Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

हम यूरोपीय संघ (FEDER funds POCI/01/0145/FEDER/007728 के माध्यम से Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) और नेशनल फंड (FCT/MEC, Funda]o para a Cincia e Tecnologia और मिनिस्ट्री दा एडकूई ई सिएनसिया के तहत धन्यवाद देते हैं साझेदारी करार PT2020 UID/QUI/50006/2019 और परियोजनाओं (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT फैलोशिप: SFRH/BD/96189/2013 (एस. गोम्स). यह काम Compagnia एस पाओलो, ट्यूरिन, इटली (परियोजना 2017.0526) और स्वास्थ्य मंत्रालय, (परियोजना 5x1000, 2015 और 2016; वर्तमान अनुसंधान 2016) द्वारा समर्थित किया गया था। हम गहराई से वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ सहायता के लिए डॉ टेरेसा लेपेज़-Arias मोंटेनेग्रो (ट्रेंटो विश्वविद्यालय, प्रयोगात्मक विज्ञान शिक्षण प्रयोगशालाओं) का शुक्र है।

1. ADE2 या LUC1 रिपोर्टर खमीर एक विशिष्ट आरई (yAFM-RE या yLFM-RE) युक्त उपभेदों का निर्माण
<ol><li>स्ट्रीक एक yAFM-ICORE या yLFM-ICORE तनाव12,14 (ICORE ] I, ISce-I endonuclease के तहत GAL1 प्रमोटर; सीओ ] काउंटर चयन URA3; रे ] रिपोर्ट?...

खमीर आधारित परख P53 प्रोटीन कार्यों के विभिन्न पहलुओं की जांच करने के लिए उपयोगी साबित कर दिया है. ये परख विशेष रूप से कार्यात्मक बहुरूपता के मूल्यांकन सहित आरई लक्ष्य स्थलों के भिन्न रूपों की ओर P53 रूपां?...

ट्रांसक्रिप्शन एक अत्यंत जटिल प्रक्रिया है जिसमें विशिष्ट उत्तेजनाओं 1 के प्रत्युत्तर में क्रोमैटिन क्षेत्रों पर आरएनए पॉलिमरेज की भर्ती और मॉडुलन के लिए प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) के गतिशील, स्थानिक और अस्थायी संगठन शामिल हैं। . मानव P53 ट्यूमर suppressor सहित अधिकांश TFs, डीएनए दृश्यों के रूप में विशिष्ट cis अभिनय तत्वों को पहचान प्रतिक्रिया तत्वों (आरईएस) कहा जाता है, जो एकल (या एकाधिक) अद्वितीय रूपांकनों से मिलकर बनता है -6-10 nucleotides लंबे समय. इन रूपांकनों के भीतर, व्यक्तिगत पदों परिवर्तनशीलता2के विभिन्न डिग्री दिखा सकते हैं, आमतौर पर स्थिति वजन matrices (PWM) या लोगो3,4द्वारा संक्षेप.
खमीर एस cerevisiae पूरक परख के माध्यम से मानव प्रोटीन के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली है, अस्थानिक अभिव्यक्ति, और कार्यात्मक परख, यहां तक कि जब एक orthologous खमीर जीन मौजूद नहीं है5, 6 , 7. प्रतिलेखन प्रणाली8के बेसल घटकों के विकास के संरक्षण के कारण , कई मानव TFs (जब खमीर कोशिकाओं में अस्थानिक रूप से व्यक्त) प्रमोटरों के माध्यम से अभिनय द्वारा एक पत्रकार जीन की अभिव्यक्ति को व्यवस्थित कर सकते हैं उपयुक्त रीस होते हैं. मानव P53 के लिए यहाँ प्रस्तुत प्रतिलेखन मॉडल प्रणाली तीन प्रमुख चर जिसका प्रभाव संग्राहक किया जा सकता द्वारा विशेषता है: 1) अभिव्यक्ति और P53 के प्रकार की आधुनिकता, 2) पुन: अनुक्रम P53-निर्भर प्रतिलेखन को नियंत्रित करने, और 3) के प्रकार रिपोर्टर जीन (चित्र 1A)
P53 अभिव्यक्ति की मोडलिटी के बारे में, एस सेरेविएसिया ईनड्यूज , दमनकारी, या संरचक प्रमोटरों9,10,11के चुनाव की अनुमति देता है . विशेष रूप से, inducible GAL1 प्रमोटर बेसल की अनुमति देता है (एक कार्बन स्रोत के रूप में रैफिनोस का उपयोग कर) या चर (मीडिया में गैलिक्टोज की मात्रा को बदलने के द्वारा) खमीर में एक TF की अभिव्यक्ति. वास्तव में , पतले टूनाबल अभिव्यक्ति न केवल P53 का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण विकास का प्रतिनिधित्व करता है , बल्कि अन्य P53 परिवार प्रोटीन12,13.
P53-निर्भर अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए रीज़ के प्रकार के बारे में, एस cerevisiae एक अन्यथा isogenic पृष्ठभूमि में ब्याज की आरई में अद्वितीय मतभेद रखने वाले विभिन्न रिपोर्टर उपभेदों के निर्माण की अनुमति देता है। यह लक्ष्य एस सेरेविसियामें विकसित एक विशेष रूप से बहुमुखी जीनोम संपादन दृष्टिकोण के अनुकूलन का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है , जिसे डेलिटो परफेटो12,14,15,16कहा जाता है .
इसके अलावा, विभिन्न रिपोर्टर जीन (यानी, URA3, HIS3, और ADE2) का उपयोग एस सेरेविसियामें मानव TFs की गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से प्रतिलिपिकारी गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, जो विशिष्ट विशेषताओं के साथ प्रत्येक कर सकते हैं प्रायोगिक आवश्यकताओं के अनुरूप होना17,18,19,20,21. इन रिपोर्टर जीनों की अभिव्यक्ति क्रमशः यूरासिल, हिटिडीन और ऐडेनीन प्रोटोट्रोफी प्रदान करती है। URA3 रिपोर्टर 5-FOA की उपस्थिति में कोशिकाओं के विकास की अनुमति नहीं है के रूप में अच्छी तरह से, और इस प्रकार यह counterselected जा सकता है. ADE2 रिपोर्टर प्रणाली लाभ है कि, पोषण चयन के अलावा, यह खमीर कोशिकाओं है कि जंगली प्रकार व्यक्त की पहचान की अनुमति देता है (यानी, ADE2 अभिव्यक्ति पर कार्यात्मक) या उत्परिवर्ती (यानी,ADE2 पर कार्यात्मक नहीं ) कॉलोनी रंग से P53.
उदाहरण के लिए, ADE2 जीन व्यक्त खमीर कोशिकाओं adenine की मात्रा सीमित युक्त प्लेटों पर सामान्य रूप से आकार सफेद कालोनियों उत्पन्न (2.5-5.0 mg/L), जबकि उन है कि खराब या प्रतिलेखन नहीं है यह छोटे लाल के रूप में एक ही थाली पर दिखाई देते हैं (या गुलाबी) कालोनियों. यह एडेनिन बायोसिंथेटिक मार्ग (यानी, पी-रिबोसिलेमिनो-इमिडाज़ोल, जिसे पहले एमिनो-इमिडाज़ोल राइबोटाइड या एआईआर कहा जाता है) में मध्यवर्ती के संचय के कारण होता है, जो लाल वर्णक के रूप में परिवर्तित हो जाता है। गुणात्मक रंग आधारित ADE2 रिपोर्टर जीन के बाद से मात्रात्मक जुगनू Photinus pyralis (LUC1)12,22के साथ बदल दिया गया है . हाल ही में, ADE2 रिपोर्टर एक आसान करने के लिए स्कोर, अर्द्ध मात्रात्मक, डबल रिपोर्टर परख है कि कार्यक्षमता के अपने अवशिष्ट स्तर के अनुसार उप वर्गीकृत P53 म्यूटेंट के लिए शोषण किया जा सकता है में लाख रिपोर्टर के साथ संयुक्त किया गया है 23.
ऐसे EGFP के रूप में फ्लोरोसेंट पत्रकारों (बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) या DsRed (डिस्कोसोमा सपा लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) भी सभी संभव missense उत्परिवर्तनों के साथ जुड़े ट्रांसएक्टिवेशन गतिविधि के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया है TP53 कोडिंग अनुक्रम24| अंत में, RE और/या रिपोर्टर जीन के लिए भिन्न isogenic खमीर उपभेदों के साथ P53 allele अभिव्यक्ति के लिए टूनाबल प्रमोटरों के संयोजन का मौका एक डेटा मैट्रिक्स है कि कैंसर से जुड़े और germline के एक परिष्कृत वर्गीकरण उत्पन्न के विकास के लिए नेतृत्व किया है उत्परिवर्ती P53 alleles25,26,27.
ऊपर वर्णित दृष्टिकोण P53 प्रोटीन की प्रतिलेखन गतिविधि को मापने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, खमीर एस cerevisiae28 और Schizosaccharomyces pombe29 में जंगली प्रकार P53 की अभिव्यक्ति विकास मंदता पैदा कर सकता है, जो सेल चक्र गिरफ्तारी के साथ संबद्ध किया गया है28,30 या सेल मौत31| दोनों ही मामलों में, खमीर विकास निषेध उच्च P53 अभिव्यक्ति से शुरू होता है और अंतर्जात खमीर सेल विकास में शामिल जीन की संभावित प्रतिलेखनीय मॉडुलन के साथ सहसंबद्ध किया गया है. इस परिकल्पना का समर्थन करते हुए, हानि के समारोह उत्परिवर्ती P53 R273H खमीर सेल विकास के साथ हस्तक्षेप नहीं किया जब जंगली प्रकार P5332के रूप में इसी तरह के स्तर पर व्यक्त किया. इसके विपरीत, विषाक्त उत्परिवर्ती P53 V122A के खमीर में अभिव्यक्ति (जंगली प्रकार P53 की तुलना में उच्च प्रतिलेखनात्मक गतिविधि के लिए जाना जाता है) जंगली प्रकार P5332की तुलना में एक मजबूत विकास निरोधात्मक प्रभाव का कारण बना.
इसके अतिरिक्त, यह दिखा दिया गया था कि मानव DD2 खमीर में मानव P53 प्रतिलेखन गतिविधि को बाधित करने में सक्षम था, इसकी सर्वव्यापकता और बाद में गिरावट33को बढ़ावा देने . तदनुसार, मानव एमडीएम 2 और MDMX की क्षमता P53 प्रेरित खमीर विकास निषेध को बाधित करने के लिए32,34का प्रदर्शन किया गया था. एक अतिरिक्त अध्ययन में, P53 ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि और actin अभिव्यक्ति के स्तर के बीच एक संबंध स्थापित किया गया था, खमीर32में ACT1 जीन पर एक putative P53 RE अपस्ट्रीम की पहचान के साथ. लगातार, actin अभिव्यक्ति जंगली प्रकार P53 द्वारा बढ़ाया गया था और भी अधिक तो P53 V122A द्वारा, लेकिन उत्परिवर्ती P53 R273H द्वारा नहीं. इसके विपरीत, P53 द्वारा actin अभिव्यक्ति P53 inhibitors DD2, MDMX, या pifithrin-जेड (P53 ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला) के सह-उपस्थिति में कमी आई, खमीर वृद्धि परख के आधार पर परिणामों के अनुरूप. महत्वपूर्ण बात यह है कि इन परिणामों ने P53-प्रेरित विकास अवरोध और खमीर में अपनी गतिविधि की डिग्री के बीच एक सहसंबंध की स्थापना की, जिसे छोटे अणुओं की पहचान करने और अध्ययन करने के लिए भी शोषण किया गया है P53 फ़ंक्शन28,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

यह निष्कर्ष कि प्रसिद्ध स्तनधारी P53 प्रोटीन खमीर एस सेरेविएसिया में एक प्रतिलेखन कारक (टीएफ) के रूप में कार्य कर सकता है, विभिन्न कार्यात्मक परख के विकास के लिए अनुमति दी गई है 1) बाइंडिंग साइट [यानी, प्रतिक्रिया तत्व (आरई)] P53 transactivation विशिष्टता या 2) TP53 उत्परिवर्तनों पर अनुक्रम वेरिएंट, सह expressed cofactors, या P53 रूपांतरण गतिविधि पर छोटे अणुओं. विभिन्न बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान अनुप्रयोगों को विकसित किया गया है. प्रायोगिक रूप से, ये दृष्टिकोण खमीर मॉडल के दो प्रमुख लाभ का फायदा उठाते हैं। एक तरफ, जीनोम संपादन की आसानी isogenic उपभेदों है कि केवल एक विशिष्ट P53-RE के स्तर पर अलग P53-निर्भर की अनुक्रम-विशिष्टता की जांच करने के लिए शोषण द्वारा गुणात्मक या मात्रात्मक रिपोर्टर सिस्टम के त्वरित निर्माण सक्षम बनाता है रूपांतरण. दूसरी ओर, अस्थानिक P53 अभिव्यक्ति के लिए विनियमित प्रणालियों की उपलब्धता प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक विस्तृत श्रृंखला में transactivation के मूल्यांकन की अनुमति देता है. इस रिपोर्ट में समीक्षा की बड़े पैमाने पर सिस्टम है कि रंग रिपोर्टर जीन, luciferase पर आधारित हैं, और खमीर के विकास के लिए उनके मुख्य methodological कदम वर्णन और गंभीर रूप से उनके भविष्य कहनेवाला शक्ति का आकलन कर रहे हैं. इसके अलावा, इन दृष्टिकोणों की चरम बहुमुखी प्रतिभा आसानी से P63 और P73, जो TP53 जीन परिवार के अन्य सदस्य हैं सहित विभिन्न TFs का अध्ययन करने के लिए शोषण किया जा सकता है.

का निर्माण एडीई2 या LUC1 रिपोर्टर खमीर उपभेदों
डेलिटो परफेटोप्रोच12,14,15,16 को प?...

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Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

यहाँ प्रस्तुत चार प्रोटोकॉल का निर्माण और खमीर Saccharomyces cerevisiae रिपोर्टर उपभेदों मानव P53 transactivation क्षमता का अध्ययन करने के लिए शोषण कर रहे हैं, इसके विभिन्न कैंसर से जुड़े उत्परिवर्तनों के प्रभावों, सह expressed बातचीत प्रोटीन, और विशिष्ट छोटे अणुओं के प्रभाव.

अध्ययन मानव P53 करने के लिए कार्यात्मक परख के विकास के लिए एक चेसिस के रूप में खमीर

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

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