Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
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Wir danken der Europäischen Union (FEDER-Fonds POCI/01/0145/FEDER/007728 durch Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) und nationalen Fonds (FCT/MEC, Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia und Ministério da Educaéo e Ciéncia) unter der Partnerschaftsabkommen PT2020 UID/QUI/50006/2019 und die Projekte (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT-Stipendien: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Diese Arbeit wurde von der Compagnia S. Paolo, Turin, Italien (Projekt 2017.0526) und dem Gesundheitsministerium(Projekt 5x1000, 2015 und 2016; aktuelle Forschung 2016) unterstützt. Wir danken Dr. Teresa Lépez-Arias Montenegro (Universität Trient, Lehrlaboratorien für experimentelle Wissenschaften) für die Unterstützung bei der Videoaufzeichnung.

1. Bau von ADE2- oder LUC1-Reporterhefestämmen, die einen spezifischen RE (yAFM-RE oder yLFM-RE) enthalten 
<ol><li>Streak a yAFM-ICORE oder yLFM-ICORE Stamm12,14 (ICORE = I, ISce-I Endonuklease unter GAL1 Promoter; CO = zählerlich wählbar URA3; RE = Reporter KanMX4 verleiht Kanamycin-Widerstand; Tabelle 1) aus einem 15% Glycerinbestand, der bei -80 °C auf einer YPDA-Agarplatte gelagert wird (<st...

Hefebasierte Assays haben sich als nützlich erwiesen, um verschiedene Aspekte der P53-Proteinfunktionen zu untersuchen. Diese Assays sind besonders empfindlich für die Bewertung des P53-Transaktivierungspotenzials gegenüber Varianten von RE-Zielstandorten, einschließlich der Bewertung funktioneller Polymorphismen. Der Einsatz von Farbreportern sowie die Miniaturisierung des Luziferase-Assays führen zu kostengünstigen und relativ skalierbaren Assays. Außerdem ist der Wachstumsinhibitionstest potenziell für den Ein...

Die Transkription ist ein äußerst komplexer Prozess, bei dem die dynamische, räumliche und zeitliche Organisation von Transkriptionsfaktoren (TFs) und Kofaktoren für die Rekrutierung und Modulation von RNA-Polymerasen in Chromatinregionen als Reaktion auf spezifische Reize1 . Die meisten TFs, einschließlich des menschlichen P53-Tumorsuppressors, erkennen bestimmte cis-wirkende Elemente in Form von DNA-Sequenzen, sogenannten Response-Elementen (REs), die aus einzelnen (oder mehreren) einzigartigen Motiven bestehen, die 6-10 Nukleotide lang sind. Innerhalb dieser Motive können einzelne Positionen verschiedene Variabilitätsgrade2aufweisen, in der Regel nach Positionsgewichtsmatrizen (PWM) oder Logos3,4zusammengefasst.
Die Hefe S. cerevisiae ist ein geeignetes Modellsystem zur Untersuchung verschiedener Aspekte menschlicher Proteine durch Komplementierungs-Assays, ektopische Expression und funktionelle Assays, selbst wenn ein orthologoxes Hefegen nicht vorhanden ist5, 6 , 7. Aufgrund der evolutionären Konservierung von Basalkomponenten des Transkriptionssystems8können viele menschliche TFs (wenn sie ektopisch in Hefezellen ausgedrückt werden) die Expression eines Reportergens modulieren, indem sie durch Promotoren wirken, die entsprechende REs enthalten. Das hier vorgestellte Transkriptionsmodellsystem für humane P53 zeichnet sich durch drei Hauptvariablen aus, deren Wirkungen moduliert werden können: 1) die Modalität der Expression und Art von P53, 2) die RE-Sequenz, die P53-abhängige Transkription steuert, und 3) die Art der Reportergen (Abbildung 1A).
Hinsichtlich der Modalität des P53-Ausdrucks ermöglicht S. cerevisiae die Wahl zwischen induzierbaren, druckbaren oder konstitutiven Promotoren9,10,11. Insbesondere erlaubt der induzierbare GAL1-Promotor die basale (mit Raffinose als Kohlenstoffquelle) oder variable (durch Änderung der Galaktosemenge in den Medien) Expression eines TF in Hefe. Tatsächlich stellt der fein abgestimmte Ausdruck eine kritische Entwicklung dar, um nicht nur P53 selbst, sondern auch andere Proteine der P53-Familie12,13zu studieren.
In Bezug auf die Art der REs, die den P53-abhängigen Ausdruck steuern, ermöglicht S. cerevisiae die Konstruktion verschiedener Reporterstämme, die einzigartige Unterschiede im RE-Interesse in einem ansonsten isogenen Hintergrund aufweisen. Dieses Ziel wird mit einer Anpassung eines besonders vielseitigen Genom-Editing-Ansatzes erreicht, der in S. cerevisiaeentwickelt wurde, genannt delitto perfetto12,14,15,16.
Darüber hinaus können verschiedene Reportergene (d. h. URA3, HIS3 und ADE2) verwendet werden, um transkriptionelle Aktivitäten menschlicher TFs in S. cerevisiaequalitativ und quantitativ zu bewerten. auf experimentelle Bedürfnisse zugeschnitten sein17,18,19,20,21. Die Expression dieser Reportergene verleiht Uracil, Histidin und Adeninprototrophie. Der URA3-Reporter lässt auch das Wachstum von Zellen in Gegenwart von 5-FOA nicht zu und kann somit gegengewählt werden. Das ADE2-Reportersystem hat den Vorteil, dass es neben der Ernährungsauswahl die Identifizierung von Hefezellen ermöglicht, die Wildtyp (d. h. funktional bei ADE2-Expression) oder mutiert (d. h.nicht funktionsfähig auf ADE2) exprimieren. ) P53 aus der Koloniefarbe.
Zum Beispiel erzeugen Hefezellen, die das ADE2-Gen exzieren, normalerweise große weiße Kolonien auf Platten, die begrenzende Mengen an Adenin (2,5-5,0 mg/L) enthalten, während solche, die es schlecht oder nicht transkribieren, auf derselben Platte wie kleinere rote (oder rosa) Kolonien. Dies ist auf die Anhäufung eines Zwischenprodukts im Biosynthetischen Adenin (d. h. P-Ribosylamino-Imidazol, das zuvor Amino-Imidazol-Ribot oder AIR genannt wurde), das zu einem roten Pigment umgewandelt wird. Das qualitative farbbasierte ADE2-Reportergen wurde seitdem durch das quantitative Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22ersetzt. In jüngerer Zeit wurde der ADE2-Reporter mit dem lacZ-Reporter in einem leicht zu bewertenden, semi-quantitativen Doppelreporter-Assay kombiniert, der genutzt werden kann, um P53-Mutanten nach ihrem Restfunktionsgrad zu unterklassifizieren. 23.
Fluoreszierende Reporter wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein) wurden auch für die quantitative Bewertung der Transaktivierungsaktivität im Zusammenhang mit allen möglichen Missense-Mutationen in der TP53-Codierungssequenz24. Schließlich hat die Chance, abstimmbare Promotoren für die P53-Allelexpression mit isogenen Hefestämmen zu kombinieren, die sich für das RE- und/oder Reportergen unterscheiden, zur Entwicklung einer Datenmatrix geführt, die eine verfeinerte Klassifizierung von krebsassoziierter und Keimbahn erzeugt. Mutante P53 Allele25,26,27.
Die oben beschriebenen Ansätze werden verwendet, um die Transkriptionsaktivität des P53-Proteins zu messen. Die Expression von Wildtyp P53 in der Hefe S. cerevisiae28 und Schizosaccharomyces pombe29 kann jedoch zu Wachstumsverzögerungen führen, die mit Zellzyklusstillstand28,30 oder Zelltod31. In beiden Fällen wird die Hefewachstumshemmung durch eine hohe P53-Expression ausgelöst und mit einer möglichen transkriptionellen Modulation endogener Hefegene korreliert, die am Zellwachstum beteiligt sind. Zur Untermauern dieser Hypothese störte der Funktionsverlustmutant P53 R273H das Wachstum der Hefezellen nicht, wenn er auf ähnlichen Ebenen wie wildartig P5332ausgedrückt wurde. Umgekehrt verursachte die Expression des toxischen Mutanten P53 V122A (bekannt für eine höhere Transkriptionsaktivität im Vergleich zum Wildtyp P53) in Hefe eine stärkere wachstumshemmende Wirkung als der Wildtyp P5332.
Zusätzlich wurde gezeigt, dass humanes MDM2 in der Lage war, die menschliche P53-Transkriptionsaktivität in Hefe zu hemmen und seine Ubiquitination und den anschließenden Abbau zu fördern33. Dementsprechend wurde die Fähigkeit von humanem MDM2 und MDMX, P53-induzierte Hefewachstumshemmung zu hemmen,32,34gezeigt. In einer zusätzlichen Studie wurde eine Korrelation zwischen der Transkriptionsaktivität P53 und den Actin-Expressionsspiegeln festgestellt, wobei ein vermeintliches P53 RE vor dem ACT1-Gen in Hefe32identifiziert wurde. Konsequentwurde die Actin-Expression durch den Wildtyp P53 und noch mehr durch P53 V122A, nicht aber durch mutierte P53 R273H verstärkt. Umgekehrt verringerte sich die Aktinexpression durch P53 in der Kopräsenz der P53-Inhibitoren MDM2, MDMX oder Pifithrin-A (ein kleinmolekularer Inhibitor der P53-Transkriptionsaktivität), die mit den Ergebnissen auf der Grundlage des Hefewachstums-Assays übereinstimmten. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse eine Korrelation zwischen der P53-induzierten Wachstumshemmung und dem Grad ihrer Aktivität in Hefe feststellten, die auch genutzt wurde, um kleine Moleküle zu identifizieren und zu untersuchen, die P53-Funktionen modulieren28,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

Die Feststellung, dass das bekannte Säugetier-P53-Protein als Transkriptionsfaktor (TF) in der Hefe S. cerevisiae fungieren kann, hat die Entwicklung verschiedener funktioneller Assays ermöglicht, um die Auswirkungen von 1) Bindungsstellen zu untersuchen [d.h. Das Ansprechelement (RE)] Sequenzvarianten auf P53-Transaktivierungsspezifität oder 2) TP53-Mutationen, koexprimierte Kofaktoren oder kleine Moleküle bei P53-Transaktivierungsaktivität. Es wurden verschiedene Basis- und translationale Forschungsanwendungen entwickelt. Experimentell nutzen diese Ansätze zwei wesentliche Vorteile des Hefemodells aus. Einerseits ermöglicht die einfache Genombearbeitung den schnellen Aufbau qualitativer oder quantitativer Reportersysteme, indem isogene Stämme genutzt werden, die sich nur auf der Ebene eines spezifischen P53-RE unterscheiden, um die sequenzionizifizium abhängige P53-abhängige Transaktivierung. Andererseits ermöglicht die Verfügbarkeit regulierter Systeme für die ektopische P53-Expression die Auswertung der Transaktivierung in einer Vielzahl von Proteinexpressionen. Bewertet in diesem Bericht sind ausgiebig verwendete Systeme, die auf Farbreporter-Gene, Luziferase und das Wachstum von Hefe basieren, um ihre wichtigsten methodischen Schritte zu veranschaulichen und ihre Vorhersagekraft kritisch zu bewerten. Darüber hinaus kann die extreme Vielseitigkeit dieser Ansätze leicht genutzt werden, um verschiedene TFs zu untersuchen, einschließlich P63 und P73, die andere Mitglieder der TP53-Genfamilie sind.

Bau von ADE2 oder LUC1 Reporter Hefe-Stämme
Derdelitto perfettoapproach12,14,15,16 wurde angepasst, um den Bau von P53 Reporter Hefestämmen zu ermöglichen ( Abbildung1...

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Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Hallo, mein Name ist Bartolomeo Bosco, und ich bin Doktorand am Laboratory of Transcriptional Network am Zentrum für Integrative Biologie der Universität Trient in Italien. Wie Sie wissen, ist die Transkription ein äußerst komplexer Prozess, bei dem der Transkriptionsfaktor und der Kofaktor räumlich und zeitlich organisiert werden. Die meisten von ihnen, einschließlich der menschlichen P53, erkennen bestimmte cis-wirkende Elemente, sogenannte Response-Elemente, und die Bindung an diese DNA-Sequenzierung ist für die Modulation der Transkription von Zielgenen erforderlich.In dieser Arbeit möchten wir Ihnen das Protokoll zeigen, um P53-Sequenz spezifisch in Transaktivierungsfunktionen zu untersuchen, indem Hefe als Modellsystem als Protein in einem Farbreporter-Gen oder der Luziferase oder über die Quantifizierung des Zellwachstums verwendet wird, um die wichtigsten experimentellen Schritte und die Vielseitigkeit dieser Ansätze hervorzuheben. Protokoll eins, Konstruktion von Reporterhefestämmen, die ein bestimmtes P53-Antwortelement vor dem Adenin-2 oder dem Galleififegen enthalten. Um einen Reporterstamm zu konstruieren, folgen Sie zunächst den Schritten 1.1 bis 1.15, um Hefezellen mit Oligonukleotiden zu transformieren, die auf die gewünschte Promotorregion abzielen.Die Transformation basiert auf dem Standard-Lithiumacetat-basierten Protokoll. Sobald Die Transformationsmittel auf 5-FOA-Platten erscheinen, in der Regel nach drei Tagen inkubationsgrad bei 30 Grad, verkleben Sie sie auf nicht-selektive YPDA-Platten und auch auf YPDA-Platten, die G418 enthalten, und markieren jede Platte, um ihren späteren Vergleich zu erleichtern. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 30 Grad.Am nächsten Tag, identifizieren Sie den Kandidaten Reporter Stämme aus Kolonien, die G418-empfindlich sind, aber auf YPDA-Platten wuchs. Streifen Sie die identifizierten Kolonien auf einer neuen YPDA-Platte, um einzelne Kolonieisolate zu erhalten, und lassen Sie sie für zwei Tage bei 30 Grad wachsen. Überprüfen Sie die korrekte Integration des gewünschten P53-Antwortelements und führen Sie eine PCR-Reaktion mit den in Schritt 1.20 genannten Bedingungen durch.Laden Sie ein Aliquot des PCR-Produkts auf Agarose-Gel, um die korrekte Amplikonlänge vor der Sanger-Sequenzierung zu überprüfen. Protokoll zwei, wir präsentieren ein Beispiel, wie P53 Protein-Transaktivierungsfähigkeit mit dem qualitativen farbbasierten Adenin-2-Hefe-Assay zu bewerten. Transformieren Sie Hefezellen mit P53-Expressionsvektoren nach demselben Lithiumacetat-basierten Protokoll, das in Abschnitt 1 beschrieben wird.Streifen einzelne Hefe transformant Kolonien, bis zu sechs pro Platte, auf einer neuen selektiven Platte, und lassen Sie sie über Nacht bei 30 Grad wachsen. Am Tag danach, mit sterilem Samt, Nachbildung Platte die Streifen auf neue selektive Platten, die für die Beurteilung der Farbe Phänotyp ermöglichen, d.h. selektive Platten mit begrenzender Menge an Adenin.Drei Tage lang bei 30 Grad inkubieren. Dieselben Streifen können mehrmals nachgebaut werden. Protokoll drei, wir präsentieren jetzt ein Beispiel für die Bewertung der P53 Protein-Transaktivierungsfähigkeit mit dem quantitativen Lumineszenz-basierten LUC1-Hefe-Assay.Erstens transformieren Sie Hefezellen mit P53-Expressionsvektoren, die wiederum dem in Abschnitt 2 beschriebenen Lithiumacetat-basierten Protokoll folgen. Patch einzelne Transformantien auf neuen selektiven Platten, die Glukose als Kohlenstoffquelle enthalten, und lassen Sie sie bei 30 Grad über Nacht wachsen. Erstellen Sie für jeden Transformationstyp fünf bis sieben verschiedene Patches.Nach dem nächtlichen Wachstum eine kleine Menge von Zellen mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Pipettenspitze in synthetischen selektiven Mediums, das Raffinose als Kohlenstoffquelle enthält, wieder aussetzen. Diese Zellsuspensionen sollten eine optische Dichte von 600 Nanometern um 0,4 aufweisen und können dann in mehrere 96-Well-Platten aufgeteilt werden, um sie bei unterschiedlichen Temperaturen, Behandlungen oder zur Expression von Zellen einer unterschiedlichen Galaktosemenge auszusetzen, um die P53-Expression zu aktivieren. Um die Galle-Reporteraktivität zu messen, übertragen Sie 10 bis 20 Mikroliter Zellsuspension von der transparenten 96-Well-Platte in eine weiße 384-Well-Platte und mischen Sie die Zellen mit einem gleichen Volumen von Lysepuffer, inkubieren für 10, 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Shaker.10, 20 Mikroliter Galleifife Substrat hinzufügen. Und messen Sie Lichteinheiten mit einem Multilabel-Plattenleser. Messen Sie auch die optische Dichte der Kulturen in der 96-Well-Platte.Protokoll vier, wir präsentieren jetzt ein Beispiel dafür, wie die Hemmung des Wachstums von Hefe durch P53 induziert zu nutzen. Transformieren Sie Hefezellen mit P53-Expressionsvektoren oder transformieren Sie sie mit Expressionsvektoren, um P53 und einen seiner Cofaktoren, wie MDM2, zu koexieren, und folgen Sie dem in Abschnitt 1 beschriebenen Lithiumacetat-basierten Protokoll. Wachsen Sie transformierende Zellen in selektiven mittleren bis etwa eine optische Dichte.Und verdünnen Sie sie auf 0,05, und fügen Sie ein ausgewähltes Molekül zu der entsprechenden Konzentration hinzu. Inkubieren Sie Zellen bei 30 Grad auf einem Shaker für 42 Stunden. Dann säen Sie 100 Mikroliter Hefezellkultur in minimalen selektiven mitteltellern.Zwei Tage bei 30 Grad inkubieren. Die korrekte RE-Integration anstelle der ICORE-Kassette kann durch Kolonie-PCR überprüft werden, beginnend mit einer winzigen Menge von Zellen aus Kandidatenhefe-Klonen und mit Primern, die in Tabelle 3 beschrieben sind, um den Zielort zu verstärken. PCR-Produkte, ein Band von etwa 500 Nukleotiden, können dann durch Sanger-Sequenz überprüft werden, um die Sequenz der bearbeiteten genomischen Position auf das Vorhandensein der richtigen P53-Antwortelementsequenz zu bestätigen.Die Reporter-Sorte ist bereit, in funktionellen Assays verwendet zu werden. Um die Transaktivierungsfähigkeit des P53-Proteins zu bewerten, überprüfen Sie die Farbe der Hefekolonien. Zum Beispiel präsentieren wir einen Vergleich zwischen Wildtyp P53 und den Mutanten R175H und R282W mit zwei verschiedenen Reportern, P21-5-prime und PUMA, und zwei verschiedenen Temperaturen, 30 Grad und 37 Grad.Interessanterweise ist R175H ein Funktionsverlust P53-Allel, rote Kolonien unter allen Bedingungen, R282W zeigt Temperaturempfindlichkeit mit Resttransaktivierungsaktivität bei 30 Grad, was zu weißen Kolonien, aber Verlust der Aktivität bei 37 Grad, was zu roten oder rosa Kolonien. Ein erweiterter Datensatz wird in Abbildung zwei B.Wild-Typ P53 in vier mutierten Allelen dargestellt, die auf Transaktivierung mit 10 verschiedenen P53-Antwortelement-Reporterstämmen, drei Temperaturen und konstitutiven Expressionswerten getestet wurden. Die Ergebnisse werden in einem Farbcode zusammengefasst, der an den Hefekolonie-Farbphänotyp erinnert.Das Mutantallel P53 K139E behält eine Teilaktivität und ist kälteempfindlich. Zum Beispiel sind Kolonien in der GADD45 Reporter-Sorte bei 24 und 30 Grad rot, aber sie sind mit 37 Grad weiß. Hier stellen wir ein Beispiel für Ergebnisse vor, die mit dieser Methode erzielt wurden, und vergleichen die Transaktivierungssspezifität von humaner und C.eleganer P53-Hefe.Die Ergebnisse im Balkendiagramm werden als durchschnittliche relative Lichteinheiten mit einem Standardfehler von vier Replikationen ausgedrückt. Fünf verschiedene P53-Antwortelemente wurden verglichen. Drei verschiedene Konzentrationen der P53-Proteinexpression wurden getestet, indem die Galaktosekonzentration im Medium variiert wurde.Die beiden P53-Orthologs weisen eine deutlich unterschiedliche Transaktivierungssspezifität auf. Dies wird durch die Ergebnisse mit ced13- und V1-Antwortelementen veranschaulicht, die dieselbe Sequenz aufweisen, mit Ausnahme des Vorhandenseins oder Fehlens eines 28-Nukleotid-Abstandsers. Human P53 weist eine viel höhere Transaktivierung mit der V1-Bindungsstelle auf, während C.elegans P53 das Gegenteil zeigt.Die Ergebnisse sind unabhängig von der Ebene des P53-Ausdrucks unter dem galactose-induzierbaren Promotor. Messen Sie das Hefewachstum, indem Sie die Anzahl der Kolonien zählen, die in der 100-Mikroliter-Kulturabsenkungen erhalten wurden. Berechnen Sie die mutierte reaktivierende Wirkung von Verbindungen unter Berücksichtigung des Wachstums von Wildtyp P53, die Hefe als maximal möglichen Effekt ausdrücken, der auf 100% eingestellt ist, während das Wachstum von Zellen, die mutiertep P53 exdrücken, null Reaktivierungsniveau darstellt.In diesem Beispiel entlastet Nutlin-3a die Hemmung des Wildtyps P53, die durch die Koexpression von MDM2 verursacht wird, während PhiKan083 die Y220C P53-Mutation teilweise reaktiviert. In beiden Fällen führt dies zu einer P53-abhängigen Verringerung des Hefewachstums. Hefebasalzellen haben sich als nützlich erwiesen, um Werte, Aspekte der P53-Proteinfunktionen zu untersuchen.Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll ist besonders empfindlich für die Bewertung des Transaktivierungspotenzials von Wildtyp- oder krebsassoziierten Mutanten P53 zu Varianten von Zielstandorten. Darüber hinaus kann der Ansatz verwendet werden, um kleine Moleküle zu identifizieren, die P53-Funktionen beeinflussen, und die P53-Interaktion mit Cofactor zu untersuchen. Der Einsatz der Farbreporter, die Miniaturisierung der Luziferase sowie der Wachstumshemmungstest führen zu kostengünstigen und skalierbaren Assays, die für das Screening chemischer Bibliotheken potenziell geeignet sind.Schließlich kann das in dieser Arbeit beschriebene System leicht mit der Untersuchung anderer sequenzspezifischer Transkriptionsfaktoren übernommen werden.

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Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostataorganoidkulturen als Werkzeuge zur Übersetzung von Genotypen und Mutationsprofilen in pharmakologische Reaktionen

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Verwendung des E1A Minigene Tools zur Untersuchung von mRNA-Spleißänderungen

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...