Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Vi takker EU (FEDER-fondene POCI/01/0145/FEDER/007728 gennem programa Operacional factores de Competitividade-konkurrence) og nationale fonde (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e tecnologia og Ministério da Educação e Ciência) under Partnerskabsaftale PT2020 UID/QUI/50006/2019 og projekterne (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT-stipendiater: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Dette arbejde blev støttet af Compagnia S. Paolo, Torino, Italien (projekt nr. 2017,0526) og Sundhedsministeriet (projekt 5x1000, 2015 og 2016; Aktuel forskning 2016). Vi takker kraftigt Dr. Teresa López-Arias Montenegro (universitetet i Trento, eksperimentelle videnskaber undervisning laboratorier) for hjælp med videooptagelse.

1. opførelse af ADE2 eller LUC1 reporter gærstammer indeholdende en specifik re (yafm-re eller ylfm-re)
<ol><li>Streak en yafm-iCore eller ylfm-iCore stamme12,14 (iCore = I, ISce-I endonuklease under GAL1 promotor; CO = tæller valgbar URA3; RE = reporter KanMX4 overdragelse af kanamycin resistens; Tabel 1) fra en 15% glycerol bestand opbevaret ved-80 °C på en YPDA agar plade (tabel 2</st...

Gær-baserede assays har vist sig nyttigt at undersøge forskellige aspekter af P53 protein funktioner. Disse analyser er særligt følsomme for at evaluere P53 transaktiveringspotentiellet mod varianter af RE-målområder, herunder evaluering af funktionelle polymorfier. Brugen af farve reportere samt miniaturisering af luciferaseanalysen resulterer i omkostningseffektive og relativt skalerbare analyser. Også, væksthæmning test er potentielt modtagelig for at blive brugt i kemisk bibliotek screening, automatisere kva...

Transkription er en yderst kompleks proces, der involverer dynamisk, rumlig og tidsmæssig organisering af transkriptionsfaktorer (TFS) og cofaktorer for rekruttering og graduering af RNA-polymeraser på kromatin-regioner som respons på specifikke stimuli1 . De fleste TFS, herunder Human P53 tumor suppressor, genkende specifikke CIS-virkende elementer i form af DNA-sekvenser kaldet respons elementer (res), som består af enkelt (eller flere) unikke motiver ~ 6-10 nukleotider lang. Inden for disse motiver kan individuelle positioner vise forskellige grader af variation2, sædvanligvis opsummeret af positions vægt matricer (PWM) eller logoer3,4.
Gær S. cerevisiae er et egnet model system til at studere forskellige aspekter af humane proteiner gennem komplementering assays, Ektopisk udtryk, og funktionelle assays, selv når et orthologt gær gen ikke er til stede5, 6 , 7. på grund af den evolutionære bevaring af basale komponenter i transkriptional system8, mange humane TFS (når ectopically udtrykkes i gærceller) kan moduere ekspression af et reporter gen ved at handle gennem initiativtagere konstrueret til at indeholder passende REs. Transskription model system præsenteret her for human P53 er karakteriseret ved tre store variabler, hvis virkninger kan moduleres: 1) modalitet af udtryk og type af P53, 2) RE sekvens kontrollerende P53-afhængige transkriptionen, og 3) typen af reporter-genet (figur 1a).
Med hensyn til modalitet P53 udtryk, S. cerevisiae tillader valget af inducerbare, repressible, eller konstitutive initiativtagere9,10,11. Især den inducerbare GAL1 promotor tillader basal (ved hjælp af raffinose som en kulstofkilde) eller variabel (ved at ændre mængden af galactose i medierne) udtryk for en TF i gær. Faktisk repræsenterer det fint justerbare udtryk en kritisk udvikling for at studere ikke kun P53 sig selv, men også andre P53 familie proteiner12,13.
Med hensyn til den type REs, som styrer det P53-afhængige udtryk, tillader S. cerevisiae opførelse af forskellige reporter stammer, som besidder unikke forskelle i re af interesse i en ellers isogene baggrund. Dette mål er nået ved hjælp af en tilpasning af en særlig alsidig genomredigering tilgang udviklet i S. cerevisiae, kaldet Delitto Perfetto12,14,15,16.
Desuden kan forskellige reporter gener (dvs., URA3, HIS3 og ADE2) bruges til kvalitativt og kvantitativt at evaluere transkriptionelle aktiviteter af humane TFS i S. cerevisiae, hver med specifikke funktioner, der kan være skræddersyet til eksperimentelle behov17, 18,19,20,21. Ekspression af disse reporter gener giver henholdsvis uracil, histidin og adenin prototrophy. Den URA3 reporter tillader ikke vækst af celler i nærværelse af 5-FOA så godt, og dermed kan det være kontra valgt. ADE2 reporter-systemet har den fordel, at det ud over ernæringsmæssig udvælgelse gør det muligt at identificere gærceller, der udtrykker vildtype (dvs. funktionelle på ADE2 udtryk) eller mutant (dvs.ikke funktionel på ADE2 ) P53 fra koloni farven.
For eksempel, gær celler udtrykker ADE2 genet generere normalt størrelse hvide kolonier på plader, der indeholder begrænsende mængder af adenin (2.5-5.0 mg/L), mens dem, der dårligt eller ikke transskribere det vises på samme plade som mindre rød (eller pink) Kolonier. Dette skyldes ophobning af et mellemprodukt i adenin biosyntetisk pathway (dvs. P-ribosylamino-imidazol, som tidligere er blevet kaldt amino-imidazol ribotid eller luft), som omdannes til dannelse af et rødt pigment. Det kvalitative farve baserede ADE2 reporter-gen er siden blevet erstattet med den kvantitative Firefly photinus halvmøl (LUC1)12,22. For nylig er ADE2 reporter blevet kombineret med LacZ reporter i en let-til-score, semi-kvantitativ, dobbelt reporter assay, der kan udnyttes til at sub-klassificere P53 mutanter i henhold til deres resterende niveau af funktionalitet 23.
Fluorescerende reportere såsom EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) eller DsRed (Diskosoma Sp. rødt fluorescerende protein) er også blevet anvendt til den kvantitative evaluering af transaktiveringaktivitet, der er forbundet med alle mulige missense- mutationer i TP53 kodning sekvens24. Endelig har chancen for at kombinere justerbare initiativtagere til P53 allel-ekspression med isogene gærstammer, der er forskellige for re-og/eller reporter-genet, ført til udvikling af en data matrix, som genererer en raffineret klassificering af Cancer associerede og kimcelle mutant P53 alleler25,26,27.
De ovenfor beskrevne tilgange anvendes til at måle den transkriptionelle aktivitet af P53-proteinet. Men, udtrykket af vildtype P53 i gær S. cerevisiae28 og Schizosaccharomyces pombe29 kan forårsage vækstretardering, som har været forbundet med celle cyklus anholdelse28,30 eller celledød31. I begge tilfælde er gær væksthæmning udløst af High P53 Expression og er blevet korreleret med potentiel transkriptional graduering af endogene gær gener involveret i cellevækst. Understøtte denne hypotese, den tab-of-funktion mutant P53 R273H ikke forstyrre gærcelle vækst, når de udtrykkes på samme niveau som vild-type P5332. Omvendt forårsagede udtrykket i gær af den giftige mutant P53 V122A (kendt for højere transkriptional aktivitet sammenlignet med vildtype P53) en stærkere væksthæmmende effekt end vildtype P5332.
Desuden blev det påvist, at Human MDM2 var i stand til at hæmme den menneskelige P53 transkriptional aktivitet i gær, fremme dets allestedsnærværende og efterfølgende nedbrydning33. Derfor, evnen af human MDM2 og mdmx at hæmme P53-induceret gær væksthæmning blev demonstreret32,34. I en yderligere undersøgelse blev der etableret en sammenhæng mellem P53 transkriptional aktivitet og actin Expression niveauer, med identifikation af en formodet P53 RE opstrøms på ACT1 genet i gær32. Konsekvent blev actin Expression forstærket af Wild-type P53 og endnu mere af P53 V122A, men ikke af mutant P53 R273H. Derimod faldt actin Expression by P53 i samtidig tilstedeværelse af P53-hæmmere MDM2, MDMX eller pifithrin-α (en lille molekyle hæmmer af P53 transkriptionsaktivitet) i overensstemmelse med resultaterne baseret på gæren-vækst analysen. Vigtigere, disse resultater etableret en sammenhæng mellem P53-induceret væksthæmning og graden af dens aktivitet i gær, som også er blevet udnyttet til at identificere og studere små molekyler moduerende P53 funktioner28,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

Konstateringen af, at det velkendte pattedyr P53 protein kan fungere som en transkriptionsfaktor (TF) i gær S. cerevisiae har givet mulighed for udvikling af forskellige funktionelle analyser for at studere virkningerne af 1) bindingssted [dvs. respons element (re)] sekvens varianter på P53 transaktiveringsæregenhed eller 2) TP53 mutationer, co-udtrykte cofactors eller små molekyler på P53 transaktiveringaktivitet. Forskellige grundlæggende og translationelle forskningsprogrammer er blevet udviklet. Eksperimentelt, disse tilgange udnytter to store fordele ved gær model. På den ene side muliggør den nemme genom-redigering hurtig konstruktion af kvalitative eller kvantitative reporter-systemer ved at udnytte isogene stammer, der kun afviger på niveauet for en specifik P53-re for at undersøge sekvens specificiteten af P53-afhængige transaktiveringen. På den anden side giver tilgængeligheden af regulerede systemer for ektopisk P53 Expression mulighed for evaluering af transaktiveringen i en bred vifte af protein ekspression. Gennemgået i denne rapport er flittigt anvendte systemer, der er baseret på farve reporter gener, luciferase, og væksten af gær til at illustrere deres vigtigste metodologiske skridt og kritisk vurdere deres forudsigende effekt. Desuden kan den ekstreme alsidighed af disse tilgange let udnyttes til at studere forskellige TFs, herunder P63 og P73, som er andre medlemmer af TP53 gen familie.

Opførelse af ADE2 eller en LUC1 reporter gær stammer
Delitto perfettoapproach12,14,15,16 er blevet tilpasset for at muliggøre opførelsen af P53 Reporter gærstammer (...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Præsenteret her er fire protokoller til at konstruere og udnytte gær Saccharomyces cerevisiae reporter stammer til at studere Human P53 transaktiverende potentiale, virkningerne af sine forskellige Cancer-associerede mutationer, co-udtrykte interagerende proteiner, og virkningerne af specifikke små molekyler.

Gær som et chassis til udvikling af funktionelle assays til undersøgelse af humane P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Hej, mit navn er Bartolomeo Bosco, og jeg er ph.d.-studerende ved Laboratoriet for Transkriptionsnetværk ved Center for Integrativ Biologi ved Universitetet i Trento i Italien. Som Du ved, transskription er en yderst kompleks proces, der involverer rumlige og tidsmæssige organisering af transskriptionsfaktor og cofaktor. De fleste af dem, herunder den menneskelige P53, genkende specifikke cis-handler elementer, kaldet svar elementer, og bindingen på denne DNA-sekventering er nødvendig for graduering af transskription af målgener.I dette arbejde vil vi gerne vise dig protokollen til at studere P53 sekvens specifikke i transaktivering funktioner ved hjælp af gær som et modelsystem som protein i en farve reporter gen eller luciferase eller på kvantificering af cellevækst at fremhæve de vigtigste eksperimentelle trin og alsidigheden af disse tilgange. Protokol et, konstruktion af reporter gær stammer, der indeholder en specifik P53 respons element opstrøms for adenin-2 eller firefly luciferase genet. At konstruere en reporter stamme, først følge trin 1,1 til 1,15 for at omdanne gær celler med oligonukleotider rettet mod den ønskede promotor region.Transformationen er baseret på den standard lithium acetat-baserede protokol. Når transformanter vises på 5-FOA plader, normalt efter tre dages inkubation ved 30 grader, replika plade dem på ikke-selektive YPDA plader og også på YPDA plader, der indeholder G418, mærkning hver plade for at lette deres efterfølgende sammenligning. Inkuber pladerne natten over ved 30 grader.Den næste dag, identificere kandidat reporter stammer fra kolonier, der er G418-følsomme, men voksede på YPDA plader. Streak de identificerede kolonier på en ny YPDA plade for at opnå en enkelt koloni isolater, og lad dem vokse i to dage ved 30 grader. Kontroller den korrekte integration af det ønskede P53-responselement og udfører en PCR-reaktion med de tilstande, der er nævnt i trin 1.20.Der indførst en aliquot af PCR-produktet på agarosegel for at kontrollere den korrekte ampliconlængde før Sanger-sekvensering. Protokol to, vi præsenterer et eksempel på, hvordan man vurderer P53 protein transaktivering evne ved hjælp af den kvalitative farve-baserede adenin-2 gær assay. Transform gærceller med P53-udtryksvektorer efter den samme lithiumacetatbaserede protokol, der er beskrevet i afsnit et.Streak enkelt gær transformerende kolonier, op til seks pr plade, på en ny selektiv plade, og lad dem vokse natten over ved 30 grader. Dagen efter, ved hjælp af sterile fløjl, replika plade striber på nye selektive plader, der giver mulighed for vurdering af farven fænotype, dvs selektive plader, der indeholder begrænsende mængde adenin.Inkuberes ved 30 grader i tre dage. De samme striber kan kopieres flere gange. Protokol tre, vi nu præsentere et eksempel på evalueringen af P53 protein transaktivering evne ved hjælp af kvantitative luminescens-baserede LUC1 gær assay.Først omdanne gær celler med P53 udtryk vektorer efter, igen, lithium acetat-baserede protokol beskrevet i afsnit to. Patch enkelt transformanter på nye selektive plader, der indeholder glukose som kulstofkilde, og lad dem vokse ved 30 grader natten over. For hver transformationstype skal du lave fem til syv forskellige patches.Efter nattens vækst, resuspend en lille mængde af celler ved hjælp af en steril tandstikker eller en pipette spids i syntetisk selektiv medium, der indeholder raffinose som kulstofkilde. Disse celle suspensioner bør have en optisk tæthed ved 600 nanometer omkring 0,4 og kan derefter opdeles i flere 96-brønd plader til inkubation ved forskellige temperaturer, behandlinger, eller at udsætte celler til varierende mængde galactose at aktivere P53 udtryk. For at måle firefly reporter aktivitet, overføre 10 til 20 mikroliter af celle suspension fra den gennemsigtige 96-brønd plade i en hvid 384-brønd plade, og bland cellerne med et tilsvarende volumen af lysis buffer, inkubering i 10, 15 minutter ved stuetemperatur på en shaker.Der tilsættes 10, 20 mikroliter af firefly luciferase underlag. Og måle lysenheder ved hjælp af en multilabel pladelæser. Mål også den optiske tæthed af kulturerne i 96-brøndpladen.Protokol fire, vi nu præsentere et eksempel på, hvordan man udnytter hæmning af væksten af gær induceret af P53. Transform gær celler med P53 udtryk vektorer, eller cotransform dem med udtryk vektorer til at coexpress P53 og en af dens cofaktorer, såsom MDM2, efter, igen, lithium acetat-baserede protokol beskrevet i afsnit et. Dyrk transformerende celler i selektiv medium til ca. én optisk tæthed.Og fortynde dem til 0,05, og tilsæt et valgt molekyle til den rette koncentration. Inkuber celler ved 30 grader på en shaker i 42 timer. Derefter frø 100 mikroliter af gær celle kultur i minimal selektiv medium plader.Inkuberes i to dage ved 30 grader. Den korrekte RE integration i stedet for ICORE kassetten kan kontrolleres af koloni PCR, startende fra en lille mængde celler fra kandidat gær kloner og ved hjælp af primere beskrevet i tabel tre til at forstærke den målrettede locus. PCR-produkter, et bånd på omkring 500 nukleotider, kan derefter kontrolleres af Sanger sekventering for at bekræfte rækkefølgen af den redigerede genomiske placering for tilstedeværelsen af den korrekte P53 responselement sekvens.Reporterstammen er klar til brug i funktionelle analyser. For at evaluere P53 protein transaktivering evne, kontrollere farven på gær kolonier. For eksempel præsenterer vi en sammenligning mellem wild-type P53 og mutanterne R175H og R282W ved hjælp af to forskellige journalister, P21-5-prime og PUMA, og to forskellige temperaturer, 30 grader og 37 grader.Interessant, mens R175H er et tab-of-funktion P53 allel, røde kolonier under alle forhold, R282W viser temperaturfølsomhed med resterende transaktivering aktivitet ved 30 grader, hvilket resulterer i hvide kolonier, men tab af aktivitet ved 37 grader, hvilket resulterer i røde eller lyserøde kolonier. Et udvidet datasæt præsenteres i figur 2 B.Wild-type P53 i fire mutant alleler blev testet for transaktivering ved hjælp af 10 forskellige P53 responselement reporter stammer, tre temperaturer, og konstituerende udtryk niveauer. Resultaterne er opsummeret i en farvekode, der minder gær koloni farve fænotype.Den P53 K139E mutant allel bevarer delvis aktivitet og er koldfølsom. For eksempel er kolonier røde i GADD45 reporter stamme ved 24 og 30 grader, men de er hvide ved 37 grader. Her præsenterer vi et eksempel på resultater opnået med denne metode, sammenligne transaktivering specificitet af menneskelige og C.elegans P53 gær.Resultaterne i søjlediagrammet udtrykkes som gennemsnitlige relative lysenheder med standardfejl på fire replikater. Fem forskellige P53 responselementer blev sammenlignet. Tre forskellige niveauer af P53 proteinudtryk blev testet ved at variere koncentrationen af galactose i mediet.De to P53 orthologs viser markant forskellige transaktivering specificitet. Dette er eksemplificeret ved resultaterne med ced13 og V1 respons elementer, der deler den samme sekvens, bortset fra tilstedeværelsen eller fraværet af en 28-nukleotid spacer. Human P53 udviser meget højere transaktivering med V1 bindingsstedet, mens C.elegans P53 viser det modsatte.Resultaterne er uafhængige af P53-udtrykket under den galactose-inducerende promotor. Mål gærvæksten ved at tælle antallet af kolonier, der opnås i de 100 mikroliters kulturfald. Den mutante reaktiveringseffekt af forbindelser, der betragter væksten af vildtype P53 med gær som den maksimale mulige effekt, der er sat til 100 %, mens væksten af celler, der udtrykker mutant P53, repræsenterer nul reaktiveringsniveau.I dette eksempel lindrer Nutlin-3a hæmning af vildtype P53 forårsaget af sameksistens af MDM2, mens PhiKan083 delvist genaktiverer Y220C P53 mutant. I begge tilfælde resulterer dette i en P53-afhængig reduktion af gær vækst. Gær basalceller har vist sig nyttige til at undersøge værdier, aspekter af P53 protein funktioner.Den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, er særligt følsomme til vurdering af transaktiveringspotentialet for vildtype eller kræftrelateret mutant P53 til varianter af målsteder. Desuden kan tilgangen bruges til at identificere små molekyler, der påvirker P53-funktioner, og til at studere P53 interaktion med cofaktor. Brugen af farven reportere, miniaturisering af luciferase, samt vækst hæmning test resultere i omkostningseffektive og skalerbare analyser potentielt modtagelige for kemiske bibliotek screening.Endelig kan det system, der er beskrevet i dette arbejde, let vedtages med undersøgelsen af andre sekvensspecifikke transskriptionsfaktorer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Analyser til Undersøgelse makrofag og Mikroglia Stimulering af glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Sådan Undersøgelse Basement Membrane stivhed som en biofysisk Trigger i prostatakræft og andre aldersrelaterede patologier eller metaboliske sygdomme

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Den Colon-26 Carcinoma Tumor-bærende mus som en model for Studiet af Cancer Kakeksi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging Assays til undersøgelse glioblastom hjerne Tumor stamcelle Migration og Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostata Organoid kulturer som værktøjer til at oversætte genotyper og Mutational profiler til farmakologiske reaktioner

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Kombineret betinget knockdown og tilpasset sfære dannelse assay at studere en stemness-associerede gene af patient-afledte gastrisk kræft stamceller

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Overvågning af eIF4F-samling ved måling af eIF4E-eIF4G-interaktion i levende celler

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Brug af E1A Minigene Tool til at studere mRNA-splejsningsændringer

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En hurtig screeningsarbejdsgang til identifikation af potentiel kombinationsbehandling for GBM ved hjælp af patientafledte gliomstamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Bryst epitel og endotelcellespheroider som en potentiel funktionel in vitro-model til brystkræftforskning

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...