Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

אנו מודים לאיחוד האירופי (כספי פדר poci/01/0145/פדר/007728 באמצעות מתכנתים המבצע מפעל להתחרות) וכספים לאומיים (fct/MEC, האופרה הלאומית של ciência e ומיניצ) באמצעות ה הסכם שותפות PT2020 UID/קי/50006/2019 והפרוייקטים (3599-PPCDT) לפטין/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-פדר-016581. מלגות FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. גומז). עבודה זו נתמכת על ידי Compagnia S. פאולו, טורינו, איטליה (פרויקט 2017.0526) ומשרד הבריאות, (פרויקט 5x1000, 2015 ו 2016; המחקר הנוכחי 2016). אנו מודים עמוקות ד ר תרזה לופס-אריות מונטנגרו (אוניברסיטת טרנטו, מעבדות לימוד של מדעים ניסיוניים) לסיוע בהקלטת וידאו.

1. בנייה של ADE2 או LUC1 כתבת זנים שמרים המכיל מחדש מסוים (YAFM-re או ylfm-re)
<ol><li>פס yAFM icore או ylfm-icore להתאמץ12,14 (icore = אני, isce-i endonuclease תחת GAL1 יזם; CO = מונה לבחירה URA3; RE = כתבת KanMX4 הענקת התנגדות לקנאמיצין; שולחן 1) מ 15% מניות גליצרול שאוחסנו ב-80 ° ...

שמרים מבוססי בחני הוכיחו שימושי כדי לחקור היבטים שונים של פונקציות חלבון P53. בחני אלה רגישים במיוחד להערכת פוטנציאל ההפעלה הפעלת כלפי משתנים של אתרי יעד RE, כולל הערכה של פולימריות פונקציונלי. השימוש כתבים צבע, כמו גם המזעור של התוצאה לוציפראז תוצאות בעלות חסכונית ומדרגי יחסית. כמו כן, מבחן ...

תמלול הוא תהליך מורכב מאוד הכרוך בפעילות דינמית, מרחבית וטמפורלית של גורמי שעתוק (TFs) וקופנים לגיוס ואפנון של RNA פולימות על אזורי כרומטין בתגובה לגירויים ספציפיים1 . רוב TFs, כולל מדכא הגידול האנושי P53, לזהות רכיבים ספציפיים משחק ציס בצורה של רצפי DNA הנקרא רכיבי תגובה (REs), אשר מורכב של יחיד (או מספר) מוטיבים ייחודיים ~ 6-10 נוקלאוטידים ארוך. בתוך מוטיבים אלה, עמדות בודדות עשויות להראות דרגות שונות של השונות2, מסוכמים בדרך כלל על ידי מטריצות משקל מיקום (pwm) או לוגו3,4.
שמרים S. cerevisiae ס היא מערכת המודל המתאים ללמוד היבטים שונים של חלבונים אנושיים דרך compleמנטציה, ביטוי חוץ רחמי, ומוסר פונקציונלי, גם כאשר גן שמרים אורתוולוגי אינו נוכח5, מיכל בן 6 , 7. בשל השימור האבולוציוני של רכיבי בסיס של מערכת הטרנססקריפט8, מספר רב של מערכות האדם (כאשר הביעו הבעה בתאי שמרים) יכולים לווסת את הביטוי של גן עיתונאי על ידי משחק באמצעות יזמים שעברו הנדסה ל הכיל REs מתאים. מערכת מודל התמלול המוצגת כאן עבור P53 אנושי מתאפיינת בשלושה משתנים מרכזיים שהאפקטים יכולים להיות מאופנן: 1) מודאליות של הביטוי והסוג של P53, 2) רצף RE השליטה P53 תלויי שעתוק, ו 3) סוג של גן עיתונאי (איור 1A).
בנוגע למודאליות של הביטוי P53, ס' cerevisiae ס מאפשר בחירה של inducible, מחדש, או קונסטיטוטיביות9,10,11. בפרט, inducible GAL1 יזם מאפשר בסיס (באמצעות רפפינז כמקור פחמן) או משתנה (על ידי שינוי כמות של גלקטוז במדיה) ביטוי של TF ב שמרים. למעשה, הביטוי tunable דק מייצג פיתוח קריטי ללמידה לא רק P53 עצמה אלא גם P53 משפחה אחרים חלבונים12,13.
בנוגע לסוג ה-REs השולט בביטוי התלוי בP53, ס' cerevisiae ס מאפשר בנייה של זנים כתבת שונים בעל הבדלים ייחודיים ב RE של עניין ברקע איזוגניים אחרת. מטרה זו היא להגיע באמצעות הסתגלות של גישה מגוונת במיוחד הגנום לעריכה שפותחה ב -S. cerevisiae ס, הנקרא delitto perfetto12,14,15,16.
יתר על כן, גנים עיתונאי שונים (כלומר, URA3, HIS3, ו- ADE2) ניתן להשתמש באיכות הפעולה והערכה כמותית של הפעילות של tfs האדם ב -S. cerevisiae ס, כל אחד עם תכונות ספציפיות שיכול ל להתאים לצרכים הניסיוניים17,18,19,20,21. הביטוי של הגנים האלה העיתונאי מדבר על ה, היסטידין, ובהתאמה. הכתב הURA3 אינו מאפשר את צמיחת התאים בנוכחות של 5 וכדומה, ולכן ניתן לבחור בו בצורה נגדית. מערכת ADE2 עיתונאי יש את היתרון כי, מלבד הבחירה התזונתית, זה מאפשר זיהוי של תאים שמרים לבטא פראי סוג (כלומר, פונקציונלי על ADE2 ביטוי) או מוטציה (כלומר,לא פונקציונלי על ADE2 ) P53 מצבע המושבה.
לדוגמה, תאים שמרים המבטאים את הגן ADE2 ליצור בגודל בדרך כלל מושבות לבנות על הצלחות המכילות כמויות מגבילות של אדנין (2.5-5.0 mg/L), בעוד אלה כי לא מתאים או לא לתעתזה מופיע על צלחת זהה אדום קטן (או ורוד) מושבות. הדבר נובע מהצטברות של ביניים במסלול הביוסינתטי של אדנין (כלומר, P-ריבוסידלסטינו-סראזול, שנקרא בעבר באופן כולל ובאוויר), המומר ליצירת פיגמנט אדום. הצבע האיכותני המבוססת על ADE2 הוא גן הכתבים מאז הוחלף על ידי הגחלילית הכמותית (LUC1)12,22. לאחרונה, העיתונאי ADE2 כבר בשילוב עם העיתונאי lacz ב קל לציון, חצי כמותי, שיטת עיתונאי כפול כי ניתן לנצל לסווג משנה P53 מוטציות לפי רמת השיורית של פונקציונליות . עשריםואחד
כתבים פלורסנט כגון egfp (חלבון פלורסנט ירוק משופר) או dsred (Discosoma sp. אדום חלבון הניאון) יש גם שימש הערכה כמותית של פעילות ההפעלה הקשורים לכל מוטציות ההיגיון האפשרי ב TP53 ברצף24. לבסוף, הסיכוי של שילוב היזמים tunable עבור ביטוי P53 אלל עם זנים שמרים איזוגניים שונים עבור RE ו/או הגן עיתונאי הובילו לפיתוח של מטריצת נתונים היוצרת סיווג מעודן של סרטן הקשורים ו germline . מוטציה P53 אלטלס25,26,27
הגישות המתוארות לעיל משמשות למדידת הפעילות הטרנסקריפטוניים של החלבון הP53. עם זאת, הביטוי של פראי מסוג P53 ב שמרים S. cerevisiae ס28 ו שיזוסכמיומיב פומל29 יכול לגרום לפיגור הצמיחה, אשר נקשר עם מעצר מחזור התא28,30 או . מוות תאים31 בשני המקרים, עיכוב הצמיחה שמרים מופעלת על ידי ביטוי P53 גבוהה, כבר מתואם עם אפנון פוטנציאל ההמרה של גנים שמרים אנדוגניים מעורב צמיחת תאים. תמיכה השערה זו, אובדן הפונקציה מוטציה P53 R273H לא להפריע צמיחת תאים שמרים כאשר מתבטאת ברמות דומות כמו פראי P5332. לעומת זאת, הביטוי בשמרים של המוטציות הרעילים P53 V122A (הידוע בפעילות הטרנססקריפט גבוהה יותר לעומת פראי-סוג P53) גרם לאפקט מעכבות גדילה חזק יותר מאשר פראי סוג P5332.
בנוסף, זה הוכיח כי האדם MDM2 היה מסוגל לעכב את הפעילות האנושית P53 הטרנס בשמרים, קידום אוביקווינציה שלה והשפלה הבאים33. בהתאם, היכולת של MDM2 אנושי ו mdmx לעכב את P53 המושרה עיכוב הצמיחה שמרים הפגינו32,34. במחקר נוסף, מתאם בין פעילות P53 טרנססקריפט ורמות ביטוי אקטין הוקמה, עם זיהוי של P53 RE במעלה הזרם על הגן ACT1 ב שמרים32. בעקביות, ביטוי אקטין היה משופר על ידי פראי P53 ואפילו יותר כך על ידי P53 V122A, אבל לא על ידי מוטציה P53 R273H. לעומת זאת, ביטוי אקטין ידי P53 ירד בנוכחות שיתוף של P53 מעכבי MDM2, mdmx, או pifithrin-α (מדכא קטן מולקולה של הפעילות P53 הטראנס), עקבי עם התוצאות המבוססות על שמרים-גידול שמרי. חשוב מכך, תוצאות אלה הקימו מתאם בין P53 המושרה עיכוב הצמיחה ומידת הפעילות שלה שמרים, אשר נוצל גם כדי לזהות וללמוד מולקולות קטנות מודלדירוג P53 פונקציות28,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

הממצא הידוע P53 חלבון מוכר יכול לשמש כגורם שעתוק (TF) ב -S. cerevisiae ס שמרים הורשו לפיתוח בחני פונקציונלי שונים ללמוד את ההשפעות של 1) מחייב האתר [i.e., אלמנט התגובה (RE)] משתני רצף על P53 הפעלה ספציפיות או 2) TP53 מוטציות, שיתוף מבוטא קופטים, או מולקולות קטנות על פעילות הפעלה P53. יישומי מחקר בסיסיים וטרנסלבותית שונים פותחו. הגישות הללו מנצלות שני יתרונות עיקריים של מודל השמרים. מצד אחד, הקלות של עריכת הגנום מאפשרת בנייה מהירה של מערכות עיתונאי איכותיות או כמותיים על ידי ניצול זנים איזוגניים הנבדלים רק ברמה של P53 מסוימים-RE כדי לחקור את הרצף-ספציפיות של P53 תלוי הפעלה מעבר. מצד שני, הזמינות של מערכות מוסדרים עבור ביטוי חוץ רחמי P53 מאפשר הערכה של הפעלה במגוון רחב של ביטוי חלבון. סקר בדוח זה משמשים באופן נרחב מערכות המבוססות על גנים עיתונאי צבע, לluciferase, ואת הצמיחה של שמרים כדי להמחיש את הצעדים מתודולוגיים העיקריים שלהם כדי להעריך באופן אנוש את כוח החיזוי שלהם. יתר על כן, רב-תכליתיות קיצונית של גישות אלה ניתן לנצל בקלות כדי ללמוד TFs שונים כולל P63 ו P73, שהם חברים אחרים של TP53 משפחת גנים.

בניית מ ADE2 או LUC1 כתבת זנים שמרים
הגישה הטיפולית12,14,15,16 כבר הותאם כדי לאפשר את הבנייה של P53 העיתונאי זנים שמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

שלום, שמי ברטולומו בוסקו, ואני דוקטורנט במעבדה לרשת שעתוקים במרכז לביולוגיה אינטגרטיבית של אוניברסיטת טרנטו באיטליה. כפי שאתם יודעים, שעתוק הוא תהליך מורכב ביותר המערב ארגון מרחבי ותת-זמני של גורם שעתוק וגורם קופקטור. רובם, כולל P53 האנושי, מזהים אלמנטים ספציפיים של cis-פעולה, הנקראים אלמנטים של תגובה, והכריכה על ריצוף DNA זה נדרשת לאפנן של שעתוק של גנים היעד.בעבודה זו, ברצוננו להראות לך את הפרוטוקול ללמוד רצף P53 ספציפי פונקציות transactivation באמצעות שמרים כמערכת מודל כמו חלבון בגן כתב צבע או luciferase או על כימות של צמיחת תאים כדי להדגיש את הצעדים הניסיוניים העיקריים ואת הרבגוניות של גישות אלה. פרוטוקול אחד, בנייה של זני שמרים כתב המכילים אלמנט תגובה P53 ספציפי במעלה הזרם של אדנין-2 או הגן לוציפראז גחלציים. כדי לבנות זן כתב, תחילה בצע את השלבים 1.1 עד 1.15 כדי להפוך תאי שמרים עם אוליגונוקלאוטידים מיקוד אזור האמרגן הרצוי.הטרנספורמציה מבוססת על הפרוטוקול הסטנדרטי המבוסס על ליתיום אצטט. לאחר טרנספורמנטים מופיעים על לוחות 5-FOA, בדרך כלל לאחר שלושה ימים של דגירה ב 30 מעלות, העתק צלחת אותם על לוחות YPDA לא סלקטיביים וגם על לוחות YPDA המכילים G418, סימון כל צלחת כדי להקל על ההשוואה הבאה שלהם. דגירה הצלחות לילה ב 30 מעלות.למחרת, לזהות את זני הכתב המועמדים מהמושבות כי הם G418 רגיש אבל גדל על לוחיות YPDA. פס המושבות שזוהו על צלחת YPDA חדשה כדי להשיג מבודד מושבה אחת, ולתת להם לגדול במשך יומיים ב 30 מעלות. בדוק את השילוב הנכון של רכיב התגובה הרצוי P53, ביצוע תגובת PCR עם תנאים שהוזכרו בשלב 1.20.לטעון aliquot של המוצר PCR על ג'ל אגרוז כדי לבדוק את אורך אמפולייקון הנכון לפני רצף סנגר. פרוטוקול שני, אנו מציגים דוגמה כיצד להעריך את יכולת ההמרה של חלבון P53 באמצעות מים איכותיים מבוססי צבע אדנין-2 שמרים. המר תאי שמרים עם וקטורים של ביטוי P53 בהתאם לאותו פרוטוקול מבוסס ליתיום אצטט המתואר בסעיף הראשון.פסים מושבות שנאי שמרים יחיד, עד שש לכל צלחת, על צלחת סלקטיבית חדשה, ולתת להם לגדול לילה ב 30 מעלות. יום לאחר מכן, באמצעות קטיפה סטרילית, העתק צלחת פסים על לוחות סלקטיביים חדשים המאפשרים הערכה של פנוטיפ צבע, כלומר לוחות סלקטיביים המכילים כמות מגבילה של אדנין.דגירה ב30 מעלות במשך שלושה ימים. ניתן לשכפל את אותם פסים מספר פעמים. פרוטוקול 3, אנו מציגים כעת דוגמה להערכת יכולת ההמרה של חלבון P53 באמצעות מוצג שמרי LUC1 המבוסס על אור כמותי.ראשית, לשנות את תאי שמרים עם וקטורים ביטוי P53 בעקבות, שוב, פרוטוקול מבוסס ליתיום אצטט המתואר בסעיף 2. תדבקו טרנספורמנטים בודדים על צלחות סלקטיביות חדשות המכילות גלוקוז כמקור פחמן, ותנו להם לגדול ב-30 מעלות במהלך הלילה. עבור כל סוג שינוי צורה, צור חמישה עד שבעה תיקונים שונים.לאחר הצמיחה בן הלילה, יש להשתמש מחדש בכמות קטנה של תאים באמצעות קיסם סטרילי או קצה פיפטה במדיום סלקטיבי סינתטי המכיל ראפינוז כמקור פחמן. מתלי תאים אלה צריכים להיות בעלי צפיפות אופטית של 600 ננומטר סביב 0.4 ו ניתן לפצל אותם לצלחות מרובות של 96 באר לדגירה בטמפרטורות שונות, טיפולים, או לחשוף תאים לכמות משתנה של גלקטוז כדי להפעיל ביטוי P53. כדי למדוד את פעילות כתב גחלילית, להעביר 10 עד 20 microliters של ההשעיה התא מן הלוח שקוף 96 באר לתוך צלחת לבן 384 באר, ומערבבים את התאים עם נפח שווה של מאגר תזה, דגירה במשך 10, 15 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר.הוסף 10, 20 מיקרוליטרים של מצע גחלילית לוציפראז. ולמדוד יחידות אור באמצעות קורא לוחות רב-שכבתי. למדוד גם את הצפיפות האופטית של התרבויות בצלחת 96 היטב.פרוטוקול ארבע, אנו מציגים כעת דוגמה כיצד לנצל את העיכוב של הצמיחה של שמרים המושרה על ידי P53. הפוך תאי שמרים עם וקטורים ביטוי P53, או cotransform אותם עם וקטורים ביטוי כדי לדכא את P53 יחד ואחד מקובקטורים שלה, כגון MDM2, הבא, שוב, פרוטוקול מבוסס ליתיום אצטט המתואר בסעיף אחד. הגדל תאים טרנספורמטיביים במדיום סלקטיבי לצפיפות אופטית אחת בקירוב.ולדלל אותם ל 0.05, ולהוסיף מולקולה שנבחרה לריכוז המתאים. דגירה תאים ב 30 מעלות על שייקר במשך 42 שעות. לאחר מכן, זרע 100 microliters של תרבות תאי שמרים בצלחות בינוניות סלקטיביות מינימליות.דגירה במשך יומיים ב30 מעלות. שילוב RE הנכון במקום קלטת ICORE ניתן לבדוק על ידי PCR המושבה, החל מכמות זעירה של תאים מן שיבוטים שמרים מועמדים באמצעות פריימרים המתוארים בטבלה שלוש כדי להגביר את לוקוס ממוקד. מוצרי PCR, להקה של כ 500 נוקלאוטידים, לאחר מכן ניתן לבדוק על ידי רצף סנגר כדי לאשר את הרצף של המיקום הגנומי ערוך לנוכחות של רצף אלמנט התגובה P53 הנכון.זן הכתב מוכן לשימוש בהסתה תפקודית. כדי להעריך את יכולת ההמרה של חלבון P53, בדוק את הצבע של מושבות שמרים. לדוגמה, אנו מציגים השוואה בין P53 מסוג פראי לבין המוטנטים R175H ו- R282W באמצעות שני כתבים שונים, P21-5-prime ו- PUMA, ושתי טמפרטורות שונות, 30 מעלות ו - 37 מעלות.מעניין, בעוד R175H הוא אלל P53 אובדן פונקציה, מושבות אדומות בכל התנאים, R282W מראה רגישות לטמפרטורה עם פעילות transactivation שיורית ב 30 מעלות, וכתוצאה מכך מושבות לבנות, אבל אובדן פעילות ב 37 מעלות, וכתוצאה מכך מושבות אדום או ורוד. ערכת נתונים מורחבת מוצגת איור 2 B.Wild-type P53 בארבעה אללים מוטנטים נבדקו לצורך ביצוע עסקאות באמצעות 10 זנים שונים של כתב רכיבי תגובה P53, שלוש טמפרטורות ורמות ביטוי מכוננות. התוצאות מסוכמות בקוד צבע שמזכיר את פנוטיפ הצבע של מושבת השמרים.אלל המוטנטים P53 K139E שומר על פעילות חלקית והוא רגיש לקור. לדוגמה, מושבות הן אדומות בזן הכתב GADD45 ב 24 ו 30 מעלות, אבל הם לבנים ב 37 מעלות. כאן, אנו מציגים דוגמה של תוצאות שהושגו עם שיטה זו, השוואת מפרט transactivation של שמרים P53 אדם C.elegans.התוצאות בגרף עמודות מבוטאות כיחידות אור יחסי ממוצעות עם שגיאת תקן של ארבעה שכפולים. חמישה רכיבי תגובה שונים של P53 הושוו. שלוש רמות שונות של ביטוי חלבון P53 נבדקו על ידי שינוי הריכוז של גלקטוז במדיום.שני אורתולוגי P53 מראים מפרטי טרנסאקטיביות שונים במידה ניכרת. הדבר בא לידי ביטוי בתוצאות עם רכיבי תגובה של ced13 ו- V1 בעלי אותו רצף, למעט נוכחות או היעדרות של רווח נוקלאוטיד 28. האדם P53 מציג ביצועים גבוהים בהרבה עם אתר כריכת V1, בעוד C.elegans P53 מראה את ההפך.התוצאות אינן תלויות ברמה של ביטוי P53 תחת האמרגן גלקטוז-בלתי ניתן לעיכול. למדוד את צמיחת שמרים על ידי ספירת מספר המושבות שהושגו 100 טיפות תרבות microliters. לחשב את ההשפעה הפעלה מחדש מוטנטים של תרכובות בהתחשב בצמיחה של P53 מסוג פראי להביע שמרים כמו ההשפעה המקסימלית האפשרית, להגדיר 100%בעוד הצמיחה של תאים המבטאים מוטציה P53 מייצגים אפס רמה של הפעלה מחדש.בדוגמה זו, Nutlin-3a מקל על עיכוב של P53 מסוג פראי שנגרם על ידי דיכוי חוץ של MDM2, בעוד PhiKan083 מחדש חלקית את המוטנט P53 Y220C. בשני המקרים, התוצאה היא הפחתה תלוית P53 של צמיחת שמרים. שמרים תאים בסיסיים הוכיחו שימושי לחקור ערכים, היבטים של פונקציות חלבון P53.הפרוטוקול המתואר בעבודה זו רגיש במיוחד להערכת פוטנציאל ההשתנות של מוטנט מסוג פראי או סרטן הקשור P53 לגרסאות של אתרי יעד. כמו כן, ניתן להשתמש בגישה כדי לזהות מולקולות קטנות המשפיעות על פונקציות P53 וללמוד אינטראקציה P53 עם קופקטור. השימוש של כתבי צבע, מזעור של luciferase, כמו גם את מבחן עיכוב הצמיחה לגרום בדיקות חסכוניות ומדרגיות פוטנציאל נוח הקרנת הספרייה הכימית.לבסוף, המערכת המתוארת בעבודה זו ניתן לאמץ בקלות עם המחקר של גורמי שעתוק ספציפיים לרצף אחרים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

הערמונית תרבויות אורגאיד כמו כלים לתרגם גנוטיפים ופרופילים מוטים לתגובות תרופתי

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

נוק-דאון מותנה משולב ואסא היווצרות כדור מותאם כדי ללמוד גן הקשורים לגזע של תאי גזע נגזר סרטן הקיבה נגזר

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

שימוש בכלי המיני-דג'ן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...