Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
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우리는 유럽 연합 (FEDER 기금 POCI/01/0145/FEDER/007728 Programa 오페라 팩터드 드 경쟁) 및 국가 기금 (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia 및 Ministério da Educação e Ciência) 파트너십 계약 PT2020 UID/QUI/50006/2019 및 프로젝트(3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT 펠로우십: SFRH/BD/96189/2013 (S. 고메스). 이 작품은 Compagnia S. Paolo, 토리노, 이탈리아 (프로젝트 2017.0526)와 보건부 (프로젝트 5x1000, 2015 및 2016; 현재 연구 2016)에 의해 지원되었습니다. 테레사 로페즈-아리아스 몬테네그로 박사(트렌토 대학교, 실험 과학 교육 실험실)에게 비디오 녹화에 도움을 주신 것에 대해 깊이 감사드립니다.

1. 특정 RE를 포함하는 ADE2 또는 LUC1 기자 효모 균주의 건설 (yAFM-RE 또는 yLFM-RE)
<ol><li>줄무늬 yAFM-ICORE 또는 yLFM-ICORE 균주12,14 (ICORE = I, GAL1 프로모터하에서 의 ISce-I 엔도너렐리스; CO = 카운터 선택 우라3; RE = 카나마이신 저항을 수여하는 KanMX4 리포터; 표1) YPDA 한천 플레이트상에 -80°C에 보관된 15%?...

효모 계 분석에 따르면 P53 단백질 기능의 다양한 측면을 조사하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 이러한 해학은 기능적 다형성의 평가를 포함하여 RE 표적 부위의 변이체로 P53 환활성화 잠재력을 평가하는 데 특히 민감하다. 색상 리포터의 사용뿐만 아니라 루시퍼라아제 분석의 소형화는 비용 효율적이고 상대적으로 확장 가능한 분석결과를 낳습니다. 또한, 성장 억제 시험은 잠재적으로 ?...

전사는 특정 자극에 응하여 염색질 지구에 RNA 중합효소의 모집 그리고 변조를 위한 전사 인자 (TFs) 및 공동 인자의 동적, 공간 및 시간적 조직을 관련시키는 매우 복잡한 프로세스입니다1 . 인간 P53 종양 억제제를 포함하는 대부분의 TFs는, 단일 (또는 다중) 독특한 모티브로 구성된 응답 요소 (REs)에게 불린 DNA 서열의 형태로 특정 시스 작용 요소를 인식합니다 ~6-10 뉴클레오티드 긴. 이러한 모티브 내에서, 개별 위치는 다양한정도의 가변성 2를 나타낼 수 있으며, 일반적으로 위치 중량 행렬(PWM) 또는 로고3,4로요약된다.
상기 효모 S. 세레비시아는 정형고효모 유전자가 존재하지 않는 경우에도 보완 성 검사, 자궁외 발현 및 기능성 관찰을 통해 인간 단백질의 다양한 측면을 연구하는 데 적합한 모델 시스템입니다5. 6개 , 7.전사 계통 8의 기저 성분의진화적 보존으로 인해 많은 인간 FFs(효모 세포에서 ectopically 발현시)는 프로모터를 통해 작용하여 리포터 유전자의 발현을 조절할 수 있습니다. 적절한 REs를 포함합니다. 인간 P53에 대해 여기에 제시된 전사 모델 시스템은 그 효과를 변조할 수 있는 세 가지 주요 변수를 특징으로 한다: 1) P53의 발현 및 유형의 양상, 2) P53 의존적 전사를 제어하는 RE 서열, 및 3) 리포터 유전자(그림1A).
P53 발현의 양상에 관하여, S. cerevisiae는 유도성, 억압적, 또는 구성적인프로모터의 선택을 허용한다 9,10,11. 특히, 유도성 GAL1 프로모터는 효모에서 TF의 기저(라피노스를 탄소원으로 사용) 또는 가변(매체 내의 갈락토의 양을 변화시킴으로써) 발현을 허용한다. 실제로, 미세조정가능한 발현은 P53 자체뿐만 아니라 다른 P53 패밀리 단백질12,13을연구하기 위한 중요한 발전을 나타낸다.
P53 의존식을 제어하는 R의 유형에 관해서는, S. cerevisiae그렇지 않으면 등소성 배경에 관심의 RE에 독특한 차이를 소유하는 다른 기자 균주의 건설을 할 수 있습니다. 이러한 목표는 델리토 페르페토12, 14, 15,16에서개발된 특히 다재다능한 게놈 편집 접근법의 적응을 이용하여 도달한다.
더욱이, 상이한 리포터 유전자(즉, URA3, HIS3 및 ADE2)는 S. cerevisiae에서인간 FF의 전사 활동을 질적 및 정량적으로 평가하는 데 사용될 수 있으며, 각각 특정 기능을 가지고 있을 수 있습니다. 실험적 필요에맞게 17,18,19,20,21. 이 리포터 유전자의 발현은 각각 우라실, 히스티딘 및 아데닌 프로토위트로피를 부여합니다. URA3 리포터는 5-FOA가 있는 세포의 성장을 허용하지 않으므로 역선택될 수 있습니다. ADE2 리포터 시스템은 영양 선택 외에도 야생형(즉, ADE2 발현에서 기능적) 또는 돌연변이(즉,ADE2에서 기능적이지 않음)를 발현하는 효모 세포를 식별할 수 있다는 장점이 있습니다. ) 식민지 색상에서 P53.
예를 들어, ADE2 유전자를 발현하는 효모 세포는 아데닌(2.5-5.0 mg/L)을 제한하는 플레이트에 보통 크기의 백색 식민지를 생성하는 반면, 제대로 또는 전사하지 않는 세포는 더 작은 빨간색(또는 분홍색)과 같은 플레이트에 나타납니다. 식민지. 이것은 아데닌 생합성 통로에 있는 중간의 축적 때문입니다 (즉, P-ribosylamino-imidazole, 이전에 는 아미노-이미다졸 리보티드 또는 AIR라고 불렸습니다), 이는 적색 안료를 형성하기 위하여 변환됩니다. 질적 색계 ADE2 리포터 유전자는 이후 양적 반딧불 Photinus pyralis (LUC1)12,22로대체되었다. 최근에는 ADE2 리포터가 lacZ 리포터와 결합하여 점수가 매편, 반정적, 이중 리포터 분석으로 P53 돌연변이체의 잔류 수준에 따라 하위 분류에 악용될 수 있습니다. 23.
EGFP (향상된 녹색 형광 단백질) 또는 DsRed (디스코소마 sp. 적색 형광 단백질)와 같은 형광 기자는 또한 가능한 모든 오센스 돌연변이와 관련된 트랜스 활성화 활성의 정량적 평가에 사용되어 왔다. TP53 코딩 시퀀스24. 마지막으로, RE 및/또는 리포터 유전자에 대해 다른 이소제닉 효모 균주와 P53 알레일 발현을 위한 튜닝 가능한 프로모터를 결합할 수 있는 기회는 암 관련 및 생식선의 정제된 분류를 생성하는 데이터 매트릭스의 발달로 이끌어 냈습니다. 돌연변이 P53 대두25,26,27.
전술한 접근법은 P53 단백질의 전사 활성을 측정하기 위해 사용된다. 그러나, 효모 S. 세레비시아28 및 척수사카로마이스폼베(29)에서 야생형 P53의 발현은 세포주기 검거28,30 또는 세포주기와 연관된 성장 지연을 유발할 수 있다. 세포 죽음31. 두 경우 모두, 효모 성장 억제는 높은 P53 발현에 의해 유발되고 세포 성장에 관여하는 내인성 효모 유전자의 잠재적인 전사 변조와 상관관계가 있다. 이러한 가설을 뒷받침하는, 기능 상실 돌연변이P53 R273H는 야생형 P5332와유사한 수준으로 발현될 때 효모 세포 성장을 방해하지 않았다. 반대로, 독성 돌연변이P53 V122A(야생형 P53에 비해 전사 활성이 높은 것으로 공지)의 효모에서발현은 야생형 P5332보다더 강한 성장 억제 효과를 일으켰다.
부가적으로, 인간 MDM2는 효모에서 인간 P53 전사 활성을 억제할 수 있었고, 그 유비퀴틴화 및 후속 분해를 촉진할 수 있었다는 것을 입증하였다33. 이에 따라, 인간 MDM2 및 MDMX가 P53-유도 효모 성장억제를 억제하는 능력을 32,34로입증하였다. 추가 연구에서는, 효모32에있는 ACT1 유전자에 putative P53 RE 상류의 확인과 함께 P53 전사 활성 및 액틴 발현 수준 사이 상관관계가 확립되었다. 일관되게, 액틴 발현은 P53 V122A에 의해 야생형 P53 및 더욱 강화되었지만, 돌연변이 P53 R273H에 의해서는 아니었다. 반대로, P53에 의한 액틴 발현은 효모 성장 분석법에 기초한 결과와 일치하는 P53 억제제 MDM2, MDMX, 또는 피피테린 α(P53 전사 활성의 소분자 억제제)의 공존존재에서 감소하였다. 중요한 것은, 이러한 결과는 P53 유도 성장 억제와 효모에서의 활성 정도 사이의 상관 관계를 확립했으며, 이는 또한 P53 기능을 변조하는 소분자를 식별하고 연구하기 위해 악용되어 왔다28,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

잘 알려진 포유류 P53 단백질이 효모 S. 세레비시아에서 전사 인자(TF)로서 작용할 수 있다는 사실은 1) 결합 부위의 영향을 연구하기 위해 상이한 기능성 검사의 개발을 허용하였다[즉, 반응 요소(RE)] P53 환동성 특이성 또는 2) TP53 돌연변이, 공동 발현 보조 인자, 또는 P53 환활성화 활성에 대한 소분자에 대한 서열 변이체. 다른 기본 및 번역 연구 응용 프로그램이 개발되었습니다. 실험적으로, 이러한 접근법은 효모 모델의 두 가지 주요 장점을 이용한다. 한편으로는, 게놈 편집의 용이성은 P53 의존의 서열 특이성을 조사하기 위하여 특정 P53-RE의 수준에서만 다른 이소제닉 긴장을 이용해서 정성적 또는 정량적인 리포터 시스템의 빠른 건설을 가능하게 합니다 트랜스 활성화. 한편, 이소성 P53 발현에 대한 조절 시스템의 가용성은 광범위한 단백질 발현에서 의 역활성화의 평가를 허용한다. 이 보고서에서 검토된 것은 컬러 리포터 유전자, luciferase 및 효모의 성장을 기반으로 하는 시스템을 광범위하게 사용하여 주요 방법론 단계를 설명하고 예측 능력을 비판적으로 평가합니다. 더욱이, 이러한 접근법의 극단적인 다양성은 TP53 유전자 가족의 다른 구성원인 P63 및 P73을 포함하여 다른 F를 연구하기 위하여 쉽게 이용될 수 있습니다.

의 건설 ADE2 또는 LUC1 리포터 효모 균주
델리토 퍼페토접근법12,14,15,16은 P53 리포터 효모 균주의 시공을 가능하게 하도록 적응되었다(도<strong class...

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Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

여기에 제시된 효모 Saccharomyces 세레비시아에 종족을 건설하고 악용하는 네 가지 프로토콜은 인간 P53 의 일시 활성화 잠재력, 다양한 암 관련 돌연변이의 영향, 공동 발현 된 상호 작용 단백질, 및 특정 작은 분자의 효과.

인간 P53을 연구하기 위한 기능성 어세이 개발을 위한 섀시로 효모

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

안녕하세요, 내 이름은 바르톨로메오 보스코이며, 나는 이탈리아 트렌토 대학의 통합 생물학 센터에서 전사 네트워크 연구소에서 박사 과정 학생입니다. 아시다시피, 전사는 전사 인자와 공동 요소의 공간 및 측두조직과 관련된 매우 복잡한 과정입니다. 인간 P53을 포함한 이들 대부분은 반응 요소라고 불리는 특정 시스 작용 요소를 인식하고, 이 DNA 시퀀싱에 대한 결합은 표적 유전자의 전사의 변조에 필요하다.이 작품에서, 우리는 당신에게 색상 리포터 유전자 또는 루시파라제 또는 세포 성장의 정량화에 단백질로 효모를 사용하여 변환 기능에서 특정 P53 서열을 연구하는 프로토콜을 보여주고 싶습니다 이러한 접근 방식의 주요 실험 단계와 다재다능함을 강조하고자합니다. 프로토콜 1, 아데닌-2 또는 반딧불 루시파라제 유전자의 상류에 특정 P53 반응 요소를 포함하는 리포터 효모 균주의 시공. 기자 균주를 구성하기 위해 먼저 1.1~1.15단계를 수행하여 원하는 프로모터 영역을 대상으로 올리고뉴클레오티드로 효모 세포를 변형시킨다.변환은 표준 리튬 아세테이트 기반 프로토콜을 기반으로 합니다. 변압제가 5-FOA 플레이트에 나타나면, 보통 3일 동안 30도에서 배양한 후, 복제판은 선택적이지 않은 YPDA 플레이트와 G418을 포함하는 YPDA 플레이트에 플레이트를 플레이트에 표시하여 후속 비교를 용이하게 합니다. 접시를 30도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, G418 에 민감한 하지만 YPDA 플레이트에 성장 하는 식민지에서 후보 기자 균주를 확인 합니다. 새로운 YPDA 플레이트에 확인된 식민지를 줄이면 단일 식민지 분리를 얻고 30도에서 이틀 동안 자랄 수 있습니다. 원하는 P53 응답 요소의 올바른 통합을 확인하여 1.20 단계에서 언급된 조건과 PCR 반응을 수행합니다.sanger 시퀀싱 전에 올바른 앰플리코 길이를 확인하기 위해 아가로즈 젤에 PCR 제품의 알리쿼트를 로드합니다. 프로토콜 2, 우리는 질적 색상 기반 adenine-2 효모 분석법을 사용하여 P53 단백질 변환 능력을 평가하는 방법의 예를 제시한다. 섹션 1에 설명된 동일한 리튬 아세테이트 계 프로토콜에 따라 P53 발현 벡터를 갖는 효모 세포를 변환한다.새로운 선택적 접시에 접시 당 최대 6 까지 단일 효모 변환제 식민지를 줄이며, 30도에서 하룻밤 성장하자. 다음날, 멸균 벨벳을 사용하여, 복제판은 색 표현형, 즉 아데닌의 제한량을 포함하는 선택적 플레이트의 평가를 허용하는 새로운 선택적 플레이트에 줄무늬를 플레이트한다.3 일 동안 30도에서 배양하십시오. 동일한 줄무늬는 복제본을 여러 번 도금할 수 있습니다. 프로토콜 3, 우리는 지금 정량 발광 계 LUC1 효모 분석기를 사용하여 P53 단백질 환화 능력의 평가의 예를 제시한다.먼저, P53 발현 벡터를 갖는 효모 세포를 변환하고, 다시, 제2항에 기재된 리튬 아세테이트 계 프로토콜. 탄소원으로 포도당을 포함하는 새로운 선택적 플레이트에 단일 변압제를 패치하고 하룻밤 사이에 30도에서 성장하게하십시오. 각 변환 유형에 대해 5~7개의 패치를 만듭니다.하룻밤 성장 후, 탄소 원으로 라피노스를 포함하는 합성 선택적 매체에서 멸균 이쑤시개 또는 파이펫 팁을 사용하여 소량의 세포를 재연한다. 이러한 세포 현탁액은 약 0.4의 600 나노미터에서 광학 밀도를 가져야하며, 다른 온도, 치료 또는 P53 발현을 활성화하기 위해 다양한 양의 갈락토에 세포를 노출하기 위해 여러 96 웰 플레이트로 분할 될 수 있습니다. 반딧불이 리포터 활성을 측정하기 위해 투명 96웰 플레이트에서 10~20마이크로리터의 셀 서스펜션을 백색 384웰 플레이트로 옮기고, 셀을 동일한 양의 용해 완충제로 혼합하여 셰이커의 실온에서 10분, 15분 동안 배양한다.반딧불 루시파라기 기판 10, 20 마이크로리터를 추가합니다. 그리고 멀티 라벨 플레이트 리더기를 사용하여 라이트 유닛을 측정합니다. 또한 96웰 플레이트에서 배양물의 광학 밀도를 측정합니다.프로토콜 4, 우리는 지금 P53에 의해 유도된 효모의 성장의 억제를 이용하는 방법의 예를 제시한다. P53 발현 벡터를 사용하여 효모 세포를 변환하거나, P53 및 MDM2와 같은 공동 인자 중 하나인 코익스프레스에 발현 벡터를 결합하여 제1항에 기재된 리튬 아세테이트 계 프로토콜을 다시 한 번 변환한다. 선택적 매체에서 약 1개의 광학 밀도로 변압제 세포를 성장시키도록 한다.그리고 그들을 0.05로 희석하고, 선택한 분자를 적절한 농도에 첨가한다. 42 시간 동안 셰이커에 30도에서 세포를 배양. 이어서, 최소한의 선택적 중간 플레이트에서 효모 세포 배양의 100 마이크로리터를 종자.30도에서 이틀 동안 배양하십시오. ICORE 카세트 대신에 올바른 RE 통합은 콜로니 PCR에 의해 확인할 수 있으며, 후보 효모 클론으로부터 의 외량의 세포로부터 시작하여 표 3에 기재된 프라이머를 사용하여 표적 궤적을 증폭시킬 수 있다. PCR 제품, 약 500뉴클레오티드의 대역은, 정확한 P53 반응 요소 서열의 존재를 위해 편집된 게놈 위치의 서열을 확인하기 위해 Sanger 시퀀싱에 의해 검사될 수 있다.리포터 변형은 기능적 에세이에 사용될 준비가 되어 있습니다. P53 단백질 변환 능력을 평가하려면 효모 콜로니의 색상을 확인하십시오. 예를 들어, 우리는 두 개의 서로 다른 기자, P21-5-프라임 및 PUMA, 두 개의 서로 다른 온도, 30도 및 37도를 사용하여 야생 형 P53및 돌연변이 R175H 및 R282W 사이의 비교를 제시한다.흥미롭게도 R175H는 기능 상실 P53 알렐레, 모든 조건에서 붉은 식민지인 반면, R282W는 잔류 환원 활성을 30도에서 나타내며, 백색 식민지의 결과로 온도 민감도를 나타내지만 37도에서 활동이 손실되어 빨간색 또는 분홍색 콜로니가 생성됩니다. 확장된 데이터 세트는 4개의 돌연변이 진상선에 있는 2개의 B.Wild 형 P53을 10개의 다른 P53 반응 요소 리포터 균주, 3개의 온도 및 구성식 수준을 사용하여 변환활성화를 위해 시험되었다. 결과는 효모 식민지 색상 표현형을 생각 나게하는 색상 코드로 요약됩니다.P53 K139E 돌연변이 진상제는 부분 활성을 유지하고 냉소 민감성입니다. 예를 들어, 식민지는 24도와 30도에서 GADD45 기자 변형에 빨간색이지만, 37도에서 흰색입니다. 여기서, 우리는 인간과 C.elegans P53 효모의 트랜스활성화 특이성을 비교하는 이 방법으로 얻은 결과의 예를 제시합니다.막대 그래프의 결과는 4개의 복제의 표준 오차가 있는 평균 상대 광 단위로 표현됩니다. 5개의 다른 P53 응답 요소를 비교했습니다. P53 단백질 발현의 세 가지 상이한 수준은 배지내의 갈라토제 농도를 변화시킴으로써 시험하였다.두 P53 교정기는 현저하게 다른 상호 활성화 특이성을 보여줍니다. 이는 28-뉴클레오티드 스페이서의 존재 또는 부재를 제외하고 동일한 서열을 공유하는 ced13 및 V1 반응 원소의 결과에 의해 예시된다. 인간 P53은 V1 바인딩 사이트와 훨씬 더 높은 변환을 나타내며 C.elegans P53은 그 반대를 보여줍니다.결과는 갈라토세 유도 할 수없는 프로모터에서 P53 발현의 수준에서 독립적이다. 100 마이크로리터 배양물에서 얻은 콜로니수를 계산하여 효모 성장을 측정합니다. 돌연변이 P53을 발현하는 세포의 성장이 0 레벨의 재활성화를 나타내는 동안 효모를 최대한 의약으로 표현하는 야생형 P53의 성장을 고려한 화합물의 돌연변이 반응 효과를 계산한다.이 예에서, Nutlin-3a는 MDM2의 공동 발현에 의한 야생형 P53의 억제를 완화하고, PhiKan083은 Y220C P53 돌연변이를 부분적으로 재활성화한다. 두 경우 모두, 이것은 효 모 성장의 P53 의존 적인 감소 결과. 효모 기저 세포는 P53 단백질 기능의 가치, 측면을 조사하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다.이 작품에 설명된 프로토콜은 야생형 또는 암 관련 돌연변이 P53의 전환 가능성을 표적 사이트의 이체로 평가하기 위해 특히 민감하다. 추가, 접근은 P53 기능에 영향을 미치는 작은 분자를 확인하고 공동 인자와 P53 상호 작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 색상 기자의 사용, 루시파라제의 소형화뿐만 아니라 성장 억제 테스트는 비용 효율적이고 확장 가능한 분석을 초래화학 라이브러리 스크리닝에 잠재적으로 적합.마지막으로, 이 작업에 기재된 시스템은 다른 서열 특이적 전사 인자의 연구와 함께 쉽게 채택될 수 있다.

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