Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
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我们感谢欧洲联盟(FEDER基金POCI/01/0145/FEDER/007728通过竞争歌剧因素方案)和国家基金(FCT/MEC,发展基金和埃杜卡奥省)下伙伴关系协议 PT2020 UID/QUI/50006/2019 和项目 (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581。FCT研究金:SFRH/BD/96189/2013(S. Gomes)。这项工作得到了意大利都灵的Compagnia S. Paolo(项目 2017.0526)和卫生部的支持(项目 5x1000、2015 和 2016;2016 年当前研究)。我们深切感谢特雷莎·洛佩斯-阿里亚斯·黑山博士(特伦托大学实验科学教学实验室)协助进行录像。

1. 构建含有特定RE(yAFM-RE或yLFM-RE)的ADE2或LUC1报告酵母菌株
<ol><li>在GAL1促进剂下,可分得 yAFM-ICORE 或 yLFM-ICORE 菌株 12、14(ICORE = I,ISce-I 内分糖;CO = 计数器可选URA3;RE = 记者KanMX4授予卡那霉素耐药性;表 1)从15%甘油储存在-80°C在YPDA琼脂板上(表2)。让它在30°C下生长2-3天。</li>
	<li>从新鲜板(不超过3周)取?...

基于酵母的检测已被证明对研究P53蛋白功能的各个方面是有用的。这些测定对于评估P53对RE目标位点的变异性(包括功能多态性评价)特别敏感。彩色检测器的使用以及荧光酶测定的小型化,可产生成本效益和相对可扩展的测定。此外,生长抑制试验可能适用于化学库筛选,通过测量吸收性自动定量酵母细胞活力。虽然由于ABC运输机的细胞壁和作用而限制渗透性被认为是使用酵母进行药物筛选的一个限制...

转录是一个极其复杂的过程,涉及对染色质区域RNA聚合量的招募和调制的转录因子(TF)和辅助因子的动态、空间和时间组织,以响应特定的刺激1.大多数TF,包括人类P53肿瘤抑制剂,以称为反应元素(REs)的DNA序列的形式识别特定的cis-行为元素,这些元素由单(或多种)独特的图案+6-10核苷酸长组成。在这些主题中,个别位置可能显示不同程度的变异性2,通常用位置权重矩阵 (PWM) 或徽标 3、4 汇总。
酵母S.cerevisiae是一个合适的模型系统,通过补充测定、异位表达和功能测定来研究人类蛋白质的不同方面,即使不存在正交酵母基因56,7.由于转录系统8的基础成分的进化保存,许多人类TF(当在酵母细胞中异位表达时)可以通过工程的启动子来调节报告基因的表达。包含适当的 R。此处为人类 P53 提供的转录模型系统具有三个主要变量的特征,其效果可以调制:1) P53 的表达方式和类型,2) RE 序列控制 P53 依赖转录,3) 类型记者基因 (图 1A).
关于P53表达的方式,S.cerevisae允许选择诱导的、可抑制的或构成的促进者9,10,11。特别是,诱导的GAL1启动子允许酵母中的TF的基底(使用拉菲诺作为碳源)或变量(通过改变介质中的乳糖量)表达TF。事实上,精细可调的表达代表了一个关键的发展,不仅P53本身,但也研究其他P53家族蛋白质12,13。
关于控制P53依赖性表达的RE类型,S.cerevisae允许构建不同的报告器菌株,这些菌株在其它异源背景中具有感兴趣的RE的独特差异。这一目标是通过适应一种特别通用的基因组编辑方法,在S.cerevisiae开发,称为delitto perfetto 12,14,15,16。
此外,不同的报告基因(即URA3、HIS3和ADE2)可用于定性和定量评估S.cerevisae中人类TF的转录活动,每个基因具有特定特征, 应以适应实验需要17,18,19,20,21。这些报告基因的表达分别赋予了尿原体、组氨酸和阿丁原体。URA3报告器不允许在存在5-FOA的情况下细胞生长,因此可以反选择。ADE2报告器系统的优点是,除了营养选择外,它还允许识别表达野生型(即ADE2表达功能)或突变体(即ADE2上不起作用)的酵母细胞) P53 来自殖民地颜色。
例如,表达ADE2基因的酵母细胞在含有限制定量的阿丁鱼(2.5-5.0mg/L)的板上产生正常大小的白色菌落,而那些质量差或没有转录的细胞则在同一块板上出现较小的红色(或粉红色)殖民地。这是由于在脱胶生物合成通路(即P-ribosylamino-imidazole,以前称为氨基-依米达索核糖酸或AIR)中积累的中间体,该中间体被转换成红色颜料。基于定性颜色的ADE2报告基因已被用定量的萤火虫Photinuspyralis(LUC1)12、22所取代。最近,ADE2记者与lacZ记者进行了一个易于评分、半定量、双报机分析的合并,可以根据P53突变体的残余功能水平对其进行子分类。23.
荧光报告机,如EGFP(增强的绿色荧光蛋白)或DsRed(迪斯科索玛sp.红色荧光蛋白)也被用于定量评估与所有可能的误感突变相关的变活活性。TP53编码序列24.最后,P53等位基因表达的可调启动子与RE和/或报告基因的异源酵母菌株相结合的机会,导致开发一个数据矩阵,生成癌症相关和生殖系的精细分类突变P53等位电25,26,27 。
上述方法用于测量P53蛋白的转录活性。然而,在酵母S.cerevisiae28和Schizosaccharis pombe29中野生型P53的表达可能导致生长迟缓,这与细胞周期阻滞28、30或细胞死亡31。在这两种情况下,酵母生长抑制由高P53表达触发,并与参与细胞生长的内源酵母基因的潜在转录调制相关。支持这一假设,功能丧失突变体P53 R273H在以与野生型P5332相似的水平表示时,不会干扰酵母细胞的生长。相反,在酵母中表达的有毒突变体P53 V122A(已知比野生型P53的转录活性更高)比野生型P533产生更强的生长抑制作用。
此外,证明人类MDM2能够抑制人类P53转录活性在酵母,促进其普及和随后的降解33。因此,人类MDM2和MDMX抑制P53诱导酵母生长抑制的能力被证明为32,34。在另外一项研究中,建立了P53转录活性与反应性表达水平之间的相关性,在酵母32中的ACT1基因上鉴定了假定的P53 RE上游。始终,行为蛋白表达由野生型P53增强,P53 V122A更增强,但突变P53 R273H更增强。相反,P53的活性素表达在P53抑制剂MDM2、MDMX或pifithrin-α(P53转录活性的小分子抑制剂)的共存在中减少,与基于酵母生长测定的结果一致。重要的是,这些结果建立了P53诱导的生长抑制与其在酵母中的活性程度之间的相关性,也用于识别和研究调节P53功能的小分子28,34,35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

发现著名的哺乳动物P53蛋白可以作为酵母S.cerevisae的转录因子(TF),使得开发不同的功能测定来研究1结合位点的影响[即反应元素(RE)]。P53转活特异性或2)TP53突变、共表达辅助因子或P53转活活性小分子的序列变异。开发了不同的基础研究和翻译研究应用。在实验中,这些方法利用了酵母模型的两个主要优点。一方面,基因组编辑的简便性,通过利用仅在特定P53-RE水平上不同的同源菌株来调查P53依赖性的序列特异性,从而快速构建定性或定量报告系统转换。另一方面,对于异位P53表达的调节系统的可用性,可以评估各种蛋白质表达的转能。本报告综述了基于色重报告基因、荧光素酶和酵母生长的广泛使用的系统,以说明其主要方法步骤,并批判性地评估其预测能力。此外,这些方法的极端多功能性可以很容易地用于研究不同的TF,包括P63和P73,它们是TP53基因家族的其他成员。

建造ADE2或LUC1记者 酵母菌株
Delitto perfetto 方法12、14、15、16已经过改造,可实现 P53 报告酵母菌株的构造 (图1B)。该方法采用?...

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Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

这里提出的四个协议,以构造和利用酵母糖糖酶报告菌株,以研究人类P53转活化潜力,其各种癌症相关突变的影响,共同表达的相互作用蛋白,和特定小分子的影响。

酵母作为开发功能分析研究人类P53的机箱

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

你好，我叫巴托洛梅奥·博斯科，我是意大利特伦托大学综合生物学中心转录网络实验室的博士生。如您了解，转录是一个极其复杂的过程，涉及转录因子和辅助因子的空间和时间组织。他们中的大多数，包括人类P53，识别特定的 cis-作用元素，称为反应元素，并结合这种DNA测序需要调节目标基因的转录。在这项工作中，我们想向您展示使用酵母作为模型系统作为蛋白质在彩色报告基因或荧光酶或细胞生长的定量研究P53序列特异性方案，以突出主要的实验步骤和这些方法的多功能性。协议一，构建含有腺苷-2上游特定P53反应元素或萤火虫荧光酶基因的记者酵母菌株。要构建记者菌株，首先按照步骤1.1到1.15将酵母细胞与寡核苷酸对准所需启动子区域进行转化。该转换基于基于标准醋酸锂的协议。一旦转化剂出现在5-FOA板上，通常在30度孵育三天后，将它们复制到非选择性YPDA板和含有G418的YPDA板上，标记每个板，以方便其后续比较。在30度下孵育板。第二天，从G418敏感，但在YPDA板块生长的殖民地确定候选记者菌株。在一个新的YPDA板块上分离识别的菌落，以获得单一菌落的分离物，并让他们在30度下生长两天。检查所需 P53 响应元件的正确集成，执行符合步骤 1.20 中所述条件的 PCR 反应。在糖糖凝胶上装载PCR产品的等分，在桑格测序之前检查正确的安培长度。协议二，提出了一个如何使用定性的基于颜色的腺氨酸-2酵母测定评估P53蛋白转活能力的例子。按照第一节中描述的相同醋酸锂协议，使用P53表达载体转换酵母细胞。条纹单酵母转化菌落，高达6个每板，在一个新的选择性板，并让他们在30度过夜生长。第二天，使用无菌天鹅绒，复制板上新的选择性板的条纹，允许评估颜色表型，即选择性板含有限制腺氨酸的数量。在30度孵育三天。相同的条纹可以多次复制镀。方案三，现举例说明利用定量发光LUC1酵母测定法评价P53蛋白转活能力。首先，利用P53表达载体转换酵母细胞，第二节中描述的乙酸锂协议再次发生。将含有葡萄糖作为碳源的新选择性板上修补单一转化剂，并让他们在一夜之间以30度生长。对于每种转换类型，制作五到七个不同的修补程序。隔夜生长后，使用无菌牙签或移液器尖端在含有拉芬糖的合成选择性介质中重新吸收少量细胞作为碳源。这些细胞悬浮液的光学密度应在 0.4 左右的 600 纳米，然后可拆分成多个 96 孔板，在不同温度下进行孵化，或使细胞暴露在不同数量的半乳胶中，以激活 P53 表达。为了测量萤火虫记者的活动，将10至20微升的细胞悬浮液从透明96井板转移到白色384井板中，并在摇床上用等量的解液缓冲液混合细胞，在室温下孵育10、15分钟。加入10，20微升萤火虫荧光素酶基板。并使用多标签板读卡器测量光单位。还测量 96 井板中培养物的光学密度。协议四，我们现在提出了一个如何利用P53诱导的酵母生长抑制的例子。使用 P53 表达向量转换酵母细胞，或使用表达式向量进行共译，以共同表达 P53 及其辅助因子之一（如 MDM2），然后再次使用第一节中描述的基于醋酸锂的协议。在选择性介质中将转化细胞增长到大约一个光学密度。稀释至0.05，并在适当的浓度中加入选定的分子。在摇床上孵育细胞30度42小时。然后，在最小的选择性培养中播种100微升酵母细胞培养。在30度下孵育两天。正确的 RE 集成代替 ICORE 盒式磁带可以由菌落 PCR 检查，从候选酵母克隆的少量细胞开始，并使用表三中描述的底像来放大目标位点。PCR产品，一个带约500核苷酸，然后可以通过桑格测序检查，以确认编辑的基因组位置序列是否存在正确的P53响应元素序列。记者应变准备用于功能测定。要评估P53蛋白转活能力，检查酵母菌落的颜色。例如，我们使用两个不同的记者 P21-5-prime 和 PUMA 以及两个不同的温度 30 度和 37 度来比较野生型 P53 和突变体 R175H 和 R282W。有趣的是，虽然R175H是一种功能丧失的P53等位基因，在所有条件下都是红色菌落，R282W显示温度敏感性，残余转活活性在30度，导致白色菌落，但在37度时失去活性，导致红色或粉红色菌落。图二中提供了一个扩展数据集，在四个突变等位基因中，有四个突变等位基因的 B.Wild 型 P53 测试了转活，使用 10 种不同的 P53 响应元素报告器菌株、三个温度和组成表达水平。结果总结在颜色代码，提醒酵母菌群颜色表型。P53 K139E突变等位基因保持部分活性，对寒冷敏感。例如，GADD45 记者应变为 24 度和 30 度时为红色，但在 37 度时为白色。在这里，我们提出了一个用这种方法获得的结果的例子，比较了人类和C.elegans P53酵母的转活特异性。条形图中的结果表示为平均相对光单位，标准误差为四个复制。比较了五个不同的P53响应元素。通过改变介质中乳糖的浓度，测试了三种不同水平的P53蛋白表达。两个P53正交体表现出明显不同的转活特异性。与 ced13 和 V1 响应元素共享相同序列的结果就是例证，但存在或不存在 28 核苷酸空间器除外。人类P53表现出更高的转换与V1结合站点，而C.elegans P53显示相反。结果独立于半乳糖致动启动子下的P53表达水平。通过计算在100微升培养量下降中获得的菌落数量来测量酵母生长。计算化合物的突变重新激活效应，认为野生型P53表达酵母的生长为最大可能的效果，设置为100%，而表达突变P53的细胞的生长表示零水平的重新激活。在此示例中，Nutlin-3a 缓解了由 MDM2 共表达引起的野生型 P53 的抑制，而 PhiKan083 部分重新激活 Y220C P53 突变体。在这两种情况下，这导致酵母生长的P53依赖性减少。酵母基底细胞已被证明对研究P53蛋白质功能的价值，方面有用。本工作中描述的协议对于评估野生型或癌症相关突变体P53对目标位点变异的转活潜力特别敏感。此外，该方法可用于识别影响P53功能的小分子，并研究P53与辅助因子的相互作用。彩色记者的使用，荧光素酶的小型化，以及生长抑制试验的结果，在成本效益和可扩展的测定，有可能为化学库筛选。最后，在研究其他序列特异性转录因子时，可以方便地采用本工作中描述的系统。

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