Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
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Ringraziamo l'Unione europea (fondi FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 attraverso Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) e i Fondi Nazionali (FCT/MEC, Fundao para a Ciància e Tecnologia e Ministério da Educaa Accordo di partenariato PT2020 UID/QUI/50006/2019 e i progetti (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Borse di studio FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Questo lavoro è stato sostenuto dalla Compagnia S. Paolo, Torino, Italia (Progetto 2017.0526) e dal Ministero della Salute, (Progetto 5x1000, 2015 e 2016; ricerca in corso 2016). Ringraziamo profondamente la Dott.ssa Teresa Lopez-Arias Montenegro (Università di Trento, laboratori sperimentali di insegnamento delle scienze) per l'assistenza con la registrazione video.

1. Costruzione di ceppi di lievito reporter ADE2 o LUC1 contenenti un RE specifico (yAFM-RE o yLFM-RE)
<ol><li>Streak un ceppo yAFM-ICORE o yLFM-ICORE12,14 (ICORE - ICORE - ISce-I endonuclease sotto promotore di GAL1; CO - contatore selezionabile URA3; RE - reporter KanMX4 conferendo la resistenza alla kanamycin; Tabella 1) da un 15% di brodo di glicerolo immagazzinato a -80 gradi centigradi su una p...

I saggi basati sul lievito si sono dimostrati utili per studiare vari aspetti delle funzioni proteiche P53. Questi saggi sono particolarmente sensibili per valutare il potenziale di trasattivazione P53 verso varianti di siti target RE, compresa la valutazione dei polimorfismi funzionali. L'uso di giornalisti di colore e la miniaturizzazione del saggio luciferasi si traducono in analisi convenienti e relativamente scalabili. Inoltre, il test di inibizione della crescita è potenzialmente suscettibile di essere utilizzato ...

La trascrizione è un processo estremamente complesso che coinvolge l'organizzazione dinamica, spaziale e temporale dei fattori di trascrizione (TF) e dei cofattori per il reclutamento e la modulazione delle polimerasi dell'RNA sulle regioni della cromatina in risposta a stimoli specifici1 . La maggior parte dei TF, incluso il soppressore umano del tumore P53, riconosce specifici elementi cis-agire sotto forma di sequenze di DNA chiamate elementi di risposta (RE), che consistono in singoli (o multipli) motivi unici lunghi 6-10 nucleotidi. All'interno di questi motivi, singole posizioni possono mostrare vari gradi di variabilità2, di solito riassunti da matrici di peso posizione (PWM) o loghi3,4.
Il lievito S. cerevisiae è un sistema modello adatto per studiare diversi aspetti delle proteine umane attraverso saggi di complemento, espressione ectopica e saggi funzionali, anche quando non è presente un gene di lievito ortologo5, 6 È possibile: , 7. A causa della conservazione evolutiva dei componenti basali del sistema trascrizionale8, molti TF umani (espressi ectopicamente in cellule di lievito) possono modulare l'espressione di un gene reporter agendo attraverso promotori progettati per contengono RE appropriate. Il sistema del modello di trascrizione qui presentato per l'uomo P53 è caratterizzato da tre variabili principali i cui effetti possono essere modulati: 1) la modalità di espressione e il tipo di P53, 2) la sequenza RE che controlla la trascrizione dipendente da P53 e 3) il tipo di gene reporter (Figura 1A).
Per quanto riguarda la modalità di espressione P53, S. cerevisiae permette la scelta di promotori inducibili, repressivi o imtenziari9,10,11. In particolare, il promotore inducibile GAL1 consente basale (utilizzando raffinose come fonte di carbonio) o variabile (cambiando la quantità di galactose nei media) espressione di un TF in lievito. Infatti, l'espressione finemente regolabile rappresenta uno sviluppo critico per lo studio non solo della P53 stessa, ma anche di altre proteine familiari P5312,13.
Per quanto riguarda il tipo di RE che controlla noto all'espressione dipendente da P53, S. cerevisiae consente la costruzione di diversi ceppi di reporter in possesso di differenze uniche nella RE di interesse in un contesto altrimenti isogenico. Questo obiettivo è raggiunto utilizzando l'adattamento di un approccio di editing del genoma particolarmente versatile sviluppato in S. cerevisiae, chiamato delitto12,14,15,16.
Inoltre, diversi geni reporter (ad esempio URA3, HIS3 e ADE2) possono essere utilizzati per valutare qualitativamente e quantitativamente le attività trascrizionali dei TF umani in S. cerevisiae, ciascuno con caratteristiche specifiche che possono essere su misura per le esigenze sperimentali17,18,19,20,21. L'espressione di questi geni reporter conferisce uracil, istidina e prototrofia adenina, rispettivamente. Il reporter URA3 non consente la crescita delle cellule in presenza di 5-FOA pure, e quindi può essere controselezionato. Il sistema di reporter ADE2 ha il vantaggio che, oltre alla selezione nutrizionale, consente l'identificazione di cellule di lievito che esprimono di tipo selvaggio (cioè, funzionale su espressione ADE2) o mutanti (cioè,non funzionali su ADE2 ) P53 dal colore della colonia.
Ad esempio, le cellule di lievito che esprimono il gene ADE2 generano colonie bianche di dimensioni normali su lastre contenenti quantità limitanti di adenina (2,5-5,0 mg/L), mentre quelle che non si trascrivono male o non la trascrivono appaiono sulla stessa piastra del rosso più piccolo (o rosa) Colonie. Ciò è dovuto all'accumulo di un intermedio nel percorso biosintetico adenino (ad esempio, P-ribosylamino-imidazole, precedentemente chiamato ribotide amino-imidazole o AIR), che viene convertito per formare un pigmento rosso. Da allora il gene qualitativo del reporter ADE2 basato sul colore è stato sostituito dal quantitativo Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Più di recente, il reporter di ADE2 è stato combinato con il reporter lacz in un'analisi del doppio reporter facile da segnare, semi-quantitativa, che può essere sfruttata per sottoclassificare i mutanti P53 in base al loro livello residuo di funzionalità 23.
Reporter fluorescenti come EGFP (proteina fluorescente verde avanzata) o DsRed (Discosoma sp. proteina fluorescente rossa) sono stati utilizzati anche per la valutazione quantitativa dell'attività di trasattivazione associata a tutte le possibili mutazioni di Sequenza di codifica TP5324. Infine, la possibilità di combinare promotori regolabili per l'espressione allele P53 con ceppi di lievito isogenici diversi per il gene RE e/o reporter ha portato allo sviluppo di una matrice di dati che genera una classificazione raffinata di lieviti associati al cancro e germinale mutante P53 alleli25,26,27.
Gli approcci sopra descritti sono utilizzati per misurare l'attività trascrizionale della proteina P53. Tuttavia, l'espressione di P53 di tipo selvaggio nel lievito S. cerevisiae28 e Schizosaccharomyces pombe29 può causare ritardo della crescita, che è stato associato con l'arresto del ciclo cellulare28,30 o morte cellulare31. In entrambi i casi, l'inibizione della crescita del lievito è innescata da un'elevata espressione P53 ed è stata correlata con la potenziale modulazione trascrizionale dei geni del lievito endogeno coinvolti nella crescita cellulare. A sostegno di questa ipotesi, il mutante P53 R273H della perdita di funzione non ha interferito con la crescita delle cellule di lievito quando espresso a livelli simili a P5332di tipo selvaggio. Al contrario, l'espressione nel lievito del mutante tossico P53 V122A (noto per una maggiore attività trascrizionale rispetto al selvaggio P53) ha causato un effetto inibitorio della crescita più forte rispetto al tipo selvaggio P5332.
Inoltre, è stato dimostrato che l'MDM2 umano è stato in grado di inibire l'attività trascrizionale umana P53 nel lievito, promuovendone l'ubiquitinazione e la conseguente degradazione33. Di conseguenza, la capacità dell'uomo MDM2 e MDMX di inibire l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53 è stata dimostrata32,34. In uno studio aggiuntivo, è stata stabilita una correlazione tra l'attività trascrizionale P53 e i livelli di espressione dell'actina, con l'identificazione di un putativo P53 RE a monte sul gene ACT1 nel lievito32. Coerentemente, l'espressione di actin è stata potenziata da P53 wild-tipo e ancora di più da P53 V122A, ma non dal mutante P53 R273H. Al contrario, l'espressione di actina da P53 è diminuita nella co-presenza di inibitori P53 MDM2, MDMX, o pifithrin- s (un inibitore di piccole molecole dell'attività trascrizionale P53), coerente con i risultati basati sul saggio di crescita del lievito. È importante sottolineare che questi risultati hanno stabilito una correlazione tra l'inibizione della crescita indotta da P53 e il grado della sua attività nel lievito, che è stato sfruttato anche per identificare e studiare piccole molecole che modulano le funzioni P5328,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

La scoperta che la nota proteina P53 mammifera può fungere da fattore di trascrizione (TF) nel lievito S. cerevisiae ha permesso lo sviluppo di diversi saggi funzionali per studiare l'impatto del sito di legame [cioè, elemento di risposta (RE)] varianti di sequenza sulla specificità di trasattivazione P53 o 2) mutazioni di TP53, co-espressi co-espressi co-espressi o piccole molecole sull'attività di trasattivazione P53. Sono state sviluppate diverse applicazioni di ricerca di base e traslazionali. Sperimentalmente, questi approcci sfruttano due grandi vantaggi del modello di lievito. Da un lato, la facilità di editing del genoma consente una rapida costruzione di sistemi qualitativi o quantitativi di reporter sfruttando ceppi isogenici che differiscono solo a livello di uno specifico P53-RE per studiare la specificità della sequenza dipendente da P53 trasattivazione. D'altra parte, la disponibilità di sistemi regolamentati per l'espressione ectopica P53 consente la valutazione della trasattivazione in una vasta gamma di espressioni proteiche. Rivisti in questa relazione sono ampiamente utilizzati sistemi che si basano sui geni dei reporter di colore, luciferase, e la crescita del lievito per illustrare i loro principali passi metodologici e per valutare criticamente il loro potere predittivo. Inoltre, l'estrema versatilità di questi approcci può essere facilmente sfruttata per studiare diversi TF tra cui P63 e P73, che sono altri membri della famiglia genica TP53.

Costruzione di ADE2 o o LUC1 ceppi di lievito reporter
Ildelitto perfettoapproach12,14,15,16 è stato adattato per consentire la costruzione di ceppi di lievito reporter P53 ( Figura<strong c...

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Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Sono presentati quattro protocolli per costruire e sfruttare i ceppi di reporter del lievito Saccharomyces cerevisiae per studiare il potenziale di trassessione umano P53, gli impatti delle sue varie mutazioni associate al cancro, le proteine interagenti co-espresse e gli effetti di piccole molecole specifiche.

Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Ciao, mi chiamo Bartolomeo Bosco e sono dottorando presso il Laboratorio di Rete Trascrizionale presso il Centro di Biologia Integrativa dell'Università di Trento in Italia. Come sapete, la trascrizione è un processo estremamente complesso che coinvolge l'organizzazione spaziale e temporale del fattore di trascrizione e del cofattore. La maggior parte di essi, incluso il P53 umano, riconosce specifici elementi che agiscono dal CIS, chiamati elementi di risposta, e il legame su questo sequenziamento del DNA è necessario per la modulazione della trascrizione dei geni bersaglio.In questo lavoro, vorremmo mostrarvi il protocollo per studiare la sequenza P53 specifica nelle funzioni di transattivazione utilizzando il lievito come sistema modello come proteina in un gene color reporter o luciferasi o sulla quantificazione della crescita cellulare per evidenziare i principali passaggi sperimentali e la versatilità di questi approcci. Primo protocollo, costruzione di ceppi di lievito reporter che contengono uno specifico elemento di risposta P53 a monte dell'adenina-2 o del gene della luciferasi della lucciola. Per costruire un ceppo reporter, seguire prima i passaggi da 1.1 a 1.15 per trasformare le cellule di lievito con oligonucleotidi rivolte alla regione promotrice desiderata.La trasformazione si basa sul protocollo standard basato sull'acetato di litio. Una volta che i trasformatori appaiono su piastre 5-FOA, di solito dopo tre giorni di incubazione a 30 gradi, replicarli su piastre YPDA non selettive e anche su piastre YPDA contenenti G418, contrassegnando ogni piastra per facilitarne il successivo confronto. Incubare le piastre durante la notte a 30 gradi.Il giorno dopo, identifica i candidati reporter provenienti da colonie sensibili al G418 ma cresciute sulle tavole dell'YPDA. Striati le colonie identificate su una nuova piastra YPDA per ottenere isolati di singola colonia e lasciarli crescere per due giorni a 30 gradi. Controllare la corretta integrazione dell'elemento di risposta P53 desiderato, eseguendo una reazione PCR con le condizioni menzionate nel passaggio 1.20.Caricare un'aliquota del prodotto PCR sul gel di agarosio per controllare la lunghezza corretta dell'amplicon prima del sequenziamento di Sanger. Secondo protocollo, presentiamo un esempio di come valutare la capacità di trasattivazione delle proteine P53 utilizzando il saggio qualitativo del lievito di adenina-2 a base di colore. Trasforma le cellule di lievito con vettori di espressione P53 seguendo lo stesso protocollo basato sull'acetato di litio descritto nella sezione uno.Striare colonie di trasformatori di lievito singolo, fino a sei per piastra, su una nuova piastra selettiva, e lasciarle crescere durante la notte a 30 gradi. Il giorno dopo, utilizzando velluti sterili, replicare le striature su nuove piastre selettive che consentono la valutazione del fenotipo di colore, cioè piastre selettive contenenti quantità limitante di adenina.Incubare a 30 gradi per tre giorni. Le stesse striature possono essere replicate più volte. Terzo protocollo, presentiamo ora un esempio della valutazione della capacità di trasattivazione delle proteine P53 utilizzando il saggio quantitativo di lievito LUC1 a base di luminescenza.In primo luogo, trasformare le cellule di lievito con vettori di espressione P53 seguendo, ancora una volta, il protocollo basato sull'acetato di litio descritto nella sezione due. Patch singoli trasformatori su nuove piastre selettive contenenti glucosio come fonte di carbonio, e lasciarli crescere a 30 gradi durante la notte. Per ogni tipo di trasformazione, creare da cinque a sette patch diverse.Dopo la crescita notturna, rimpisodere una piccola quantità di cellule usando uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta in mezzo selettivo sintetico contenente raffinosa come fonte di carbonio. Queste sospensioni cellulari dovrebbero avere una densità ottica a 600 nanometri intorno a 0,4 e possono quindi essere divise in più piastre da 96 pozzi per l'incubazione a diverse temperature, trattamenti o per esporre le cellule a una quantità variabile di galattosio per attivare l'espressione P53. Per misurare l'attività del reporter lucciola, trasferire da 10 a 20 microlitri di sospensione cellulare dalla piastra trasparente da 96 po 'in una piastra bianca da 384 po 'e mescolare le cellule con un volume uguale di tampone di lisi, incubando per 10, 15 minuti a temperatura ambiente su uno shaker.Aggiungere 10, 20 microlitri di substrato di luciferasi lucciola. E misurare le unità luminose utilizzando un lettore di lastre multietichetta. Misurare anche la densità ottica delle colture nella piastra a 96 pozzi.Quarto protocollo, presentiamo ora un esempio di come sfruttare l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53. Trasforma le cellule di lievito con vettori di espressione P53 o cotrasformali con vettori di espressione per coesprimere P53 e uno dei suoi cofattori, come MDM2, seguendo, ancora una volta, il protocollo basato sull'acetato di litio descritto nella sezione uno. Far crescere le cellule trasformanti in mezzo selettivo a circa una densità ottica.E diluirli a 0,05, e aggiungere una molecola scelta alla concentrazione appropriata. Incubare le cellule a 30 gradi su uno shaker per 42 ore. Quindi, seminare 100 microlitri di coltura cellulare di lievito in piastre medie selettive minime.Incubare per due giorni a 30 gradi. La corretta integrazione RE al posto della cassetta ICORE può essere controllata dalla PCR colonia, a partire da una piccola quantità di cellule dai cloni di lievito candidati e utilizzando primer descritti nella tabella tre per amplificare il locus mirato. I prodotti PCR, una banda di circa 500 nucleotidi, possono quindi essere controllati sequenziando Sanger per confermare la sequenza della posizione genomica modificata per la presenza della corretta sequenza di elementi di risposta P53.Il ceppo reporter è pronto per essere utilizzato in saggi funzionali. Per valutare la capacità di traslattivazione delle proteine P53, controllare il colore delle colonie di lievito. Ad esempio, presentiamo un confronto tra P53 di tipo selvaggio e i mutanti R175H e R282W utilizzando due diversi reporter, P21-5-prime e PUMA, e due temperature diverse, 30 gradi e 37 gradi.È interessante notare che, mentre R175H è un allele P53 a perdita di funzione, colonie rosse in tutte le condizioni, R282W mostra sensibilità alla temperatura con attività di transattivazione residua a 30 gradi, con conseguente colonie bianche, ma perdita di attività a 37 gradi, con conseguente colonie rosse o rosa. Un set di dati esteso è presentato nella figura due B.Wild tipo P53 in quattro alleli mutanti sono stati testati per la trasattivazione utilizzando 10 diversi ceppi di reporter di elementi di risposta P53, tre temperature e livelli di espressione costitutiva. I risultati sono riassunti in un codice colore che ricorda il fenotipo di colore della colonia di lieviti.L'allele mutante P53 K139E mantiene un'attività parziale ed è sensibile al freddo. Ad esempio, le colonie sono rosse nel ceppo reporter GADD45 a 24 e 30 gradi, ma sono bianche a 37 gradi. Qui presentiamo un esempio di risultati ottenuti con questo metodo, confrontando la specificità di transattivazione del lievito P53 umano e C.elegans.I risultati nel grafico a barre sono espressi come unità di luce relative medie con errore standard di quattro repliche. Sono stati confrontati cinque diversi elementi di risposta P53. Tre diversi livelli di espressione proteica P53 sono stati testati variando la concentrazione di galattosio nel mezzo.I due ortologi P53 mostrano una specificità di trasattivazione marcatamente diversa. Ciò è esemplificato dai risultati con elementi di risposta ced13 e V1 che condividono la stessa sequenza, ad eccezione della presenza o dell'assenza di un distanziale a 28 nucleotidi. Human P53 mostra una trasattivazione molto più elevata con il sito di legame V1, mentre C.elegans P53 mostra il contrario.I risultati sono indipendenti dal livello di espressione P53 sotto il promotore inducibile al galattosio. Misurare la crescita del lievito contando il numero di colonie ottenute nelle gocce di coltura dei 100 microlitri. Calcola l'effetto di riattivazione mutante dei composti considerando la crescita del lievito di tipo selvatico P53 che esprime il lievito come il massimo effetto possibile, impostato al 100%, mentre la crescita delle cellule che esprimono il mutante P53 rappresenta un livello zero di riattivazione.In questo esempio, Nutlin-3a allevia l'inibizione del P53 di tipo selvatico causata dalla coespressione di MDM2, mentre PhiKan083 riattiva parzialmente il mutante Y220C P53. In entrambi i casi, ciò si traduce in una riduzione dipendente dal P53 della crescita del lievito. Le cellule basali del lievito si sono dimostrate utili per indagare i valori, gli aspetti delle funzioni proteiche P53.Il protocollo descritto in questo lavoro è particolarmente sensibile per valutare il potenziale di trasattivazione del P53 mutante di tipo selvatico o associato al cancro a varianti di siti bersaglio. Inoltre, l'approccio può essere utilizzato per identificare piccole molecole che influenzano le funzioni P53 e per studiare l'interazione P53 con il cofattore. L'uso dei giornalisti di colore, la miniaturizzazione della luciferasi, così come il test di inibizione della crescita si traducono in test convenienti e scalabili potenzialmente suscettibili allo screening della biblioteca chimica.Infine, il sistema descritto in questo lavoro può essere facilmente adottato con lo studio di altri fattori di trascrizione specifici della sequenza.

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Il Colon-26 Carcinoma tumore-cuscinetto mouse come un modello per lo studio del cancro cachessia

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Analisi Live Cell Imaging Studio Glioblastoma cerebrale tumore cellule staminali migrazione e invasione

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Le colture organoide della prostata come strumenti per tradurre genotipi e profili mutazionali in risposte farmacologiche

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Knockdown condizionale combinato e formazione di sfere adattate Per studiare un gene associato alla staminalizza delle cellule staminali del cancro gastrico derivato dal paziente

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Monitoraggio dell'assemblaggio eIF4F misurando l'interazione eIF4E-eIF4G nelle cellule vive

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Utilizzo dello strumento Minigene E1A per studiare le modifiche allo splicing dell'mRNA

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flusso di lavoro di screening rapido per identificare la potenziale terapia combinata per GBM utilizzando cellule staminali di glioma derivate dal paziente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...