Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
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Nous remercions l'Union Européenne (Fonds FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 par programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) et les Fonds Nationaux (FCT/MEC, Fundaço para a Ciência e Tecnologia et Ministério da Educaçào e Ciência) sous le Accord de partenariat PT2020 UID/QUI/50006/2019 et les projets (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Bourses FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Ce travail a été soutenu par la Compagnia S. Paolo, Turin, Italie (Projet 2017.0526) et le Ministère de la Santé, (Projet 5x1000, 2015 et 2016; recherche actuelle 2016). Nous remercions profondément la Dre Teresa Làpez-Arias Montenegro (Université de Trente, laboratoires d'enseignement des sciences expérimentales) pour son aide à l'enregistrement vidéo.

1. Construction de souches de levure aDE2 ou LUC1 contenant un RE spécifique (yAFM-RE ou yLFM-RE)
<ol><li>Streak a yAFM-ICORE ou yLFM-ICORE souche12,14 (ICORE - I, ISce-I endonuclease sous GAL1 promoteur; CO et contre URA3sélectionnable ; RE - journaliste KanMX4 conférant la résistance de kanamycine ; Tableau 1) à partir d'un stock de glycérol de 15 % stocké à -80 oC sur une plaque d'agar YPD...

Les essais à base de levure se sont avérés utiles pour étudier divers aspects des fonctions protéiques P53. Ces essais sont particulièrement sensibles pour évaluer le potentiel de transactivation P53 vers des variantes de sites cibles RE, y compris l'évaluation des polymorphismes fonctionnels. L'utilisation de journalistes de couleur ainsi que la miniaturisation de l'analyse de la luciférase se traduisent par des essais rentables et relativement évolutifs. En outre, le test d'inhibition de la croissance est pot...

La transcription est un processus extrêmement complexe impliquant l'organisation dynamique, spatiale et temporelle des facteurs de transcription (TFs) et des cofacteurs pour le recrutement et la modulation des polymérases d'ARN sur des régions de chromatine en réponse aux stimulus spécifiques1 . La plupart des TF, y compris le suppresseur humain de tumeur de P53, reconnaissent les éléments cis-action spécifiques sous la forme des séquences d'ADN appelées éléments de réponse (REs), qui se composent des motifs uniques (ou multiples) uniques de 6-10 nucléotides longs. Dans ces motifs, les positions individuelles peuvent montrer divers degrés de variabilité2, généralement résumépar par matrices de poids de position (PWM) ou logos3,4.
La levure S. cerevisiae est un système modèle approprié pour étudier différents aspects des protéines humaines par des essais de complémentarité, l'expression ectopique, et les essais fonctionnels, même quand un gène de levure orthologue n'est pas présent5, 6 Annonces , 7. En raison de la conservation évolutive des composants basaux du système transcriptionnel8, de nombreux TF humains (lorsqu'ils s'expriment ectopiquement dans les cellules de levure) peuvent moduler l'expression d'un gène journaliste en agissant par l'intermédiaire de promoteurs contiennent des RE appropriés. Le système de modèle de transcription présenté ici pour l'homme P53 est caractérisé par trois variables principales dont les effets peuvent être modulés : 1) la modalité d'expression et le type de P53, 2) la séquence RE contrôlant la transcription P53-dépendante, et 3) le type de gène journaliste (Figure 1A).
En ce qui concerne la modalité de l'expression P53, S. cerevisiae permet le choix des promoteurs inductibles, répressibles ou constitutifs9,10,11. En particulier, le promoteur inductible GAL1 permet l'expression basale (en utilisant le raffinose comme source de carbone) ou variable (en changeant la quantité de galactose dans les médias) d'une TF en levure. En fait, l'expression finement réglable représente un développement critique pour l'étude non seulement P53 lui-même, mais aussi d'autres protéines de la famille P5312,13.
En ce qui concerne le type de R contrôlant l'expression P53-dépendante, S. cerevisiae permet la construction de différentes souches de reporter possédant des différences uniques dans l'ER d'intérêt dans un fond autrement isogénique. Cet objectif est atteint à l'aide d'une adaptation d'une approche d'édition du génome particulièrement polyvalente développée en S. cerevisiae, appelée delitto perfetto12,14,15,16.
En outre, différents gènes de reporter (c.-à-d., URA3, HIS3, et ADE2) peuvent être employés pour évaluer qualitativement et quantitativement des activités transcriptionnelles des TF humains dans S. cerevisiae,chacun avec des dispositifs spécifiques qui peuvent être adapté aux besoins expérimentaux17,18,19,20,21. L'expression de ces gènes de journaliste confère uracil, histidine, et prototrophy d'adénine, respectivement. Le journaliste URA3 ne permet pas la croissance des cellules en présence de 5-FOA ainsi, et donc il peut être contre-sélectionné. Le système de reporter ADE2 a l'avantage qu'en plus de la sélection nutritionnelle, il permet l'identification de cellules de levure qui expriment des cellules sauvages (c.-à-d. fonctionnelles sur l'expression ADE2) ou mutantes (c.-à-d.,non fonctionnelles sur ADE2 ) P53 de la couleur de la colonie.
Par exemple, les cellules de levure exprimant le gène ADE2 génèrent des colonies blanches de taille normale sur des plaques contenant des quantités limitantes d'adénine (2,5-5,0 mg/L), tandis que celles qui le transcrivent mal ou ne le transcrivent pas apparaissent sur la même plaque que les plus petites rouges (ou roses) Colonies. Ceci est dû à l'accumulation d'un intermédiaire dans la voie biosynthétique adénine (c.-à-d., P-ribosylamino-imidazole, qui a été précédemment appelé ribotide amino-imidazole ou AIR), qui est converti pour former un pigment rouge. Le gène de journaliste ADE2 basé sur la couleur qualitative a depuis été remplacé par le quantitatif Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Plus récemment, le journaliste de l'ADE2 a été associé au journaliste de lacZ dans un essai facile à marquer, semi-quantitatif, double reporter qui peut être exploité pour sous-classer les mutants P53 en fonction de leur niveau résiduel de fonctionnalité 23.
Des reporters fluorescents tels que l'EGFP (protéine fluorescente verte améliorée) ou DsRed (protéine fluorescente rouge de Discosoma sp. ont également été employés pour l'évaluation quantitative de l'activité de transactivation liée à toutes les mutations de mauvais sens possibles dans le TP53 séquence de codage24. Enfin, la possibilité de combiner les promoteurs réglables pour l'expression de l'allèle P53 avec des souches de levure isogéniques différentes pour le gène RE et/ou reporter a conduit au développement d'une matrice de données qui génère une classification raffinée des souches de levure sérogènes et germinales associées au cancer. mutant P53 alleles25,26,27.
Les approches décrites ci-dessus sont utilisées pour mesurer l'activité transcriptionnelle de la protéine P53. Cependant, l'expression de type sauvage P53 dans la levure S. cerevisiae28 et Schizosaccharomyces pombe29 peut causer un retard de croissance, qui a été associé à l'arrêt du cycle cellulaire28,30 ou mort cellulaire31. Dans les deux cas, l'inhibition de croissance de levure est déclenchée par l'expression élevée de P53 et a été corrélée avec la modulation transcriptionnelle potentielle des gènes endogènes de levure impliqués dans la croissance cellulaire. À l'appui de cette hypothèse, le mutant P53 R273H, qui a perdu sa fonction, n'a pas interféré avec la croissance des cellules de levure lorsqu'il est exprimé à des niveaux similaires à ceux du P5332. Inversement, l'expression dans la levure du mutant toxique P53 V122A (connu pour une activité transcriptionnelle plus élevée par rapport à la nature sauvage P53) a causé un effet inhibiteur de croissance plus fort que le type sauvage P5332.
En outre, il a été démontré que l'homme MDM2 était capable d'inhiber l'activité transcriptionnelle humaine P53 dans la levure, favorisant son ubiquitination et la dégradation subséquente33. En conséquence, la capacité de MDM2 et de MDMX humains d'inhiber l'inhibition de croissance de levure P53-induite a été démontrée32,34. Dans une étude supplémentaire, une corrélation entre l'activité transcriptionnelle P53 et les niveaux d'expression d'actine a été établie, avec l'identification d'un P53 RE putatif en amont sur le gène ACT1 dans la levure32. Constamment, l'expression d'actine a été renforcée par le type sauvage P53 et encore plus par P53 V122A, mais pas par mutant P53 R273H. Inversement, l'expression d'actine par P53 a diminué dans la co-présence des inhibiteurs de P53 MDM2, MDMX, ou pifithrin-MD (un inhibiteur de petite molécule de l'activité transcriptionnelle de P53), compatible avec des résultats basés sur l'analyse de levure-croissance. Fait important, ces résultats ont établi une corrélation entre l'inhibition de la croissance induite par P53 et le degré de son activité dans la levure, qui a également été exploitée pour identifier et étudier de petites molécules modulant les fonctions P5328,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

La découverte que la protéine bien connue des mammifères P53 peut agir comme facteur de transcription (TF) dans la levure S. cerevisiae a permis le développement de différentes analyses fonctionnelles pour étudier les impacts du site de liaison 1) [c.-à-d., élément de réponse (RE)] variantes de séquence sur la spécificité de transactivation de P53 ou 2) mutations de TP53, co-facteurs exprimés, ou petites molécules sur l'activité de transactivation de P53. Différentes applications de recherche de base et translationnelles ont été développées. Expérimentalement, ces approches exploitent deux avantages majeurs du modèle de levure. D'une part, la facilité d'édition du génome permet la construction rapide de systèmes de reporter qualitatifs ou quantitatifs en exploitant des souches isogéniques qui ne diffèrent qu'au niveau d'un P53-RE spécifique pour étudier la spécificité de la séquence de La transactivation. D'autre part, la disponibilité de systèmes réglementés pour l'expression ectopique P53 permet l'évaluation de la transactivation dans un large éventail d'expression protéique. Les systèmes largement utilisés qui sont basés sur les gènes des journalistes de couleur, la luciferase et la croissance de la levure pour illustrer leurs principales étapes méthodologiques et évaluer de façon critique leur pouvoir prédictif sont examinés dans ce rapport. En outre, l'extrême polyvalence de ces approches peut être facilement exploitée pour étudier différents TFs, y compris P63 et P73, qui sont d'autres membres de la famille des gènes TP53.

Construction de ADE2 (En) ou LUC1 LUC1 souches de levure journaliste
Ledelitto perfettoapproach12,14,15,16 a été adapté pour permettre la construction de souches de levure squelin P53 repo...

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Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Présenté ici sont quatre protocoles pour construire et exploiter la levure Saccharomyces cerevisiae reporter souches pour étudier le potentiel humain de transactivation P53, les impacts de ses diverses mutations associées au cancer, co-exprimé protéines d'interaction, et les effets de petites molécules spécifiques.

Levure comme un châssis pour le développement des essais fonctionnels pour étudier l'homme P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Bonjour, je m’appelle Bartolomeo Bosco, et je suis doctorant au Laboratoire de réseau transcriptionnel du Centre de biologie intégrative de l’Université de Trento en Italie. Comme vous le savez, la transcription est un processus extrêmement complexe impliquant l’organisation spatiale et temporelle du facteur de transcription et du cofacteur. La plupart d’entre eux, y compris le P53 humain, reconnaissent des éléments spécifiques cis-agissant, appelés éléments de réponse, et la liaison sur ce séquençage de l’ADN est nécessaire pour la modulation de la transcription des gènes cibles.Dans ce travail, nous aimerions vous montrer le protocole pour étudier la séquence P53 spécifique dans les fonctions de transactivation en utilisant la levure comme un système modèle comme protéine dans un gène reporter de couleur ou la luciferase ou sur la quantification de la croissance cellulaire pour mettre en évidence les principales étapes expérimentales et la polyvalence de ces approches. Protocole 1, construction de souches de levure reporter qui contiennent un élément spécifique de réponse P53 en amont de l’adénone-2 ou le gène luciferase firefly. Pour construire une souche reporter, suivez d’abord les étapes 1.1 à 1.15 pour transformer les cellules de levure avec des oligonucléotides ciblant la région promoteur désirée.La transformation est basée sur le protocole standard basé sur l’acétate de lithium. Une fois que les transformateurs apparaissent sur les plaques 5-FOA, généralement après trois jours d’incubation à 30 degrés, répliquez-les sur des plaques YPDA non sélectives et aussi sur des plaques YPDA contenant G418, marquant chaque plaque pour faciliter leur comparaison ultérieure. Incuber les assiettes toute la nuit à 30 degrés.Le lendemain, identifiez les souches de journalistes candidats des colonies sensibles au G418 mais qui ont grandi sur les plaques de la YPDA. Stries les colonies identifiées sur une nouvelle plaque YPDA pour obtenir des isolats de colonie unique, et les laisser croître pendant deux jours à 30 degrés. Vérifiez l’intégration correcte de l’élément de réponse P53 désiré, en effectuant une réaction PCR avec les conditions mentionnées à l’étape 1.20.Chargez un aliquot du produit PCR sur du gel d’agarose pour vérifier la longueur d’amplicon correcte avant le séquençage Sanger. Protocole deux, nous présentons un exemple de la façon d’évaluer la capacité de transactivation des protéines P53 en utilisant l’analyse qualitative de levure à base de couleur adénoine-2. Transformez les cellules de levure avec des vecteurs d’expression P53 suivant le même protocole à base d’acétate de lithium décrit dans la première section.Stries colonies transformatrices de levure unique, jusqu’à six par plaque, sur une nouvelle plaque sélective, et laissez-les croître pendant la nuit à 30 degrés. Le lendemain, à l’aide de velours stériles, répliquez les stries sur de nouvelles plaques sélectives qui permettent d’évaluer le phénotype de couleur, c’est-à-dire les plaques sélectives contenant une quantité limitative d’adénone.Incuber à 30 degrés pendant trois jours. Les mêmes stries peuvent être plaquées réplique plusieurs fois. Protocole trois, nous présentons maintenant un exemple de l’évaluation de la capacité de transactivation des protéines P53 à l’aide de l’analyse quantitative de levure LUC1 à base de luminescence.Tout d’abord, transformer les cellules de levure avec des vecteurs d’expression P53 suivant, encore une fois, le protocole à base d’acétate de lithium décrit dans la section deux. Patch transformants simples sur de nouvelles plaques sélectives contenant du glucose comme source de carbone, et laissez-les croître à 30 degrés pendant la nuit. Pour chaque type de transformation, faire cinq à sept correctifs différents.Après la croissance pendant la nuit, résuspendez une petite quantité de cellules à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de pipette dans un milieu sélectif synthétique contenant du raffinose comme source de carbone. Ces suspensions cellulaires devraient avoir une densité optique à 600 nanomètres autour de 0,4 et peuvent ensuite être divisées en plusieurs plaques de 96 puits pour incubation à des températures, traitements, ou pour exposer les cellules à une quantité variable de galactose pour activer l’expression P53. Pour mesurer l’activité du journaliste firefly, transférez 10 à 20 microlitres de suspension cellulaire de la plaque transparente de 96 puits dans une plaque blanche de 384 puits, et mélangez les cellules avec un volume égal de tampon de lyse, en incubation pendant 10, 15 minutes à température ambiante sur un shaker.Ajouter 10, 20 microlitres de substrat luciferase firefly. Et mesurez les unités lumineuses à l’aide d’un lecteur de plaques multilabel. Mesurer également la densité optique des cultures dans la plaque de 96 puits.Protocole quatre, nous présentons maintenant un exemple de la façon d’exploiter l’inhibition de la croissance de la levure induite par P53. Transformez les cellules de levure avec des vecteurs d’expression P53, ou cotransformez-les avec des vecteurs d’expression pour coexprimer P53 et l’un de ses cofacteurs, tels que MDM2, suivant, encore une fois, le protocole basé sur l’acétate de lithium décrit dans la première section. Cultiver des cellules transformatrices dans un milieu sélectif à environ une densité optique.Et diluer à 0,05, et ajouter une molécule choisie à la concentration appropriée. Incuber les cellules à 30 degrés sur un shaker pendant 42 heures. Ensuite, les graines 100 microlitres de la culture cellulaire de levure dans les plaques moyennes sélectives minimales.Incuber pendant deux jours à 30 degrés. L’intégration re correcte à la place de la cassette ICORE peut être vérifiée par la colonie PCR, à partir d’une petite quantité de cellules à partir de clones de levure candidats et en utilisant des amorces décrites dans le tableau trois pour amplifier le locus ciblé. Les produits PCR, une bande d’environ 500 nucléotides, peuvent ensuite être vérifiés par séquençage Sanger pour confirmer la séquence de l’emplacement génomique modifié pour la présence de la séquence d’élément de réponse P53 correcte.La souche reporter est prête à être utilisée dans les tests fonctionnels. Pour évaluer la capacité de transactivation des protéines P53, vérifiez la couleur des colonies de levures. Par exemple, nous présentons une comparaison entre p53 de type sauvage et les mutants R175H et R282W en utilisant deux reporters différents, P21-5-prime et PUMA, et deux températures différentes, 30 degrés et 37 degrés.Fait intéressant, alors que le R175H est un allèle P53 en perte de fonction, colonies rouges dans toutes les conditions, R282W montre une sensibilité à la température avec une activité de transactivation résiduelle à 30 degrés, entraînant des colonies blanches, mais une perte d’activité à 37 degrés, entraînant des colonies rouges ou roses. Un ensemble de données étendu est présenté dans la figure deux B.Wild-type P53 dans quatre allèles mutants ont été testés pour la transactivation en utilisant 10 différentes souches de reporter élément de réponse P53, trois températures, et les niveaux d’expression constitutive. Les résultats sont résumés dans un code de couleur qui rappelle le phénotype de couleur de colonie de levure.L’allèle mutant P53 K139E conserve une activité partielle et est sensible au froid. Par exemple, les colonies sont rouges dans la souche de journaliste GADD45 à 24 et 30 degrés, mais elles sont blanches à 37 degrés. Ici, nous présentons un exemple de résultats obtenus avec cette méthode, comparant la spécificité de transactivation de la levure humaine et C.elegans P53.Les résultats dans le graphique à barres sont exprimés en unités moyennes de lumière relative avec erreur standard de quatre répétitions. Cinq éléments de réponse P53 différents ont été comparés. Trois niveaux différents d’expression protéique P53 ont été testés en variant la concentration de galactose dans le milieu.Les deux orthologs P53 montrent une spécificité de transactivation nettement différente. Ceci est illustré par les résultats avec des éléments de réponse ced13 et V1 qui partagent la même séquence, à l’exception de la présence ou de l’absence d’un espaceur de 28 nucléotides. Human P53 présente une transactivation beaucoup plus élevée avec le site de liaison V1, tandis que C.elegans P53 montre le contraire.Les résultats sont indépendants du niveau d’expression P53 sous le promoteur galactose-inducible. Mesurer la croissance de la levure en comptant le nombre de colonies obtenues dans la culture des 100 microlitres diminue. Calculer l’effet de réactivation mutante des composés considérant la croissance de type sauvage P53 exprimant la levure comme l’effet maximal possible, fixé à 100%, tandis que la croissance des cellules exprimant mutant P53 représentent zéro niveau de réactivation.Dans cet exemple, Nutlin-3a soulage l’inhibition du P53 de type sauvage causée par la coexpression de MDM2, tandis que PhiKan083 réactive partiellement le mutant Y220C P53. Dans les deux cas, il en résulte une réduction de la croissance de levure dépendante du P53. Les cellules basales de levure se sont avérées utiles pour étudier les valeurs, aspects des fonctions protéiques P53.Le protocole décrit dans ce travail est particulièrement sensible pour évaluer le potentiel de transactivation du P53 mutant de type sauvage ou associé au cancer aux variantes des sites cibles. En outre, l’approche peut être utilisée pour identifier les petites molécules affectant les fonctions P53 et pour étudier l’interaction P53 avec le cofacteur. L’utilisation des reporters de couleur, la miniaturisation de la luciferase, ainsi que le test d’inhibition de la croissance aboutit à des analyses rentables et évolutives potentiellement susceptibles de dépistage de la bibliothèque chimique.Enfin, le système décrit dans ce travail peut être facilement adopté avec l’étude d’autres facteurs de transcription spécifiques à la séquence.

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The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Le Colon-26 Carcinome portant une tumeur de la souris comme modèle pour l&#39;étude du cancer cachexie

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Épreuves d’imagerie de cellules vivantes pour étude glioblastome Brain Tumor Stem Cell Migration et Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Les cultures organoïdes de la prostate comme outils pour traduire les génotypes et les profils mutationnels en réponses pharmacologiques

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Essai combiné de formation conditionnelle et de formation de sphère adapté pour étudier un gène associé à la stemness des cellules souches du cancer gastrique dérivés par le patient

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Surveillance de l’assemblage eIF4F en mesurant l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Utilisation de l’outil E1A Minigene pour étudier les changements d’épissage de l’ARNm

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flux de travail de dépistage rapide pour identifier la thérapie combinée potentielle pour le GBM à l’aide de cellules souches de gliome dérivées du patient

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Les sphéroïdes épithéliaux et endothéliaux mammaires comme modèle fonctionnel in vitro potentiel pour la recherche sur le cancer du sein

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...