Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

نشكر الاتحاد الأوروبي (صندوق الاتحاد الأوروبي POCI/01/0145/FEDER/007728 من خلال Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) والصناديق الوطنية (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia and Ministério da Edção e Ciência) under the اتفاقية الشراكة PT2020 UID/QUI/50006/2019 والمشاريع (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. زمالات FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). وقد تم دعم هذا العمل من قبل Compagnia S. Paolo, Turin, Italy (Project 2017.0526) ووزارة الصحة (المشروع 5x1000 و 2015 و 2016; البحث الحالي 2016). ونشكر بشدة الدكتورة تيريزا لوبيز - أرياس الجبل الأسود (جامعة ترينتو، مختبرات تدريس العلوم التجريبية) على مساعدتها في تسجيل الفيديو.

1. بناء سلالات الخميرة مراسل ADE2 أو LUC1 التي تحتوي على RE محددة (yAFM-RE أو yLFM-RE)
<ol><li>خط yAFM-ICORE أو yLFM-ICORE سلالة12،14 (ICORE = I ، ISce-I endonuclease تحت GAL1 المروج؛ CO = العداد اختيار URA3؛ RE = مراسل KanMX4 منح مقاومة كانامايسين; الجدول1) من مخزون الجلسرين ب?...

وقد أثبتت الاختبارات القائمة على الخميرة مفيدة للتحقيق في مختلف جوانب وظائف البروتين P53. وهذه الاختبارات حساسة بشكل خاص لتقييم إمكانية نقل P53 نحو المتغيرات من المواقع المستهدفة RE، بما في ذلك تقييم تعدد الأشكال الوظيفية. استخدام الصحفيين اللون، فضلا عن تصغير من اللوسيفيراز التصاق يؤدي إلى...

النسخ هو عملية معقدة للغاية تنطوي على تنظيم ديناميكي ومكاني وزمني لعوامل النسخ (TFs) والعوامل المساعدة لتوظيف وتعديل بوليميراز الحمض النووي الريبي في مناطق الكروماتين استجابة لمحفزات محددة1 . معظم TFs، بما في ذلك الإنسان P53 قمع الورم، تعترف عناصر محددة cis-acting في شكل تسلسل الحمض النووي تسمى عناصر الاستجابة (REs)، والتي تتكون من زخارف فريدة من نوعها واحدة (أو متعددة) ~ 6-10 النيوكليوتيدات طويلة. ضمن هذه الزخارف، قد تظهر المواقفالفردية درجات مختلفة من التباين 2، وعادة ما تلخصها مصفوفات وزن الموقف (PWM) أو الشعارات3،4.
الخميرة S. cerevisiae هو نظام نموذج مناسب لدراسة جوانب مختلفة من البروتينات البشرية من خلال الاختبارات المكملة، والتعبير خارج الرحم، والاختبارات الوظيفية، حتى عندما يكون جين الخميرة التقويمية غير موجود5، 6 , 7.نظرا للحفظ التطوري للمكونات القاعدية من نظام النسخ8، يمكن للعديد من TFs البشرية (عندما أعرب عن هافيموضعي في خلايا الخميرة) تعديل التعبير عن جين مراسل من خلال العمل من خلال المروجين هندسيا ل تحتوي على REs المناسبة. يتميز نظام نموذج النسخ المعروض هنا لP53 الإنسان بثلاثة متغيرات رئيسية يمكن تعديل آثارها: 1) طريقة التعبير ونوع P53، 2) تسلسل RE السيطرة على النسخ P53 تعتمد، و 3) نوع من [برسّري] مورثة (شكل[1ا]).
وفيما يتعلق بطريقة التعبير P53، يسمح S. cerevisiae باختيار المروجين اللاإمتزاقين أو الكبتأو التأسيسية9و10و11. على وجه الخصوص، المروج GAL1 inducible يسمح القاعدية (باستخدام raffinose كمصدر للكربون) أو متغير (عن طريق تغيير كمية الجالاكتوز في وسائل الإعلام) التعبير عن TF في الخميرة. في الواقع، يمثل التعبير القابل للضبط بدقة تطورا حاسما لدراسة ليس فقط P53 نفسها ولكن أيضا غيرها من البروتينات الأسرة P5312،13.
وفيما يتعلق بنوع REs التي تسيطر على التعبير المعتمد على P53، يسمح S. cerevisiae ببناء سلالات مراسل مختلفة تمتلك اختلافات فريدة في RE من الاهتمام في خلفية غير ذلك من السلالات المسببة للسرطان. يتم التوصل إلى هذا الهدف باستخدام التكيف مع نهج تحرير الجينوم تنوعا بشكل خاص وضعت في S. سيريفيسياي, ودعا ديليتو بيرفيتو12,14,15,16.
وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام جينات مراسل مختلفة (أي URA3، HIS3، وADE2) لتقييم نوعي او كمي للأنشطة النسخية للTFs البشرية في S. cerevisiae، ولكل منها ميزات محددة يمكن أن أن تكون مصممة لتلبية الاحتياجات التجريبية17،18،19،20،21. التعبير عن هذه الجينات مراسل يمنح uracil, الهستيدين, وprototrophy الادينين, على التوالي. مراسل URA3 لا يسمح بنمو الخلايا في وجود 5-FOA كذلك، وبالتالي يمكن أن يكون اختيار مضاد. نظام مراسل ADE2 لديه ميزة أنه، إلى جانب اختيار التغذية، فإنه يسمح بتحديد خلايا الخميرة التي تعبر عن نوع البرية (أي، وظيفية على التعبير ADE2) أو متحولة (أي، غير وظيفيةعلى ADE2 ) P53 من لون المستعمرة.
على سبيل المثال، خلايا الخميرة التي تعبر عن الجين ADE2 تولد مستعمرات بيضاء الحجم عادة على لوحات تحتوي على كميات محدودة من الأينيبين (2.5-5.0 ملغ / لتر)، في حين أن تلك التي سيئة أو لا تنسخ تظهر على نفس لوحة الأحمر الأصغر (أو الوردي) المستعمرات. ويرجع ذلك إلى تراكم وسيط ة في مسار الأدينين التركيبي الحيوي (أي P-ribosylamino-imidazole، الذي كان يسمى سابقا أمينو-إيميدازول ريبوتيد أو AIR)، والتي يتم تحويلها لتشكيل صبغة حمراء. وقد تم استبدال الجينات مراسل ADE2 على أساس اللون النوعي مع الكمية اليراعة Photinus pyralis (LUC1)12،22. في الآونة الأخيرة، تم الجمع بين مراسل ADE2 مع مراسل lacZ في سهلة لتسجيل، شبه كمية، واختراق مزدوج ة يمكن استغلالها لتصنيف المسوخ P53 وفقا لمستواهم المتبقي من الوظائف 23.
كما تم استخدام مراسلي الفلورسنت مثل EGFP (البروتين الفلورسنت الأخضر المعزز) أو DsRed (ديسكوسوما sp. بروتين الفلورسنت الأحمر) للتقييم الكمي لنشاط التنشيط المرتبط بجميع الطفرات الخاطئة المحتملة في TP53 تسلسل الترميز24. وأخيراً، أدت فرصة الجمع بين المروجين القابلة للضبط للتعبير الأليل P53 مع سلالات الخميرة المسببة للسرطان المختلفة لجين RE و/أو المراسل إلى تطوير مصفوفة بيانات تولد تصنيفاً منقحاً للربط بالسرطان وللجرثومة [ترجم جب53 قدم/الولايات-المتحدة2-و/ الولايات-المتحدة]
وتستخدم النهج المذكورة أعلاه لقياس النشاط النسخي للبروتين P53. ومع ذلك، فإن التعبير عن البرية من نوع P53 في الخميرة S. سيريفيسياي28 وSchizosaccharomyces pombe29 يمكن أن يسبب تأخر النمو، والتي ارتبطت مع خلية دورة اعتقال28،30 أو خلية الموت31. في كلتا الحالتين، يتم تشغيل تثبيط نمو الخميرة عن طريق التعبير P53 عالية، وقد تم ربط هادىر مع التشكيل النسخي المحتمل لجينات الخميرة الذاتية المشاركة في نمو الخلايا. دعم هذه الفرضية، وفقدان وظيفة متحولة P53 R273H لم تتداخل مع نمو خلية الخميرة عندما أعرب عنها في مستويات مماثلة كما البرية من نوع P5332. وعلى العكس من ذلك، تسبب التعبير في الخميرة من متحولة سامة P53 V122A (المعروف عن ارتفاع النشاط النسخي مقارنة مع البرية من نوع P53) تأثير مثبط النمو أقوى من البرية من نوع P5332.
بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن MDM2 البشرية كانت قادرة على تثبيط النشاط النسخي P53 الإنسان في الخميرة، وتعزيز في كل مكان والتدهور اللاحق33. وبناء على ذلك، أظهرت قدرة الإنسان MDM2 وMDMX لمنع تثبيط نمو الخميرة الناجمة عن P5332،34. في دراسة إضافية، تم تحديد ارتباط بين النشاط النسخي P53 ومستويات التعبير الأكتين، مع تحديد P53 RE المفترضة في المنبع على جين ACT1 في الخميرة32. باستمرار، تم تعزيز التعبير الأكتين من قبل البرية من نوع P53 وحتى أكثر من ذلك من قبل P53 V122A، ولكن ليس من قبل متحولة P53 R273H. وعلى العكس من ذلك، انخفض تعبير الأكتين بواسطة P53 في الوجود المشترك لمثبطات P53 MDM2، MDMX، أو pifithrin-α (مثبط جزيء صغير من النشاط النسخي P53)، بما يتفق مع النتائج على أساس حقن الخميرة النمو. الأهم من ذلك، أنشأت هذه النتائج علاقة بين تثبيط النمو الناجم عن P53 ودرجة نشاطها في الخميرة، والتي تم استغلالها أيضا لتحديد ودراسة الجزيئات الصغيرة تحوير وظائف P5328،34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

وقد سمح الاستنتاج بأن بروتين P53 الثدييات المعروفة بمثابة عامل النسخ (TF) في الخميرة S. سيريفيسياي لتطوير تجارب وظيفية مختلفة لدراسة آثار 1) موقع ملزم [أي عنصر الاستجابة (RE)] المتغيرات تسلسل على P53 خصوصية التنشيط أو 2) الطفرات TP53، العوامل المساعدة التي أعرب عنها، أو جزيئات صغيرة على نشاط التعطيل P53. وقد تم تطوير مختلف التطبيقات البحثية الأساسية والترجمة. تجريبيا، هذه النهج استغلال اثنين من المزايا الرئيسية لنموذج الخميرة. فمن ناحية، تتيح سهولة تحرير الجينوم البناء السريع لأنظمة المراسلين النوعية أو الكمية من خلال استغلال السلالات المسببة للسرطان التي لا تختلف إلا على مستوى P53-RE محدد للتحقيق في خصوصية التسلسل للاعتماد على P53 التفعيل. من ناحية أخرى، فإن توافر أنظمة منظمة للتعبير خارج الرحم P53 يسمح بتقييم التنشيط في مجموعة واسعة من التعبير البروتين. يتم مراجعة هذا التقرير على نطاق واسع النظم التي تستند إلى الجينات مراسل اللون، لوسيفيراز، ونمو الخميرة لتوضيح خطواتها المنهجية الرئيسية وتقييم قوة التنبؤ ية. وعلاوة على ذلك، يمكن استغلال التنوع الشديد لهذه النهج بسهولة لدراسة مختلف TFs بما في ذلك P63 و P73، وهما عضوان آخران في عائلة الجينات TP53.

تشييد فى الرّهة الثانية أو LUC1 مراسل سلالات الخميرة
وقد تم تكييفdelitto perfettoapproach12،14،15،16 لتمكين بناء سلالات ا...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

عرضت هنا أربعة بروتوكولات لبناء واستغلال الخميرة Saccharomyces cerevisiae سلالات مراسل لدراسة الإنسان P53 إمكانية التنشيط، والآثار من الطفرات المرتبطة بالسرطان المختلفة، والبروتينات المتفاعلة التي أعرب عنها، و آثار جزيئات صغيرة محددة.

الخميرة كهيكل لتطوير الاختبارات الوظيفية لدراسة P53 الإنسان

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

مرحبا، اسمي بارتولوميو بوسكو، وأنا طالب دكتوراه في مختبر الشبكة النسخية في مركز البيولوجيا التكاملية في جامعة ترينتو في إيطاليا. كما تعلمون، النسخ هو عملية معقدة للغاية تنطوي على تنظيم المكانية والزمانية من عامل النسخ والمحسن. معظمها، بما في ذلك P53 الإنسان، تعترف عناصر محددة رابطة الدول المستقلة بالنيابة، وتسمى عناصر الاستجابة، وملزمة على هذا التسلسل الحمض النووي مطلوب لتعديل النسخ من الجينات المستهدفة.في هذا العمل، نود أن تظهر لك بروتوكول لدراسة P53 تسلسل محددة في وظائف transactivation باستخدام الخميرة كنظام نموذج كبروتين في جين مراسل اللون أو luciferase أو على الكم من نمو الخلايا لتسليط الضوء على الخطوات التجريبية الرئيسية وبراعة هذه النهج. البروتوكول الأول، بناء سلالات الخميرة مراسل التي تحتوي على عنصر استجابة P53 محددة المنبع من adenine-2 أو الجين luciferase اليراعات. لبناء سلالة مراسل، اتبع أولا الخطوات 1.1 من خلال 1.15 لتحويل خلايا الخميرة مع oligonucleotides تستهدف المنطقة المروج المطلوب.ويستند التحول على بروتوكول الليثيوم القياسية القائمة على خلات. مرة واحدة تظهر المحولات على لوحات 5-FOA، وعادة بعد ثلاثة أيام من الحضانة في 30 درجة، طبق النسخة المتماثلة لهم على لوحات YPDA غير انتقائية وأيضا على لوحات YPDA التي تحتوي على G418، ووضع علامات كل لوحة لتسهيل المقارنة اللاحقة. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة.في اليوم التالي، حدد سلالات المراسل المرشح من المستعمرات الحساسة G418 ولكنها نمت على لوحات YPDA. خط المستعمرات التي تم تحديدها على لوحة YPDA جديدة للحصول على عزل مستعمرة واحدة ، والسماح لهم تنمو لمدة يومين في 30 درجة. تحقق من التكامل الصحيح لعنصر الاستجابة P53 المطلوب، تنفيذ تفاعل PCR مع الشروط المذكورة في الخطوة 1.20.تحميل aliquot من المنتج PCR على هلام agarose للتحقق من طول أمبيركون الصحيح قبل تسلسل سانجر. البروتوكول الثاني، نقدم مثالا على كيفية تقييم P53 قدرة تنشيط البروتين باستخدام نوعية اللون القائم على المقايسة الخميرة أدينين-2. تحويل خلايا الخميرة مع ناقلات التعبير P53 بعد نفس بروتوكول الليثيوم القائم على خلات الموصوفة في القسم الأول.مستعمرات محولة خميرة واحدة متتالية، تصل إلى ستة لكل لوحة، على طبق انتقائي جديد، والسماح لهم بالنمو بين عشية وضحاها عند 30 درجة. في اليوم التالي، وذلك باستخدام المخمل العقيمة، طبق طبق المتماثلة الشرائط على لوحات انتقائية جديدة تسمح لتقييم النمط الظاهري اللون، أي لوحات انتقائية تحتوي على كمية محدودة من أدينين.احتضان في 30 درجة لمدة ثلاثة أيام. يمكن أن تكون نفس الشرائط طبقنة طبق الأصل عدة مرات. البروتوكول الثالث، ونحن الآن تقديم مثال على تقييم P53 قدرة تنشيط البروتين باستخدام المقايسة الخميرة LUC1 الإنارة الكمية القائمة.أولاً، تحويل خلايا الخميرة مع ناقلات التعبير P53 التالية، مرة أخرى، بروتوكول الليثيوم القائم على خلات الموصوفة في القسم الثاني. التصحيح التحويلات واحدة على لوحات انتقائية جديدة تحتوي على الجلوكوز كمصدر للكربون، والسماح لهم تنمو في 30 درجة بين عشية وضحاها. لكل نوع التحويل، جعل خمسة إلى سبعة بقع مختلفة.بعد النمو بين عشية وضحاها، resuspend كمية صغيرة من الخلايا باستخدام مسواك معقمة أو تلميح ماصة في المتوسطة الانتقائية الاصطناعية التي تحتوي على رافينوز كمصدر للكربون. يجب أن يكون تعليق الخلايا هذه كثافة بصرية عند 600 نانومتر حول 0.4 ويمكن تقسيمها بعد ذلك في لوحات متعددة من 96 بئرًا للاحتضان في درجات حرارة مختلفة أو علاجات أو تعريض الخلايا إلى كمية مختلفة من galactose لتنشيط تعبير P53. لقياس نشاط مراسل اليراعة ، ونقل 10 إلى 20 ميكرولترات من تعليق الخلية من لوحة شفافة 96 جيدا في لوحة بيضاء 384 جيدا ، وخلط الخلايا مع حجم متساو من العازلة تحلل ، احتضان لمدة 10 ، 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر.إضافة 10، 20 ميكرولترات من الركيزة لوسيفراز اليراعات. وقياس وحدات الضوء باستخدام قارئ لوحة متعددة الأطراف. قياس أيضا الكثافة البصرية للثقافات في لوحة 96-جيدا.البروتوكول الرابع، نقدم الآن مثالاً على كيفية استغلال تثبيط نمو الخميرة الناجمة عن P53. تحويل خلايا الخميرة مع ناقلات التعبير P53، أو cotransform لهم ناقلات التعبير إلى coexpress P53 واحد من العوامل المساعدة، مثل MDM2، بعد، مرة أخرى، بروتوكول الليثيوم القائم على خلات الموصوفة في القسم الأول. تنمو الخلايا المحولة في متوسطة انتقائية إلى كثافة بصرية واحدة تقريبا.وتمييعها إلى 0.05، وإضافة جزيء مختار إلى التركيز المناسب. احتضان الخلايا في 30 درجة على شاكر لمدة 42 ساعة. ثم، البذور 100 ميكرولترات من ثقافة خلية الخميرة في لوحات متوسطة انتقائية الحد الأدنى.احتضان لمدة يومين في 30 درجة. يمكن التحقق من التكامل الصحيح في مجال إعادة استخدام الموارد في مكان كاسيت ICORE بواسطة PCR مستعمرة ، بدءا من كمية صغيرة من الخلايا من استنساخ الخميرة المرشحة واستخدام التمهيديات الموصوفة في الجدول الثالث لتضخيم المَسَع المستهدف. ويمكن بعد ذلك فحص منتجات PCR، وهي عبارة عن نطاق من حوالي 500 نوكليوتيدات، بواسطة تسلسل سانجر لتأكيد تسلسل الموقع الجينومي المحرر لوجود تسلسل عناصر الاستجابة P53 الصحيح.سلالة المراسل جاهزة للاستخدام في التشايس الوظيفي. لتقييم قدرة P53 تنشيط البروتين، والتحقق من لون مستعمرات الخميرة. على سبيل المثال، نقدم مقارنة بين P53 من النوع البري وR175H وR282W المسوخ باستخدام اثنين من المراسلين مختلفة، P21-5-prime و PUMA، ودرجتين حرارة مختلفتين، 30 درجة و 37 درجة.ومن المثير للاهتمام، في حين R175H هو فقدان وظيفة P53 أليل، المستعمرات الحمراء في جميع الظروف، R282W يظهر حساسية درجة الحرارة مع نشاط التواليب المتبقية في 30 درجة، مما أدى إلى مستعمرات بيضاء، ولكن فقدان النشاط في 37 درجة، مما أدى إلى المستعمرات الحمراء أو الوردية. يتم عرض مجموعة بيانات موسعة في الشكل الثاني B.Wild من نوع P53 في أربعة أليل متحولة تم اختبارها من أجل تنشيطها باستخدام 10 سلالات مراسل عنصر استجابة P53 مختلفة ، وثلاث درجات حرارة ، ومستويات التعبير التأسيسي. يتم تلخيص النتائج في رمز اللون الذي يذكر نمط ظاهري اللون مستعمرة الخميرة.تحتفظ أليل متحولة P53 K139E بنشاط جزئي وهي حساسة للبرد. على سبيل المثال، المستعمرات حمراء في سلالة مراسل GADD45 في 24 و 30 درجة، لكنها بيضاء في 37 درجة. هنا، نقدم مثالا للنتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الطريقة، مقارنة خصوصية transactivation من الخميرة الإنسان وC.elegans P53.يتم التعبير عن النتائج في الرسم البياني الشريطي على أنها وحدات إضاءة نسبية متوسطة مع خطأ قياسي من أربعة نسخ متماثلة. وقورنت خمسة عناصر مختلفة للاستجابة من نوع P53. تم اختبار ثلاثة مستويات مختلفة من التعبير البروتين P53 من خلال تغيير تركيز جالاكتوز في الوسط.تظهر تقويمات P53 اثنين خصوصية مختلفة بشكل ملحوظ. ويتجلى ذلك في النتائج مع عناصر استجابة ced13 وV1 التي تشترك في نفس التسلسل، باستثناء وجود أو عدم وجود 28-نوكلييوتيدات الفضاء. يسلك P53 الإنسان أكثر من ذلك بكثير transactivation مع موقع الربط V1، في حين C.elegans P53 يظهر العكس.النتائج مستقلة عن مستوى التعبير P53 تحت المروج galactose غير قابل للتكبوس. قياس نمو الخميرة من خلال عد عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها في 100 microliters الثقافة قطرات. حساب تأثير إعادة تنشيط متحولة من المركبات النظر في نمو البرية من نوع P53 التعبير عن الخميرة باعتبارها أقصى تأثير ممكن، تعيين إلى 100٪، في حين أن نمو الخلايا التي تعبر عن P53 متحولة تمثل مستوى صفر من إعادة التنشيط.في هذا المثال، ينولين-3a يخفف من تثبيط P53 من نوع البرية الناجمة عن coexpression MDM2، في حين PhiKan083 جزئيا إعادة تنشيط Y220C P53 متحولة. في كلتا الحالتين، وهذا يؤدي إلى انخفاض P53 تعتمد على نمو الخميرة. وقد أثبتت الخلايا القاعدية الخميرة مفيدة للتحقيق في القيم, جوانب وظائف البروتين P53.البروتوكول الموصوف في هذا العمل حساس بشكل خاص لتقييم إمكانية التنشيط من النوع البري أو المرتبط بالسرطان متحولة P53 إلى المتغيرات من المواقع المستهدفة. علاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا النهج لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تؤثر على وظائف P53 ودراسة التفاعل P53 مع العوامل المساعدة. استخدام المراسلين اللون، ومصغرة من لوسيفراز، فضلا عن نتيجة اختبار تثبيط النمو في فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير المقايسة يحتمل أن تكون قابلة لفحص المكتبة الكيميائية.وأخيراً، يمكن بسهولة اعتماد النظام الموصوف في هذا العمل بدراسة عوامل نسخ أخرى خاصة بالتسلسل.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

كيفية دراسة بدروم غشاء تصلب بمثابة الزناد البيوفيزيائية في سرطان البروستاتا وعلوم الأمراض الأخرى ذات الصلة العمر أو الأمراض الاستقلابية

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

كولون-26 سرطان الفأر نموذجا لدراسة سرطان دنف الحاملة للورم

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

فحوصات التصوير خلية يعيش بدراسة الدماغ جليوبلاستوما ورم الخلايا الجذعية الهجرة والغزو

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

الثقافات Organoid البروستاتا كاداات لترجمه الأنماط الجينية والتشكيلات الجانبية إلى الاستجابات الدوائية

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

مجتمعة الضربة القاضية المشروطة وتكييف المجال تشكيل الفحص لدراسة جين الجذعية المرتبطة بالخلايا الجذعية سرطان المعدة المستمدة من المريض

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

مراقبة تجميع eIF4F من خلال قياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

استخدام أداة E1A Minigene لدراسة تغييرات الربط مرنا

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

سير عمل الفحص السريع لتحديد العلاج المركب المحتمل ل GBM باستخدام الخلايا الجذعية الدبقي المشتقة من المريض

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

ماماري الظهارية والبطانية الخلايا كرويدات كنموذج وظيفي محتمل في المختبر لأبحاث سرطان الثدي

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...