Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Vi takker EU (FEDER Funds POCI/01/0145/FEDER/007728 gjennom programa Operacional faktorer de Competitividade-KONKURRER) og nasjonale midler (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia og Ministério da Educação e Ciência) under Partnerskapsavtale PT2020 UID/QUI/50006/2019 og prosjektene (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT laug: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Dette arbeidet ble støttet av Compagnia S. Paolo, Torino, Italia (prosjekt 2017,0526) og Helsedepartementet, (prosjekt 5x1000, 2015 og 2016; aktuell forskning 2016). Vi takker dypt Dr. Teresa López-Arias Montenegro (Universitetet i Trento, eksperimentelle vitenskaper undervisning laboratorier) for å få hjelp med videoopptak.

1. bygging av ADE2 eller LUC1 reporter gjær stammer som inneholder en bestemt RE (YAFM-RE eller yLFM-re)
<ol><li>Strek en yAFM-ICORE eller yLFM-ICORE belastning12,14 (ICORE = I, ISce-I endonuclease under GAL1 promoter; CO = Counter valgbar URA3; RE = reporter KanMX4 overdragelse kanamycin motstand; Tabell 1) fra en 15% glyserol aksjer lagret ved-80 ° c på en YPDA agar plate (tabell 2</stro...

Gjær-baserte analyser har vist seg nyttig å undersøke ulike aspekter av P53 protein funksjoner. Disse analysene er spesielt følsomme for å evaluere P53 transactivation potensiale mot varianter av RE målområder, inkludert evaluering av funksjonell polymorfismer. Bruk av farge journalister samt miniatyrisering av luciferase analysen resultere i kostnadseffektiv og relativt skalerbar analyser. Dessuten er veksten hemming testen potensielt mottagelig for å bli brukt i kjemiske biblioteket screening, automatisere kvan...

Transkripsjon er en svært kompleks prosess som involverer dynamisk, romlig og timelig organisering av transkripsjon faktorer (TFs) og kofaktorer for rekruttering og modulering av RNA polymerases på kromatin regioner som svar på bestemte stimuli1 . De fleste TFs, inkludert den menneskelige P53 tumor Suppressor, gjenkjenne bestemte CIS-fungerende elementer i form av DNA-sekvenser som kalles respons elementer (REs), som består av enkle (eller flere) unike motiver ~ 6-10 nukleotider lang. Innenfor disse motivene, kan individuelle posisjoner viser ulike grader av variasjon2, vanligvis oppsummert etter posisjon vekt matriser (PWM) eller logoer3,4.
Den gjær S. cerevisiae er et egnet modell system for å studere ulike aspekter av humane proteiner gjennom komplementering analyser, svangerskap utenfor livmoren, og funksjonelle analyser, selv når en orthologous gjær genet ikke er tilstede5, 6 andre priser , 7. på grunn av den evolusjonære bevaring av basal komponenter av transcriptional system8, mange menneskelige TFs (når jektopicheski uttrykt i gjærceller) kan modulere uttrykk for en reporter genet ved å handle gjennom arrangører konstruert for å inneholder passende REs. Den transkripsjon modellen systemet presenteres her for menneskelig P53 er preget av tre store variabler som effekter kan modulert: 1) den modalitet av uttrykk og type P53) på RE sekvensen kontrollerende P53-avhengige transkripsjon, og 3) type et reporter gen (figur 1a).
Om modalitet av P53 uttrykk, S. cerevisiae tillater valg av induserbart, repressible, eller konstituerende arrangører9,10,11. Spesielt den induserbart GAL1 arrangøren tillater basal (ved hjelp raffinose som en karbon kilde) eller variabel (ved å endre mengden galaktose i Media) uttrykk for en TF i gjær. Faktisk representerer fint tunable uttrykk en kritisk utvikling for å studere ikke bare P53 seg selv, men også andre P53 familie proteiner12,13.
Når det gjelder type REs kontrollere det P53-avhengige uttrykket, S. cerevisiae tillater bygging av ulike reporter stammer inneha unike forskjeller i re av interesse i en ellers isogenic bakgrunn. Dette målet er nådd ved hjelp av en tilpasning av en spesielt allsidig Genova redigering tilnærming utviklet i S. cerevisiae, kalt delitto perfetto12,14,15,16.
Videre kan ulike reporter gener (dvs. URA3, HIS3, og ADE2) brukes til kvalitativt og kvantitativt evaluere Transcriptional aktiviteter av menneskelig TFs i S. cerevisiae, hver med bestemte funksjoner som kan skreddersys til eksperimentelle behov17,18, 19,20,21. Uttrykket av disse reporter gener gir henholdsvis uracil, histidin og adenine prototrophy. Den URA3 reporter tillater ikke veksten av celler i nærvær av 5-Foa også, og dermed kan det være counterselected. Den ADE2 reporter systemet har den fordelen at, foruten ernæringsmessige utvalg, tillater det identifisering av gjærceller som uttrykker vill-type (dvs. funksjonell på ADE2 Expression) eller mutant (dvs.ikke funksjonell på ADE2 ) P53 fra kolonien farge.
For eksempel, gjærceller uttrykker ADE2 genet generere normalt størrelse hvite kolonier på plater som inneholder begrensende mengder adenine (2.5-5.0 mg/L), mens de som dårlig eller ikke transkribere det vises på samme plate som mindre rød (eller rosa) Koloniene. Dette skyldes akkumulering av en mellomliggende i adenine biosyntetiske veien (dvs. P-ribosylamino-imidazole, som tidligere har blitt kalt amino-imidazole ribotide eller AIR), som er konvertert til å danne en rød pigment. Den kvalitative farge basert ADE2 reporter genet har siden blitt erstattet med den kvantitative Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Flere nylig har ADE2 reporter blitt kombinert med lacZ reporter i en lett-å-score, semi-kvantitative, Double reporter analysen som kan utnyttes til sub-klassifisere P53 mutanter i henhold til deres gjenværende nivå av funksjonalitet 23på.
Fluorescerende journalister som EGFP (forbedret grønt fluorescerende protein) eller DsRed (Discosoma Sp. rødt fluorescerende protein) har også blitt brukt til den kvantitative evalueringen av transactivation aktivitet forbundet med alle mulige missense mutasjoner i TP53 koding sekvens24. Endelig, sjansen for å kombinere tunable arrangører for P53 allel uttrykk med isogenic gjær stammer ulik for RE og/eller reporter genet har ført til utviklingen av en data matrise som genererer en raffinert klassifisering av kreft-assosiert og germline mutant P53 alleler25,26,27.
Fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, brukes til å måle den transcriptional aktiviteten til P53-proteinet. Men uttrykket av Wild-type P53 i gjær S. cerevisiae28 og Schizosaccharomyces pombe29 kan forårsake vekst retardasjon, som har vært forbundet med celle syklus arrest28,30 eller celle død31. I begge tilfeller, gjær veksthemming utløses av høy P53 uttrykk og har vært korrelert med potensielle transcriptional modulering av endogene gjær gener involvert i cellevekst. Støtter denne hypotesen, tap-of-Function mutant P53 R273H ikke forstyrrer gjær cellevekst når uttrykt på lignende nivåer som vill-type P5332. Omvendt, uttrykket i gjær av giftige mutant P53 V122A (kjent for høyere transcriptional aktivitet i forhold til vill-type P53) forårsaket en sterkere veksthemmende effekt enn vill-type P5332.
I tillegg ble det demonstrert at menneskelige MDM2 var i stand til å hemme den menneskelige P53 transcriptional aktivitet i gjær, fremme sin ubiqitinering og påfølgende degradering33. Følgelig, evne til menneskelig MDM2 og MDMX å hemme P53-indusert gjær veksthemming ble demonstrert32,34. I en ekstra studie ble en sammenheng mellom P53 transcriptional aktivitet og utgangen uttrykks nivåer etablert, med identifisering av en antatte P53 RE oppstrøms på ACT1 genet i gjær32. Konsekvent, utgangen uttrykk ble forsterket av vill-type P53 og enda mer av P53 V122A, men ikke av mutant P53 R273H. Omvendt, utgangen uttrykk ved P53 redusert i co-tilstedeværelsen av P53-hemmere MDM2, MDMX, eller pifithrin-α (en liten-molekyl hemmer av P53 transcriptional aktivitet), i samsvar med resultater basert på gjær-vekst analysen. Viktigst, disse resultatene etablerte en sammenheng mellom P53-indusert veksthemming og graden av sin aktivitet i gjær, som også har blitt utnyttet til å identifisere og studere små molekyler modulerende P53 funksjoner28,34 , i 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

Funnet at den velkjente pattedyr P53 protein kan fungere som en transkripsjon faktor (TF) i gjær S. cerevisiae har tillatt for utvikling av ulike funksjonelle analyser for å studere virkningene av 1) bindende nettsted [dvs. respons element (re)] sekvens varianter på P53 transactivation spesifisitet eller 2) TP53 mutasjoner, co-uttrykt kofaktorer, eller små molekyler på P53 transactivation aktivitet. Ulike grunnleggende og translational forskningsprogrammer er utviklet. Eksperimentelt, disse tilnærmingene utnytte to store fordeler av gjær modellen. På den ene siden, den enkle Genova redigering muliggjør rask bygging av kvalitative eller kvantitative reporter systemer ved å utnytte isogenic stammer som avviker bare på nivå med en bestemt P53-RE for å undersøke sekvensen-spesifisitet av P53-avhengige transactivation. På den annen side tillater tilgjengeligheten av regulerte systemer for P53-uttrykk utenfor livmoren evalueringen av transactivation i et bredt spekter av protein uttrykk. Gjennomgått i denne rapporten er mye brukt systemer som er basert på farge reporter gener, luciferase, og veksten av gjær for å illustrere deres viktigste metodisk skritt og for å kritisk vurdere sin prediktiv makt. Dessuten, det ekstrem allsidighet av disse tilnærmelser kan lett utnyttes å studere annerledes TFs inkluderer P63 og P73, hvilke er annet medlemmer av TP53 Gene slekt.

Byggingen av ADE2 eller LUC1 reporter gjær stammer
Dendelitto perfettoapproach12,14,15,16 er blitt tilpasset for å muliggjøre bygging av P53 reporter gjær stammer (fi...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Presentert her er fire protokoller for å konstruere og utnytte gjær Saccharomyces cerevisiae reporter stammer å studere menneskelig P53 transactivation potensial, virkninger av sine ulike kreft-tilknyttede mutasjoner, co-uttrykt samspill proteiner, og virkningene av spesifikke små molekyler.

Gjær som et chassis for å utvikle funksjonelle analyser for å studere Human P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Hei, mitt navn er Bartolomeo Bosco, og jeg er ph.d.-student ved Laboratory of Transcriptional Network ved Centre for Integrative Biology ved Universitetet i Trento i Italia. Som du vet, transkripsjon er en ekstremt kompleks prosess som involverer romlig og timelig organisering av transkripsjonsfaktor og kofaktor. De fleste av dem, inkludert den menneskelige P53, gjenkjenner spesifikke cis-virkende elementer, kalt responselementer, og bindingen på denne DNA-sekvenseringen er nødvendig for modulering av transkripsjon av målgener.I dette arbeidet ønsker vi å vise deg protokollen for å studere P53 sekvens spesifikk i transaktiveringsfunksjoner ved hjelp av gjær som et modellsystem som protein i et fargereportergen eller luciferase eller på kvantifisering av cellevekst for å markere de viktigste eksperimentelle trinnene og allsidigheten til disse tilnærmingene. Protokoll en, bygging av reporter gjær stammer som inneholder en bestemt P53 responselement oppstrøms av adenine-2 eller firefly luciferase genet. For å konstruere en reporterstamme, følg først trinn 1.1 til og med 1.15 for å forvandle gjærceller med oligonucleotides rettet mot ønsket promoterregion.Transformasjonen er basert på den standard litiumacetatbaserte protokollen. Når transformanter vises på 5-FOA plater, vanligvis etter tre dager med inkubasjon ved 30 grader, replika plate dem på ikke-selektive YPDA plater og også på YPDA plater som inneholder G418, merking hver plate for å lette deres påfølgende sammenligning. Inkuber platene over natten ved 30 grader.Neste dag, identifisere kandidaten reporter stammer fra kolonier som er G418-sensitive, men vokste på YPDA plater. Strek de identifiserte koloniene på en ny YPDA-plate for å oppnå enkeltkoloniisoler, og la dem vokse i to dager ved 30 grader. Kontroller riktig integrering av ønsket P53-responselement, og utføring av en PCR-reaksjon med forhold nevnt i trinn 1.20.Legg en aliquot av PCR-produktet på agarose gel for å sjekke riktig amplicon lengde før Sanger sekvensering. Protokoll to, presenterer vi et eksempel på hvordan man evaluerer P53 proteintransaktiveringsevne ved hjelp av den kvalitative fargebaserte adenin-2 gjæranalysen. Forvandle gjærceller med P53 uttrykk vektorer etter samme litiumacetat-baserte protokollen beskrevet i del en.Streak enkelt gjær transformant kolonier, opptil seks per plate, på en ny selektiv plate, og la dem vokse over natten på 30 grader. Dagen etter, ved hjelp av sterile fløyel, kopi plate stripene på nye selektive plater som tillater vurdering av fargen fenotype, det vil si selektive plater som inneholder begrensende mengde adenin.Inkuber ved 30 grader i tre dager. De samme stripene kan replikabelagt flere ganger. Protokoll tre, presenterer vi nå et eksempel på evalueringen av P53 proteintransaktiveringsevne ved hjelp av den kvantitative luminescence-baserte LUC1 gjæranalysen.Først forvandle gjær celler med P53 uttrykk vektorer følgende, igjen, litiumacetat-baserte protokollen beskrevet i seksjon to. Patch enkelt transformants på nye selektive plater som inneholder glukose som karbonkilde, og la dem vokse på 30 grader over natten. For hver transformasjonstype, gjør fem til syv forskjellige oppdateringer.Etter veksten over natten, resuspend en liten mengde celler ved hjelp av en steril tannpirker eller en pipette tips i syntetisk selektivt medium som inneholder raffinose som karbonkilde. Disse cellesuspensjonene bør ha en optisk tetthet ved 600 nanometer rundt 0,4 og kan deretter deles i flere 96-brønnsplater for inkubasjon ved forskjellige temperaturer, behandlinger eller for å utsette celler for varierende mengde galaktose for å aktivere P53-uttrykk. For å måle firefly reporter aktivitet, overføre 10 til 20 mikroliter celle suspensjon fra gjennomsiktig 96-brønns plate til en hvit 384-brønns plate, og bland cellene med et likt volum lysis buffer, inkubere i 10, 15 minutter ved romtemperatur på en shaker.Tilsett 10, 20 mikroliter firefly luciferase substrat. Og mål lysenheter ved hjelp av en multilabel plateleser. Mål også den optiske tettheten av kulturene i 96-brønnplaten.Protokoll fire, presenterer vi nå et eksempel på hvordan å utnytte hemming av veksten av gjær indusert av P53. Forvandle gjærceller med P53 uttrykksvektorer, eller samform dem med uttrykksvektorer for å coexpress P53 og en av dens kofaktorer, for eksempel MDM2, etter, igjen, litiumacetatbasert protokoll beskrevet i del én. Vokse transformerende celler i selektivt medium til omtrent en optisk tetthet.Og fortynne dem til 0, 05, og legg til et valgt molekyl til riktig konsentrasjon. Inkuber celler ved 30 grader på en shaker i 42 timer. Deretter frø 100 mikroliter av gjær cellekultur i minimale selektive medium plater.Inkuber i to dager ved 30 grader. Riktig RE-integrasjon i stedet for ICORE-kassetten kan kontrolleres av koloni-PCR, fra en liten mengde celler fra kandidatgjærkloner og ved hjelp av primere som er beskrevet i tabell tre for å forsterke den målrettede gresscusen. PCR-produkter, et bånd på ca. 500 nukleotider, kan deretter kontrolleres av Sanger-sekvensering for å bekrefte sekvensen av den redigerte genomiske plasseringen for tilstedeværelse av riktig P53-responselementsekvens.Reporterstammen er klar til bruk i funksjonelle analyser. For å evaluere P53 protein transaktivering evne, sjekk fargen på gjær kolonier. For eksempel presenterer vi en sammenligning mellom wild-type P53 og mutantene R175H og R282W ved hjelp av to forskjellige reportere, P21-5-prime og PUMA, og to forskjellige temperaturer, 30 grader og 37 grader.Interessant, mens R175H er et funksjonstap P53 allele, røde kolonier under alle forhold, viser R282W temperaturfølsomhet med gjenværende transaktiveringsaktivitet ved 30 grader, noe som resulterer i hvite kolonier, men tap av aktivitet ved 37 grader, noe som resulterer i røde eller rosa kolonier. Et utvidet datasett presenteres i figur to B.Wild-type P53 i fire muterte alleler ble testet for transaktivering ved hjelp av 10 forskjellige P53 responselementreporterstammer, tre temperaturer og konstituerende uttrykksnivåer. Resultatene er oppsummert i en fargekode som minner gjær koloni farge fenotype.P53 K139E mutert allele beholder delvis aktivitet og er kaldfølsom. For eksempel er kolonier røde i GADD45-reporterstammen ved 24 og 30 grader, men de er hvite ved 37 grader. Her presenterer vi et eksempel på resultater oppnådd med denne metoden, som sammenligner transaktiveringsspesifisiteten til menneskelig og C.elegans P53 gjær.Resultatene i søylediagrammet uttrykkes som gjennomsnittlige relative lysenheter med standardfeil på fire repliker. Fem forskjellige P53-responselementer ble sammenlignet. Tre forskjellige nivåer av P53 proteinuttrykk ble testet ved å variere konsentrasjonen av galaktose i mediet.De to P53 orthologene viser markert forskjellig transaktiveringsspesifisitet. Dette er eksemplifisert av resultatene med ced13 og V1 svarelementer som deler samme sekvens, med unntak av tilstedeværelsen eller fraværet av en 28-nukleotid avstandss avstandssvær. Human P53 viser mye høyere transaktivering med V1 bindingsstedet, mens C.elegans P53 viser det motsatte.Resultatene er uavhengige av nivået av P53 uttrykk under galaktose-induserbar promotor. Mål gjærvekst ved å telle antall kolonier oppnådd i de 100 mikroliter kulturdråper. Beregn den muterte reaktiverende effekten av forbindelser med tanke på veksten av villtype P53 som uttrykker gjær som maksimal mulig effekt, satt til 100%, mens veksten av celler som uttrykker mutert P53 representerer null nivå av reaktivering.I dette eksemplet lindrer Nutlin-3a hemmingen av villtype P53 forårsaket av samtrykk av MDM2, mens PhiKan083 delvis reaktiverer Y220C P53 mutant. I begge tilfeller resulterer dette i en P53-avhengig reduksjon av gjærvekst. Gjær basalceller har vist seg nyttige for å undersøke verdier, aspekter av P53 proteinfunksjoner.Protokollen som beskrives i dette arbeidet er spesielt følsom for evaluering av transaktiveringspotensial av villtype eller kreftrelatert mutant P53 til varianter av målområder. Videre kan tilnærmingen brukes til å identifisere små molekyler som påvirker P53-funksjoner og til å studere P53 interaksjon med kofaktor. Bruken av fargereporterne, miniatyriseringen av luciferase, samt veksthemmingstesten resulterer i kostnadseffektive og skalerbare analyser som potensielt kan mottas for kjemisk bibliotekscreening.Til slutt kan systemet som er beskrevet i dette arbeidet enkelt vedtas med studiet av andre sekvensspesifikke transkripsjonsfaktorer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser å studere macrophage og Microglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hvordan studere basalmembran Stivhet som Biofysikalsk Trigger i prostatakreft og andre aldersrelaterte patologi eller metabolske sykdommer

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 karsinom Tumor-bærende mus som en modell for studier av kreft kakeksi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-celle Imaging analyser studie Glioblastoma hjerne svulst stamcelleforskningen migrasjon og invasjon

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostata Organoid kulturer som verktøy for å oversette genotyper og mutational profiler til farmakologiske reaksjoner

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Kombinert betinget knockdown og tilpasset sfæreformasjonsanalyse for å studere et stemness-assosiert gen av pasientavledede magekreft stamceller

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Overvåke eIF4F-montering ved å måle eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Bruke E1A Minigene Tool til å studere mRNA-skjøteendringer

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

En arbeidsflyt for rask screening for å identifisere potensiell kombinasjonsterapi for GBM ved bruk av pasientavledede gliomastammeceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Pattedyr epitel- og endotelcellesfæroider som en potensiell funksjonell in vitro-modell for brystkreftforskning

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...