Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Wij danken de Europese Unie (FEDER funds POCI/01/0145/FEDER/007728 via programa Operacional Factores de Competitividade-concurreren) en nationale fondsen (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia en Ministério da Educação e Ciência) onder de Partnerschapsovereenkomst PT2020 UID/QUI/50006/2019 en de projecten (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT Fellowships: SFRH/BD/96189/2013 (v. Gomes). Dit werk werd gesteund door de Compagnia S. Paolo, Turijn, Italië (project 2017,0526) en Ministerie van volksgezondheid (project 5x1000, 2015 en 2016; huidig onderzoek 2016). We danken Dr. Teresa López-Arias Montenegro (Universiteit van Trento, experimentele wetenschappen onderwijs laboratoria) ten zeerste voor hulp bij video-opnames.

1. bouw van ADE2 of LUC1 reporter giststammen met een specifieke re (yafm-re of ylfm-re)
<ol><li>Streak een yafm-icore of ylfm-icore stam12,14 (icore = i, ISCE-I endonuclease onder GAL1 promotor; CO = teller selecteerbaar URA3; RE = reporter KanMX4 het verlenen van kanamycine resistentie; Tabel 1) van een 15% glycerol bestand opgeslagen bij-80 °C op een YPDA agar plaat (tabel 2). La...

Op gist gebaseerde assays zijn nuttig gebleken om verschillende aspecten van P53 eiwit functies te onderzoeken. Deze assays zijn bijzonder gevoelig voor het evalueren van P53 transactiveringspotentieel naar varianten van RE target sites, met inbegrip van de evaluatie van functionele polymorfismen. Het gebruik van kleuren verslaggevers en miniaturisatie van de plaats-assay resulteren in kosteneffectieve en relatief schaalbare assays. Ook is de groeiremmende test mogelijk vatbaar voor gebruik in de chemische bibliotheek sc...

Transcriptie is een uiterst complex proces waarbij dynamische, ruimtelijke en temporele organisatie van transcriptiefactoren (TFs) en cofactoren voor de werving en modulatie van RNA-polymerasen op chromatine-gebieden in reactie op specifieke stimuli1 . De meeste TFs, met inbegrip van de menselijke P53 tumor suppressor, herkennen van specifieke CIS-Acting elementen in de vorm van DNA-sequenties genaamd Response Elements (REs), die bestaan uit enkele (of meerdere) unieke motieven ~ 6-10 nucleotiden lang. Binnen deze motieven kunnen individuele posities verschillende graden variabiliteit2vertonen, meestal samengevat op positie gewicht matrices (PWM) of logo's3,4.
De gist S. cerevisiae is een geschikt modelsysteem voor het bestuderen van verschillende aspecten van menselijke eiwitten door middel van complementatie assays, ectopische expressie en functionele assays, zelfs wanneer een ortholoog gist gen niet aanwezig is5, 6 , 7. vanwege het evolutionaire behoud van basale componenten van het transcriptionele systeem8, kunnen veel menselijke TFs (wanneer ectopisch uitgedrukt in gistcellen) de uitdrukking van een reporter-gen moduleren door te handelen via organisatoren die zijn ontworpen om passende REs bevatten. De transcriptie modelsysteem gepresenteerd hier voor menselijke P53 wordt gekenmerkt door drie belangrijke variabelen waarvan de effecten kunnen worden gedifferentieerd: 1) de modaliteit van expressie en type van P53, 2) de RE sequentie die P53-afhankelijke transcriptie bestuurt, en 3) het type Reporter gen (Figuur 1a).
Met betrekking tot de modaliteit van P53 uitdrukking, stelt S. cerevisiae de keuze van de niet-behoudende, onderdeelbare of constitutieve promotoren9,10,11toe. In het bijzonder, de induceerbare cytochromen GAL1 promotor maakt basale (met behulp van raffinose als een koolstofbron) of variabele (door het veranderen van de hoeveelheid galactose in de media) uitdrukking van een tf in gist. In feite vertegenwoordigt de fijnafstemmingen een kritische ontwikkeling voor het bestuderen van niet alleen P53 zelf, maar ook andere P53 familie eiwitten12,13.
Met betrekking tot het type van REs het beheersen van de P53-afhankelijke expressie, S. cerevisiae laat de bouw van verschillende reporter stammen bezitten unieke verschillen in de re van belang in een anders isogene achtergrond. Dit doel wordt bereikt door een aanpassing van een bijzonder veelzijdige genoom Editing aanpak ontwikkeld in S. cerevisiae, genaamd delitto perfetto12,14,15,16.
Bovendien kunnen verschillende reporter genen (d.w.z. URA3, HIS3 en ADE2) worden gebruikt om de transcriptionele activiteiten van Human TFs in S. cerevisiaekwalitatief en kwantitatief te evalueren, elk met specifieke functies die kunnen worden afgestemd op experimentele behoeften17,18,19,20,21. De uitdrukking van deze reporter genen kent respectievelijk uracil, histidine en adenine prototrofie. De URA3 reporter staat niet toe dat de groei van cellen in de aanwezigheid van 5-FOA ook, en dus het kan worden tegengeselecteerd. Het ADE2 reporter systeem heeft als voordeel dat, naast nutritionele selectie, het de identificatie mogelijk maakt van gistcellen die wild type uitdrukken (d.w.z. functioneel op ADE2 expressie) of Mutant (D.W.Z.niet functioneel op ADE2 ) P53 uit de kolonie kleur.
Bijvoorbeeld, gistcellen die het gen ADE2 uitdrukken genereren normaliter witte kolonies op platen met beperkende hoeveelheden adenine (2,5-5,0 mg/L), terwijl die die slecht zijn of niet transcriberen, op dezelfde plaat verschijnen als kleiner rood (of roze) Kolonies. Dit is te wijten aan accumulatie van een intermediair in de adenine biosynthetische Pathway (d.w.z. P-ribosylamino-imidazol, die eerder amino-imidazol ribotide of lucht genoemd is), die wordt omgezet in een rood pigment. Het kwalitatieve ADE2 reporter gen is sindsdien vervangen door de kwantitatieve Firefly Photinus lichtmot (LUC1)12,22. Meer recentelijk is de ADE2 reporter gecombineerd met de lacz reporter in een eenvoudig te scoren, semi-kwantitatieve, dubbele reporter assay die kan worden benut om P53 mutanten te classificeren op basis van hun rest niveau van functionaliteit 23.
Fluorescerende verslaggevers zoals EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) of dsred (discosoma SP. rood fluorescerende proteïne) zijn ook gebruikt voor de kwantitatieve evaluatie van de transactiveringsactiviteit in verband met alle mogelijke missense-mutaties in de TP53 Codeer volgorde24. Tot slot heeft de kans om tunable promotors te combineren voor P53 allel expressie met isogene giststammen die verschillen voor het re en/of reporter gen geleid tot de ontwikkeling van een data matrix die een verfijnde classificatie genereert van kanker-geassocieerde en kiembaan Mutant P53 allelen25,26,27.
De hierboven beschreven benaderingen worden gebruikt om de transcriptionele activiteit van het P53-eiwit te meten. Echter, de uitdrukking van wild-type P53 in de gist S. cerevisiae28 en schizosaccharomyces pombe29 kan leiden tot groeiachterstand, die is geassocieerd met celcyclus arrestatie28,30 of celdood31. In beide gevallen wordt de remming van de gist groei veroorzaakt door een hoge P53 expressie en gecorreleerd met mogelijke transcriptionele modulatie van endogene gist genen die betrokken zijn bij celgroei. Ter ondersteuning van deze hypothese, de verlies-van-functie Mutant P53 R273H niet interfereren met gist celgroei wanneer uitgedrukt op vergelijkbare niveaus als wild-type P5332. Omgekeerd veroorzaakte de uitdrukking in gist van de giftige Mutant P53 V122A (bekend voor een hogere transcriptionele activiteit in vergelijking met wild-type P53) een sterkere groei remmende werking dan wild type P5332.
Bovendien werd aangetoond dat Human MDM2 in staat was om de menselijke P53 transcriptionele activiteit in gist te remmen, de ubiquitinatie en daaropvolgende afbraak33te bevorderen. Dienovereenkomstig werd het vermogen van Human MDM2 en mdmx voor de remming van P53-geïnduceerde gist groeiremming aangetoond32,34. In een aanvullend onderzoek werd een correlatie tussen P53 transcriptionele activiteit en actine uitdrukkings niveaus vastgesteld, met de identificatie van een vermoedelijke P53 re stroomopwaarts op het ACT1 gen in gist32. Consequent, actine expressie werd versterkt door wild-type P53 en nog meer door P53 V122A, maar niet door Mutant P53 R273H. Omgekeerd daalde de actine expressie door P53 in de co-aanwezigheid van P53 remmers MDM2, MDMX of pifithrin-α (een kleine molecuul remmer van P53 transcriptionele activiteit), in overeenstemming met de resultaten op basis van de gist groei test. Belangrijk, deze resultaten vastgesteld een correlatie tussen P53-geïnduceerde groeiremming en de mate van haar activiteit in gist, die ook is uitgebuit om te identificeren en bestuderen van kleine moleculen modulerende P53 functies28,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

De bevinding dat het bekende zoogdier P53 eiwit kan fungeren als een transcriptiefactor (TF) in de gist S. cerevisiae heeft toegestaan voor de ontwikkeling van verschillende functionele assays om de effecten van 1) bindingsplaats te bestuderen [d.w.z., Response element (re)] sequentie varianten op P53 transactiveringsspecificiteit of 2) TP53 mutaties, co-uitgedrukt cofactoren of kleine moleculen op P53 trans activatie activiteit. Er zijn verschillende basis-en translationele onderzoekstoepassingen ontwikkeld. Experimenteel, deze benaderingen benutten twee belangrijke voordelen van het gist model. Aan de ene kant maakt het gemak van genoom bewerking een snelle constructie van kwalitatieve of kwantitatieve verslaggever systemen mogelijk door het exploiteren van isogene stammen die alleen verschillen op het niveau van een specifieke P53-RE om sequentie-specificiteit van P53 afhankelijke trans. Aan de andere kant maakt de beschikbaarheid van gereguleerde systemen voor buitenbaarmoederlijke P53 expressie de evaluatie van trans activatie mogelijk in een breed scala aan eiwit expressie. Beoordeeld in dit rapport zijn uitgebreid gebruikte systemen die zijn gebaseerd op Color reporter genen, Luciferase, en de groei van gist ter illustratie van hun belangrijkste methodologische stappen en kritisch beoordelen hun voorspellende vermogen. Bovendien kan de extreme veelzijdigheid van deze benaderingen gemakkelijk worden benut om verschillende TFs te bestuderen, waaronder P63 rooms en P73, die andere leden zijn van TP53 genfamilie.

Aanleg van ADE2 of een LUC1 reporter giststammen
Dedelitto perfettoapproach12,14,15,16 is aangepast om de bouw van P53 reporter giststammen mogelijk te maken (Figuur 1b</...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Hier zijn vier protocollen voor het construeren en exploiteren van gist Saccharomyces cerevisiae reporter stammen te bestuderen van menselijke P53 trans activatie potentieel, effecten van de verschillende kanker-geassocieerde mutaties, co-uitgedrukt interactie eiwitten, en de effecten van specifieke kleine moleculen.

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Hallo, mijn naam is Bartolomeo Bosco, en ik ben een promovendus aan het Laboratorium van Transcriptie Netwerk aan het Centrum voor Integratieve Biologie van de Universiteit van Trento in Italië. Zoals u weet, transcriptie is een uiterst complex proces waarbij ruimtelijke en temporele organisatie van transcriptie factor en cofactor. De meeste van hen, met inbegrip van de menselijke P53, herkennen specifieke cis-handelende elementen, genaamd responselementen, en de binding op deze DNA-sequencing is vereist voor de modulatie van de transcriptie van doelgenen.In dit werk willen we u het protocol laten zien om P53-sequentiespecifiek in transactivatiefuncties te bestuderen met gist als modelsysteem als eiwit in een kleurverslaggevergen of de luciferase of op de kwantificering van celgroei om de belangrijkste experimentele stappen en de veelzijdigheid van deze benaderingen te benadrukken. Protocol een, de bouw van verslaggever gist stammen die een specifieke P53 reactie element stroomopwaarts van de adenine-2 of de firefly luciferase gen bevatten. Om een reporter stam te construeren, volg eerst stappen 1.1 tot en met 1.15 om gistcellen te transformeren met oligonucleotiden gericht op de gewenste promotor regio.De transformatie is gebaseerd op het standaard protocol op basis van lithiumacetaat. Zodra transformanten verschijnen op 5-FOA platen, meestal na drie dagen van incubatie bij 30 graden, replica plaat ze op niet-selectieve YPDA platen en ook op YPDA platen met G418, markering elke plaat om hun latere vergelijking te vergemakkelijken. Incubeer de platen 's nachts op 30 graden.De volgende dag, identificeren van de kandidaat-verslaggever stammen uit kolonies die G418-gevoelig, maar groeide op YPDA platen. Streep de geïdentificeerde kolonies op een nieuwe YPDA plaat om enkele kolonie isolaten te verkrijgen, en laat ze groeien voor twee dagen op 30 graden. Controleer de juiste integratie van het gewenste P53-responselement en het uitvoeren van een PCR-reactie met voorwaarden vermeld in stap 1.20.Laad een aliquot van het PCR-product op agarose gel om de juiste ampliconlengte te controleren voordat Sanger sequencing. Protocol twee, presenteren we een voorbeeld van hoe te evalueren P53 eiwit transactivatie vermogen met behulp van de kwalitatieve kleur gebaseerde adenine-2 gisttest. Transformeer gistcellen met P53-expressievectoren volgens hetzelfde protocol op basis van lithiumacetaat dat in deel één wordt beschreven.Streep enkele gist transformant kolonies, tot zes per plaat, op een nieuwe selectieve plaat, en laat ze groeien 's nachts op 30 graden. De dag erna, met behulp van steriele fluweel, replica plaat de strepen op nieuwe selectieve platen die het mogelijk maken voor de beoordeling van de kleur fenotype, dat wil zeggen selectieve platen met beperkende hoeveelheid adenine.Incubeer op 30 graden gedurende drie dagen. Dezelfde strepen kunnen meerdere keren worden gerepliceerd. Protocol drie, presenteren we nu een voorbeeld van de evaluatie van P53 eiwit transactivatie vermogen met behulp van de kwantitatieve luminescentie gebaseerde LUC1 gisttest.Transformeer eerst gistcellen met P53-expressievectoren volgens, nogmaals, het protocol op basis van lithiumacetaat dat in deel twee wordt beschreven. Patch enkele transformatoren op nieuwe selectieve platen met glucose als koolstofbron, en laat ze groeien op 30 graden 's nachts. Maak voor elk transformatietype vijf tot zeven verschillende patches.Na de nachtelijke groei, resuspend een kleine hoeveelheid cellen met behulp van een steriele tandenstoker of een pipet tip in synthetische selectieve medium met raffinose als koolstofbron. Deze celsuspensies moeten een optische dichtheid hebben van 600 nanometer rond 0,4 en kunnen vervolgens worden gesplitst in meerdere 96-putplaten voor incubatie bij verschillende temperaturen, behandelingen of om cellen bloot te stellen aan verschillende hoeveelheid galactose om P53-expressie te activeren. Om de firefly reporter activiteit te meten, breng 10 tot 20 microliter celsuspensie van de transparante 96-put plaat in een witte 384-put plaat, en meng de cellen met een gelijk volume van lyse buffer, incubateren voor 10, 15 minuten bij kamertemperatuur op een shaker.Voeg 10, 20 microliters vuurvlieg luciferase substraat. En meet lichtunits met behulp van een multilabel plaatlezer. Meet ook de optische dichtheid van de culturen in de 96-putplaat.Protocol vier, presenteren we nu een voorbeeld van hoe de remming van de groei van gist veroorzaakt door P53 te benutten. Transformeer gistcellen met P53-expressievectoren, of transformeer ze met expressievectoren om P53 en een van de cofactoren, zoals MDM2, samen te stellen, na, nogmaals, het protocol op basis van lithiumacetaat beschreven in sectie één. Kweek transformantcellen in selectief middel aan ongeveer één optische dichtheid.En verdun ze tot 0,05, en voeg een gekozen molecuul toe aan de juiste concentratie. Incubeer cellen op 30 graden op een shaker gedurende 42 uur. Dan, zaad 100 microliters van gistcelcultuur in minimale selectieve medium platen.Incubeer voor twee dagen bij 30 graden. De juiste RE-integratie in plaats van de ICORE-cassette kan worden gecontroleerd door kolonie PCR, uitgaande van een kleine hoeveelheid cellen van kandidaat-gistklonen en met behulp van primers beschreven in tabel drie om de beoogde locus te versterken. PCR-producten, een band van ongeveer 500 nucleotiden, kunnen vervolgens worden gecontroleerd door Sanger sequencing om de volgorde van de bewerkte genomische locatie voor de aanwezigheid van de juiste P53-responselementsequentie te bevestigen.De reporter stam is klaar om te worden gebruikt in functionele testen. Controleer de kleur van gistkolonies om het P53-eiwittransactivatievermogen te evalueren. We presenteren bijvoorbeeld een vergelijking tussen wild-type P53 en de mutanten R175H en R282W met behulp van twee verschillende verslaggevers, P21-5-prime en PUMA, en twee verschillende temperaturen, 30 graden en 37 graden.Interessant, terwijl R175H is een verlies-van-functie P53 allel, rode kolonies in alle omstandigheden, R282W toont temperatuurgevoeligheid met resterende transactivering activiteit op 30 graden, wat resulteert in witte kolonies, maar verlies van activiteit op 37 graden, wat resulteert in rode of roze kolonies. Een uitgebreide dataset wordt gepresenteerd in figuur twee B.Wild-type P53 in vier mutante allelen werden getest op transactivatie met behulp van 10 verschillende P53 response element reporter stammen, drie temperaturen, en constitutieve expressie niveaus. Resultaten worden samengevat in een kleurcode die de gistkolonie kleur fenotype herinnert.Het P53 K139E mutantallel behoudt gedeeltelijke activiteit en is koudgevoelig. Bijvoorbeeld, kolonies zijn rood in de GADD45 reporter stam op 24 en 30 graden, maar ze zijn wit op 37 graden. Hier presenteren we een voorbeeld van de resultaten verkregen met deze methode, het vergelijken van de transactivatie specificiteit van de mens en C.elegans P53 gist.De resultaten in de staafgrafiek worden uitgedrukt als gemiddelde relatieve lichteenheden met standaardfout van vier replicaties. Vijf verschillende P53-responselementen werden vergeleken. Drie verschillende niveaus van P53 eiwitexpressie werden getest door de concentratie van galactose in het medium te variëren.De twee P53 orthologs vertonen duidelijk verschillende transactivatie specificiteit. Dit wordt geïllustreerd door de resultaten met ced13- en V1-responselementen die dezelfde volgorde delen, met uitzondering van de aanwezigheid of afwezigheid van een 28-nucleotide-afstandsruimter. Human P53 vertoont veel hogere transactivering met de V1 binding site, terwijl C.elegans P53 toont het tegenovergestelde.De resultaten zijn onafhankelijk van het niveau van P53 expressie onder de galactose-inducible promotor. Meet gistgroei door het tellen van het aantal kolonies verkregen in de 100 microliters cultuur daalt. Bereken het gemuteerde reactiverende effect van verbindingen gezien de groei van wild-type P53 uitdrukken gist als het maximaal mogelijke effect, ingesteld op 100%, terwijl de groei van cellen uitdrukken mutant P53 vertegenwoordigen nul niveau van reactivering.In dit voorbeeld verlicht Nutlin-3a de remming van wild-type P53 veroorzaakt door de coexpressie van MDM2, terwijl PhiKan083 de Y220C P53 mutant gedeeltelijk reactiveert. In beide gevallen resulteert dit in een P53-afhankelijke vermindering van gistgroei. Gist basale cellen hebben bewezen nuttig om waarden te onderzoeken, aspecten van P53 eiwit functies.Het protocol beschreven in dit werk zijn bijzonder gevoelig voor de evaluatie van transactivatie potentieel van wilde aard of kanker-geassocieerde mutant P53 aan varianten van doellocaties. Verder kan de aanpak worden gebruikt om kleine moleculen te identificeren die P53-functies beïnvloeden en om P53-interactie met cofactor te bestuderen. Het gebruik van de kleur verslaggevers, de miniaturisatie van de luciferase, evenals de groei remming test resulteren in kosteneffectieve en schaalbare testen potentieel vatbaar voor chemische bibliotheek screening.Ten slotte kan het in dit werk beschreven systeem gemakkelijk worden aangenomen met de studie van andere sequentiespecifieke transcriptiefactoren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

De Colon-26 carcinoom Tumor-dragende Mouse als een model voor de studie van kankercachexia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostaat-Organoid culturen als hulpmiddelen om genotypes en Mutationele profielen te vertalen naar farmacologische reacties

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Gecombineerde voorwaardelijke knockdown en aangepaste sphere vorming test om een stemness-geassocieerd gen van patiënt-afgeleide maagkanker stamcellen studie

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Monitoring van eIF4F-assemblage door eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

De E1A Minigene Tool gebruiken om mRNA-splicingwijzigingen te bestuderen

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...