en este caso, un kinesin solo limite de microtúbulos también une a la superficie a través de su su-etiqueta. Este estado de doble enlazado permite propulsión de microtúbulos.
(3) un solo Estado de la superficie-limita: una quinesina doble enlazado que ha caminado el extremo de los microtúbulos y no todavía problema desorbida de la superficie se encuentra en este estado. Estos motores pueden observarse en la figura 1 (canales verdes y combinados): que se extienden detrás de la cola de los microtúbulos para varios micrómetros y constituyen su sendero decreciente.
El paso más crítico de este protocolo es la formación de la superficie de la diapositiva. No sólo usa productos químicos peligrosos, pero también permite que el PEG-PPG-PEG funcionalizado con el grupo NTA para cubrir la superficie, que luego permite la quinesina enlazar reversible a la superficie. Otro paso importante es sellar la celda de flujo con grasa. Esto permite la proyección de imagen prolongada sin el líquido en la célula de flujo evaporación.
Las principales modificaciones a esta técnica consisten en cambiar la concentración de microtúbulos y quinesina concentración concentración de ATP. Concentración de microtúbulos se cambia el número de microtúbulos en la superficie de deslizamiento. Concentración de quinesina se cambia el número de moléculas de quinesina que pueden unirse a los microtúbulos. Sin embargo, el aumento de la concentración de quinesina sobre las cantidades ya definidas en este experimento podría aumentar fluorescencia del fondo, lo que es más difícil ver los senderos kinesin dejó deslizamiento de microtúbulos. Mientras tanto, reducir las concentraciones de ATP a 10 μm se reducir considerablemente la velocidad de deslizamiento de microtúbulos. Si se desea este efecto, es necesario utilizar un sistema de fosfocinasa y creatina fosfatasa la regeneración de ATP.
Una posible limitación de esta técnica es que, debido al contenido de grandes kinesin activo del sistema, el ATP puede ser consumido rápidamente, y experimentos pueden durar menos de una hora en ciertas condiciones. Por ejemplo este sería el caso si uno utiliza una concentración más alta de quinesina doble y cinco veces mayor concentración de microtúbulos que lo que se presenta en el presente Protocolo.
En nuestro anterior trabajo18, hemos estudiado la distribución espacial de los motores de quinesina a lo largo de los microtúbulos, demostrando que el deslizamiento de microtúbulos acumulan kinesin motores de solución, resultando en un incremento de la densidad de los motores a lo largo de la longitud de la microtúbulos. También se encontró que la estabilidad del deslizamiento de los microtúbulos demostró una dependencia no lineal de la velocidad de concentración y microtúbulos de quinesina de solución.
El protocolo presentado allana el camino para un uso más eficiente de los motores de proteínas en sistemas de ingeniería de la nanoescala y para la investigación en el diseño de nanosistemas activos que se encuentran en equilibrio dinámico. Además, la naturaleza dinámica de este sistema le permite servir como un sistema modelo para el estudio de reemplazo de auto-sanación y dinámica de componentes moleculares, cerrando parte de la brecha entre estructuras diseñadas y naturales.

Las interacciones que rigen el comportamiento de nanosistemas activo siempre se han caracterizado por bonos de larga duración, casi irreversible1,2,3,4,5,6 ,7,8. Un ejemplo bien estudiado es el sistema de microtúbulos kinesin, donde Delta microtúbulos son propulsados por superficie-limita irreversiblemente kinesin motores1,2,3,4, 5. Sistemas en que los componentes son conectados reversiblemente entre sí han sido estudiado teóricamente9,10 y alcanzó en la macroescala11,12, pero escalar estos sistemas a la a nanoescala ha sido difícil. Una de las razones principales de esto es romperse y reformar los enlaces entre los componentes a menudo requiere un gran cambio en las condiciones ambientales. A pesar de que tales cambios han sido implementados en los últimos13,14,15, confían en modificar el propio sistema, en lugar de adaptarse a su entorno. Diseño de sistemas de escala molecular en que componentes montan continuamente y reorganizan en estructuras sin perturbar el ambiente general en que ocurren los experimentos se abrirá la puerta a la exploración de una amplia gama de comportamientos dinámicos 16 , 17.
Aquí, describimos y demostrar el protocolo detallado para crear dinámicamente montaje y desmontaje de sistema de funcionamiento a escala nanométrica. El sistema y su comportamiento general ha sido introducido anterior18: filamentos de microtúbulos son propulsadas por pistas del reversible motores de quinesina-1 superficie-limita. Estas proteínas motoras quinesina son reclutadas de la solución para ayudar a impulsar los microtúbulos, antes desorbing otra vez poco después. Una vez en solución, puede ser reclutados otra vez para impulsar un nuevo microtúbulo. En los últimos13,14,15, el rompimiento y la reforma de bonos requieren modificaciones ambientales; en contraste, el ambiente de la célula de flujo permanece sin cambios mientras que los motores de quinesina interactúan con la superficie.
Este protocolo ayudará a investigadores interesados (1) visualizar todos los pasos del Protocolo, y (2) ayudar con la solución de problemas de este tipo de análisis. Se ha derivado de los procedimientos descritos en Howard et al 199319.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>488 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX 488-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>642 nm laser</td>
			<td>Omicron Laserage</td>
			<td>LuxX&#160;642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755-500UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlorodimethylsilane solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40140-25ML</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34869-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse TI</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP rkin430</td>
			<td>Provided by George Bachand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0543-10KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanosine Triphosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8877-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Sigma Pharmaceuticals</td>
			<td>8089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1028-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A412</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Water Purification System</td>
			<td>Millipore Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel Sulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>656895-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1912-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F108-NTA</td>
			<td>Provided by Jennifer Neff and AllVivo Vascular</td>
			<td></td>
			<td>PEG-PPG-PEG-NTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic&#160;F-108</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542342-250G</td>
			<td>PEG-PPG-PEG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-403-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>T324</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin, HiLyte647-labeled</td>
			<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
			<td>TL670M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Ozone Procleaner</td>
			<td>BioForce Nanosciences</td>
			<td>PC440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;Puradisc syringe filters</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>WHA67840402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla 4.2 sCMOS Camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>sCMOS 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assembling molecular shuttles powered by reversibly attached kinesins

Este protocolo describe cómo crear lanzaderas moleculares kinesin-accionado con un acoplamiento débil y reversible de los kinesins a la superficie. En contraste con los protocolos anteriores, en este sistema, los microtúbulos reclutan proteínas motoras quinesina de solución y coloque sobre una superficie. A su vez, los kinesins facilitará el deslizamiento de los microtúbulos a lo largo de la superficie antes de desorbing hacia la solución a granel, así esté disponible para ser contratado otra vez. Este continuo montaje y desmontaje conduce al pulso de comportamiento dinámico del sistema, tales como la formación de senderos kinesin temporal por deslizamiento de microtúbulos.
Se describen varios métodos experimentales a lo largo de este experimento: espectrofotometría UV-Vis se utilizará para determinar la concentración de soluciones de reactivos, cubreobjetos primero ozono y radiación ultravioleta (UV) tratados y silanizada antes de ser montado en las células de flujo y la fluorescencia de la reflexión interna total se utilizará microscopia (TIRF) simultáneamente imagen motores kinesin y filamentos de microtúbulos.

En estos experimentos, se utilizó un 1.000 veces la dilución de los microtúbulos en la sección 1.3.2. La concentración de quinesina fue de 20 nM y la concentración de ATP fue de 1 mM. La proyección de imagen se realizó mediante microscopía TIRF. Deslizamiento de microtúbulos se fotografiada por separado de los motores de kinesin: microtúbulos eran visibles sobre la excitación con un 647 nm láser (figura 1, roja), y la quinesina GFP era visible cuando excitado con un láser 488 (figura 1, verde). El tiempo entre la excitación con la luz roja y verde fue inferior a 1 s. El tiempo entre fotogramas era que 10 microtúbulos s. muestran deslizamiento estable. Los microtúbulos media velocidad de deslizamiento es aproximadamente 800 nm/s. La densidad superficial de microtúbulos fue 400 mm-2. Pistas de kinesin (verde) parecen extenderse más allá del extremo de los microtúbulos (rojo) de varios micrómetros.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59068/59068fig1.jpg"> Figura 1: deslizamiento de microtúbulos impulsados por motores débilmente enlazado a la superficie kinesin. Como avanzar en microtúbulos, acumulan kinesin motores de solución. Estos motores se alternan entre dos Estados: solo ligadas a los microtúbulos y doble-limita a los microtúbulos y la superficie. Cuando un motor enlazado doble llega al final de los microtúbulos, el motor se quede atrás y desorbs lentamente de la superficie con una tasa de aproximadamente 0,1 s-1. Como resultado, senderos de quinesina motores permanecen detrás de los microtúbulos. Fila superior: canal rojo (microtúbulos). Fila del medio: canal verde (kinesin). Fila inferior: combinado rojo (microtúbulos) y verde (GFP-kinesin) canal. Barra de escala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59068/59068fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

Montaje de lanzaderas moleculares Powered by reversible conectado Kinesins

Presentamos un protocolo para construir lanzaderas moleculares, donde proteínas motoras quinesina adherido superficie propulsan microtúbulos teñir-etiquetados. Las interacciones débiles de los kinesins con la superficie permite su adhesión reversible a él. Esto crea un sistema de escala nanométrica que exhibe el dinámico montaje y desmontaje de sus componentes sin perder su funcionalidad.

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Este protocolo es significativo porque abre la puerta a una mayor investigación en el diseño de sistemas biológicos a nanoescala que están en equilibrio dinámico. Esta técnica llena parte de la brecha entre las estructuras diseñadas y naturales porque permite el estudio de lo que podríamos llamar, la autorreparación'o el reemplazo dinámico de componentes moleculares. El consejo más importante para probar esta técnica por primera vez es asegurarse de que el experimentador está siguiendo todos los protocolos de seguridad.En primer lugar, prepare las soluciones de stock como se describe en el protocolo de texto. Pipetear 21,8 microlitros de BRB80 Buffer en un pequeño tubo de micro centrífuga. Añadir 1 microlitro de la solución de material de cloruro de magnesio, 1 microlitro de la solución de material GTP y 1,2 microlitros de la solución de stock DMSO para terminar de preparar el tampón de crecimiento de microtúbulos.Para comenzar la polimerización de microtúbulos, agregue 6,25 microlitros de tampón de crecimiento de microtúbulos directamente en una alícuota de 20 microgramos de tubulina liofilizada;etiquetada para excitarse a 647 nanómetros. Vórtice a 40 RPS durante 5 segundos. Enfríe la alícuota sobre hielo durante 5 minutos.Luego, incubar a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Para iniciar la estabilización de microtúbulos, añada 5 microlitros de la solución de paclitaxel alícuota a 490 microlitros de tampón BRB80. Vortex la solución a 30 RPS durante 10 segundos.Una vez que haya terminados los 45 minutos de incubación de los microtúbulos, añadir 5 microlitros de esa solución a la mezcla BRB80, y paclitaxel, para crear la solución MT100. En primer lugar, añada 9,0 microlitros de la solución de caseína alícuota alícuo a 291 microlitros de tampón BRB80. Pipetear 83 microlitros de la solución de caseína BRB80 en un nuevo tubo de micro centrífuga de 6 mililitros.Añadir 1 microlitro de D-glucosa, glucosa oxidasa, catalasa, TDT, fosfato de creatina y fosfoquinasa. A continuación, agregue 1 microlitrotro de la solución de ATP a la solución de motilidad. Flick, o vórtice la alícuota para distribuir homogéneamente los productos químicos.A continuación, añadir 1 microlitro de solución de kinesina preparada a la solución de motilidad, de modo que la concentración final sea de 20 nanomolares. Agregue 10 microlitros de la solución MT100 a la solución de motilidad. Para las celdas de flujo, utilice un cubreobjetos grande y un cubreobjetos pequeño.Enjuague todos los cubreobjetos dos veces con etanol y dos veces con agua ultrapura. Sonicar los cubreobjetos lavados en agua ultrapura durante 5 minutos. A continuación, seque los cubreobjetos en un horno a una temperatura entre 50 y 75 grados centígrados.Utilice un limpiador de ozono UV para tratar un lado de cada cubreplo durante 15 minutos a temperatura ambiente y en condiciones atmosféricas normales. Usando pinzas, voltee cada cubreobjetos y use el ozono UV para tratar el lado no tratado también. Sonicar los cubreobjetos tratados en agua ultrapura durante 5 minutos.Luego, séquelos en un horno a una temperatura entre 50 y 75 grados centígrados. A continuación, no haga equipo de protección como se describe en el protocolo de texto. Sumerja cada cubreobjetos en solución salina durante 15 segundos.Lave los cubreobjetos dos veces en tolueno y tres veces en metanol. Utilice nitrógeno presurizado para secar los cubreobjetos. Una vez que los cubreobjetos estén secos, corte un trozo de cinta adhesiva de doble cara de 2 centímetros por 2,5 centímetros.Corte esta pieza por la mitad verticalmente en dos tiras de 1 centímetro por 2,5 centímetros. Coloque el cubreobjetos grande en un delicado limpiaparabrisas y pegue las tiras de cinta en él, a lo largo de los bordes para crear un área de 1 centímetro por 2,5 centímetros entre las piezas de cinta. Pegue el cubreobjetos pequeño en la parte superior de las tiras de cinta para terminar el conjunto de celdas de flujo.En primer lugar, fluya aproximadamente 20 microlitros de la solución PEG-PPG-PEG en la celda de flujo ensamblada. Deje que la solución absorba en la superficie durante 5 minutos, luego, intercambie esta solución con 20 microlitros de tampón BRB80 tres veces fluyendo el búfer. Flujo 20 microlitros de la solución de motilidad en la celda de flujo.Después de esto, selle los bordes de la celda de flujo con grasa para evitar la evaporación si el experimento planificado es más de una hora. Realice la toma de imágenes utilizando una microscopía de florescencia interna total de tipo objetivo. Coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo.A continuación, coloque la celda de flujo en la plataforma del microscopio. Y subir el objetivo hasta que haya contacto entre el aceite en el objetivo y la celda de flujo. Utilice el sistema de cubierta de enclavamiento del microscopio para bloquear el escape de toda la luz láser.A continuación, encienda el láser y concéntrese en la superficie inferior de la celda de flujo utilizando un láser de 642 nanómetros para crear imágenes de los microtúbulos, y un láser de 488 nanómetros para crear imágenes de los motores de kinesina GFP. Graba las imágenes o vídeos de interés. Las imágenes se pueden grabar mientras haya motilidad en la celda de flujo.En este estudio, se presenta un sistema activo de nanoescala, que se automonta bloques de construcción débilmente vinculantes para construir su propia vía. Mediante la microscopía de timón, los microtúbulos deslizantes se visualizan por separado de los motores de kinesina. Los microtúbulos son visibles al excitar con un láser de 647 nanómetros.Y la kinesina GFP son visibles cuando se excita con un láser de 488 nanómetros. El tiempo entre la excitación y la luz roja y verde fue de menos de un segundo. Como se puede ver, los microtúbulos deslizantes acumulan motores de kinesina a partir de la solución y los depositan en la superficie.Los motores de kinesina permanecen a raíz de los microtúbulos durante un corto período de tiempo antes de volver a la solución. Es muy importante tener la concentración correcta de reactivos en el antifado de la solución de motilidad, de lo contrario, el blanqueo fotográfico haría que el experimento fallara. Esta técnica allana el camino para un uso más eficiente de los motores proteicos en sistemas de ingeniería a nanoescala.Por lo tanto, permite el diseño y estudio de nanoestructuras más complejas.

Research

JoVE Journal

Engineering

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