Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
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Agradecemos à União Europeia (FEDER funds POCI/01/0145/FEDER/007728 através do programa operacional factores de competitividade-competir) e fundos nacionais (FCT/MEC, Fundação para a ciência e tecnologia e Ministério da educação e ciência) a Acordo de parceria PT2020 UID/QUI/50006/2019 e os projetos (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. Bolsas FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Este trabalho foi apoiado pela Compagnia S. Paolo, Turim, Itália (projeto 2017, 526) e Ministério da saúde, (projeto 5X1000, 2015 e 2016; pesquisa atual 2016). Agradecemos profundamente ao Dr. Teresa López-Arias Montenegro (Universidade de Trento, laboratórios de ensino de ciências experimentais) para assistência com gravação de vídeo.

1. construção de cepas de levedura ADE2 ou LUC1 repórter contendo um re específico (Yafm-re ou ylfm-re)
<ol><li>Raia uma estirpe yafm-iCore ou ylfm-iCore12,14 (iCore = i, ISCe-i endonuclease GAL1 promotor; CO = contador selecionável URA3; RE = repórter KanMX4 conferindo resistência à kanamicina; Tabela 1) de um estoque de glicerol a 15% armazenado em-80 ° c em uma placa de agar YPDA (<strong...

Os ensaios baseados em leveduras provaram ser úteis para investigar vários aspectos das funções da proteína p53. Esses ensaios são particularmente sensíveis para avaliar o potencial de transativação do p53 em relação a variantes de sítios alvo de RE, incluindo a avaliação de polimorfismos funcionais. O uso de repórteres de cor, bem como a miniaturização do resultado do ensaio luciferase em ensaios de custo-benefício e relativamente escalável. Além disso, o teste de inibição do crescimento é potenci...

A transcrição é um processo extremamente complexo envolvendo a organização dinâmica, espacial e temporal de fatores de transcrição (TFs) e cofatores para o recrutamento e modulação de polimerases de RNA em regiões de cromatina em resposta a estímulos específicos1 . A maioria dos TFs, incluindo o supressor do tumor p53 humano, reconhecem elementos específicos de ação cis na forma de seqüências de DNA chamados elementos de resposta (REs), que consistem em únicos (ou múltiplos) motivos únicos ~ 6-10 nucleotídeos longos. Dentro desses motivos, posições individuais podem mostrar vários graus de variabilidade2, geralmente resumidos por matrizes de peso de posição (PWM) ou logotipos3,4.
O fermento S. cerevisiae é um sistema modelo adequado para o estudo de diferentes aspectos das proteínas humanas através de ensaios de complementação, expressão ectópica e ensaios funcionais, mesmo quando um gene de levedura ortologica não está presente5, 6 anos de , 7. devido à conservação evolutiva dos componentes basais do sistema transcricional8, muitos TFs humanos (quando ectopicamente expressos em células de levedura) pode modular a expressão de um gene repórter, agindo através de promotores projetados para contêm REs apropriados. O sistema de modelo de transcrição aqui apresentado para a p53 humana é caracterizado por três grandes variáveis cujos efeitos podem ser modulados: 1) a modalidade de expressão e tipo de p53,2) a seqüência RE controlando a transcrição dependente do p53, e 3) o tipo de gene repórter (Figura 1a).
Em relação à modalidade de expressão da p53, S. cerevisiae possibilita a escolha de promotores indutivos, represáveis ou constituintes9,10,11. Em particular, o promotor GAL1 induzível permite basal (usando rafinose como uma fonte de carbono) ou variável (alterando a quantidade de galactose na mídia) expressão de um TF em levedura. De fato, a expressão finamente sintonável representa um desenvolvimento crítico para estudar não apenas o p53 propriamente dito, mas também outras proteínas da família p5312,13.
Em relação ao tipo de REs que controla a expressão dependente do p53, S. cerevisiae permite a construção de diferentes cepas de repórter possuindo diferenças únicas no re de interesse em um fundo isogênico de outra forma. Esse objetivo é atingido por meio de uma adaptação de uma abordagem de edição de genoma particularmente versátil desenvolvida em S. cerevisiae, denominada Delitto Perfetto12,14,15,16.
Além disso, diferentes genes de repórter (i.e., URA3, HIS3 e ADE2) podem ser usados para avaliar qualitativamente e quantitativamente as atividades transcricional do TFs humano em S. cerevisiae, cada uma com características específicas que podem ser adaptados às necessidades experimentais17,18,19,20,21. A expressão destes genes do repórter confere o uracil, o histidine, e o prototrophy do adenina, respectivamente. O URA3 reporter não permite o crescimento de células na presença de 5-Foa também, e, portanto, pode ser contraselecionado. O sistema ADE2 reporter tem a vantagem de que, além da seleção nutricional, permite a identificação de células de levedura que expressam Wild-Type (ou seja, funcional na expressão ADE2 ) ou mutante (ou seja,não funcional em ADE2 ) P53 da cor da colônia.
Por exemplo, as células de levedura que expressam o gene ADE2 geram colônias brancas normalmente dimensionadas em placas contendo quantidades limitantes de adenina (2,5-5,0 mg/L), enquanto aquelas que mal ou não transtranscriam aparecem na mesma placa que o vermelho menor (ou rosa) Colônias. Isto é devido ao acúmulo de um intermediário na via de adenina biossintética (i.e., P-ribosylamino-imidazol, que tem sido anteriormente chamado de amino-imidazol aminoimidazole ou ar), que é convertido para formar um pigmento vermelho. A cor qualitativa baseada ADE2 gene do repórter foi substituída já com o Firefly quantitativo Photinus Tânia (LUC1)12,22. Mais recentemente, o repórter ADE2 foi combinado com o repórter de lacZ em um fácil-à-contagem, semi-quantitativo, ensaio dobro do repórter que pode ser explorado para subclassificar os mutantes p53 de acordo com seu nível residual de funcionalidade a 23.
Os repórteres fluorescentes tais como EGFP (proteína fluorescente verde aumentada) ou dsred (proteína fluorescente vermelha de discosoma SP.) foram usados igualmente para a avaliação quantitativa da atividade do transactivacao associada com todas as mutações missense possíveis no TP53 seqüência de codificação24. Por fim, a chance de combinar promotores sintonáveis para a expressão do alelo p53 com cepas de levedura isogênicas diferindo para o gene RE e/ou repórter levou ao desenvolvimento de uma matriz de dados que gera uma classificação refinada de câncer associado e germline alelos p53 do mutante25,26,27.
As abordagens descritas acima são usadas para medir a atividade transcricional da proteína p53. No entanto, a expressão de p53 do tipo Wild no fermento S. cerevisiae28 e Schizosaccharomyces pombe29 pode causar retardo de crescimento, que tem sido associado à parada do ciclo celular28,30 ou morte celular31. Em ambos os casos, a inibição do crescimento do fermento é desencadeada pela expressão p53 elevada e foi correlacionada com a modulação transcricional potencial de genes endógenos do fermento envolvidos no crescimento da pilha. Suportando esta hipótese, o mutante da perda--função p53 R273H não interferiu com crescimento da pilha do fermento quando expressado em níveis similares como selvagem-tipo p5332. Inversamente, a expressão no fermento do mutante tóxico p53 V122A (sabido para uma atividade transcricional mais elevada comparada ao selvagem-tipo p53) causou um efeito inibitório do crescimento mais forte do que o selvagem-tipo p5332.
Adicionalmente, demonstrou-se que a MDM2 humana foi capaz de inibir a atividade transcricional p53 humana em levedura, promovendo sua ubiquitinação e subsequente degradação33. Conformemente, a habilidade do Mdm2 humano e do MDMX de inibir a inibição p53-induzida do crescimento do fermento foi demonstrada32,34. Em um estudo adicional, estabeleceu-se uma correlação entre a atividade transcricional p53 e os níveis de expressão de actina, com a identificação de uma putativa p53 RE upstream no gene Act1 em levedura32. Consistentemente, a expressão do actínio foi aumentada pelo selvagem-tipo p53 e ainda mais por p53 V122A, mas não pelo mutante p53 R273H. Inversamente, a expressão do actina pelo p53 diminuiu na copresença de inibidores p53 Mdm2, MDMX, ou pifithrin-α (um inibidor da pequeno-molécula da atividade transcricional p53), consistente com os resultados baseados no ensaio do fermento-crescimento. É importante ressaltar que esses resultados estabeleceram uma correlação entre a inibição do crescimento induzida pela p53 e o grau de sua atividade na levedura, que também foi explorada para identificar e estudar pequenas moléculas modulando as funções p5328,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

A constatação de que a conhecida proteína p53 de mamíferos pode atuar como fator de transcrição (TF) na levedura S. cerevisiae permitiu o desenvolvimento de diferentes ensaios funcionais para estudar os impactos de 1) local de ligação [i.e., elemento de resposta (re)] variantes da seqüência na especificidade da transativação p53 ou 2) mutações TP53 , cofactores co-expressados, ou moléculas pequenas na atividade da transativação p53. Diferentes aplicações de pesquisa de base e translacional foram desenvolvidas. Experimentalmente, essas abordagens exploram duas grandes vantagens do modelo de levedura. Por um lado, a facilidade de edição do genoma permite a construção rápida de sistemas de repórter qualitativos ou quantitativos, explorando cepas isogênicas que diferem apenas ao nível de um específico p53-RE para investigar a especificidade da seqüência de p53-dependente transactivacao. Por outro lado, a disponibilidade de sistemas regulamentados para a expressão ectópica do p53 permite a avaliação da transativação em uma ampla gama de expressão protéica. Revisados neste relatório são amplamente utilizados sistemas que são baseados em genes de repórter de cor, luciferase, e o crescimento de levedura para ilustrar suas principais etapas metodológicas e para avaliar criticamente o seu poder preditivo. Além disso, a extrema versatilidade dessas abordagens pode ser facilmente explorada para estudar diferentes TFs, incluindo P63 e p73, que são outros membros da família gene TP53 .

Construção de ADE2 ou LUC1 cepas de levedura repórter
ODelitto perfettoapproach12,14,15,16 foi adaptado para possibilitar a construção de cepas de levedura de repórter p53 (<strong clas...

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Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Aqui apresentamos quatro protocolos para construir e explorar cepas de levedura Saccharomyces cerevisiae reporter para estudar o potencial de transativação do p53 humano, impactos de suas várias mutações associadas ao câncer, proteínas interagindo coexpressas e os efeitos de moléculas pequenas específicas.

Fermento como um chassi para desenvolver ensaios funcionais para estudar p53 humano

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Olá, meu nome é Bartolomeo Bosco, e sou doutorando no Laboratório de Rede Transcricional do Centro de Biologia Integrativa da Universidade de Trento, na Itália. Como você sabe, a transcrição é um processo extremamente complexo envolvendo organização espacial e temporal do fator de transcrição e cofator. A maioria deles, incluindo o P53 humano, reconhece elementos específicos de ação cis, chamados elementos de resposta, e a vinculação neste sequenciamento de DNA é necessária para a modulação da transcrição dos genes-alvo.Neste trabalho, gostaríamos de mostrar o protocolo para estudar a sequência P53 específica em funções de transativação usando levedura como um sistema modelo como proteína em um gene repórter de cor ou a luciferase ou sobre a quantificação do crescimento celular para destacar os principais passos experimentais e a versatilidade dessas abordagens. Protocolo um, construção de cepas de levedura repórter que contêm um elemento de resposta P53 específico a montante da adenina-2 ou do gene luciferase de vagalume. Para construir uma cepa de repórter, siga primeiro os passos 1.1 a 1.15 para transformar células de levedura com oligonucleotídeos visando a região promotora desejada.A transformação é baseada no protocolo padrão baseado em acetato de lítio. Uma vez que os transformadores aparecem em placas 5-FOA, geralmente após três dias de incubação a 30 graus, replize-os em placas YPDA não-seletivas e também em placas YPDA contendo G418, marcando cada placa para facilitar sua comparação subsequente. Incubar as placas durante a noite a 30 graus.No dia seguinte, identifique o candidato repórter de colônias que são sensíveis ao G418, mas cresceram em placas YPDA. Listrar as colônias identificadas em uma nova placa YPDA para obter isolados de colônia única, e deixá-los crescer por dois dias a 30 graus. Verifique a integração correta do elemento de resposta P53 desejado, realizando uma reação pcr com condições mencionadas na etapa 1.20.Carregue uma alíquota do produto PCR no gel de agarose para verificar o comprimento correto da amplicon antes do sequenciamento Sanger. Protocolo dois, apresentamos um exemplo de como avaliar a capacidade de transativação de proteínas P53 usando o ensaio qualitativo de levedura à base de cor-2. Transforme células de levedura com vetores de expressão P53 seguindo o mesmo protocolo baseado em acetato de lítio descrito na seção um.Listrar colônias transformadoras de levedura única, até seis por placa, em uma nova placa seletiva, e deixá-los crescer durante a noite a 30 graus. No dia seguinte, utilizando veludos estéreis, a réplica de placas as listras em novas placas seletivas que permitem a avaliação do fenótipo de cor, ou seja, placas seletivas contendo quantidade limitante de adenina.Incubar a 30 graus por três dias. As mesmas raias podem ser banhadas várias vezes. Protocolo três, apresentamos agora um exemplo da avaliação da capacidade de transativação de proteínas P53 usando o ensaio quantitativo baseado em levedura LUC1.Primeiro, transforme células de levedura com vetores de expressão P53 seguindo, novamente, o protocolo baseado em acetato de lítio descrito na seção dois. Remenda transformadores únicos em novas placas seletivas contendo glicose como fonte de carbono, e deixe-os crescer a 30 graus durante a noite. Para cada tipo de transformação, faça de cinco a sete patches diferentes.Após o crescimento durante a noite, resuspenque uma pequena quantidade de células usando um palito estéril ou uma ponta de pipeta em meio seletivo sintético contendo raffinose como fonte de carbono. Essas suspensões celulares devem ter uma densidade óptica de 600 nanômetros em torno de 0,4 e podem ser divididas em múltiplas placas de 96 poços para incubação a diferentes temperaturas, tratamentos ou para expor células a uma quantidade variada de galactose para ativar a expressão P53. Para medir a atividade do repórter firefly, transfira 10 a 20 microliters de suspensão celular da placa transparente de 96 poços para uma placa branca de 384 poços, e misture as células com um volume igual de tampão de lise, incubando por 10, 15 minutos à temperatura ambiente em um shaker.Adicione 10, 20 microliters de substrato de luciferase de vagalume. E meça unidades de luz usando um leitor de placas multilabel. Medir também a densidade óptica das culturas na placa de 96 poços.Protocolo quatro, apresentamos agora um exemplo de como explorar a inibição do crescimento da levedura induzida pelo P53. Transforme células de levedura com vetores de expressão P53, ou cotransforme-as com vetores de expressão para coexpressar P53 e um de seus cofatores, como mdm2, seguindo, novamente, o protocolo baseado em acetato de lítio descrito na seção um. Cresça células transformadoras em meio seletivo para aproximadamente uma densidade óptica.E diluí-los a 0,05, e adicionar uma molécula escolhida à concentração apropriada. Incubar células a 30 graus em um agitador por 42 horas. Em seguida, sementes 100 microliters de cultura celular de levedura em placas médias mínimas seletivas.Incubar por dois dias a 30 graus. A integração RE correta no lugar do ICORE pode ser verificada pela colônia PCR, a partir de uma pequena quantidade de células de clones de levedura candidatos e usando primers descritos na tabela três para amplificar o lócus alvo. Os produtos PCR, uma banda de cerca de 500 nucleotídeos, podem então ser verificados pelo sequenciamento Sanger para confirmar a sequência do local genômico editado para a presença da sequência correta do elemento de resposta P53.A tensão repórter está pronta para ser usada em ensaios funcionais. Para avaliar a capacidade de transativação de proteínas P53, verifique a cor das colônias de leveduras. Por exemplo, apresentamos uma comparação entre o tipo selvagem P53 e os mutantes R175H e R282W usando dois repórteres diferentes, P21-5-prime e PUMA, e duas temperaturas diferentes, 30 graus e 37 graus.Curiosamente, enquanto R175H é um alehamento P53 de perda de função, colônias vermelhas em todas as condições, R282W mostra sensibilidade à temperatura com atividade de transativação residual a 30 graus, resultando em colônias brancas, mas perda de atividade em 37 graus, resultando em colônias vermelhas ou rosas. Um conjunto de dados estendido é apresentado na figura dois B.Wild-type P53 em quatro alelos mutantes foram testados para transativação usando 10 diferentes cepas de elemento de resposta P53, três temperaturas e níveis de expressão constitutiva. Os resultados são resumidos em um código de cores que lembra o fenótipo de cor da colônia de leveduras.O alelo mutante P53 K139E mantém atividade parcial e é sensível ao frio. Por exemplo, as colônias são vermelhas na tensão de repórter gadd45 a 24 e 30 graus, mas são brancas a 37 graus. Aqui, apresentamos um exemplo de resultados obtidos com este método, comparando a especificidade de transativação da levedura P53 humana e C.elegans.Os resultados no gráfico da barra são expressos como unidades de luz relativas médias com erro padrão de quatro réplicas. Foram comparados cinco diferentes elementos de resposta P53. Três níveis diferentes de expressão proteica P53 foram testados variando a concentração de galactose no meio.Os dois ortologs P53 mostram especificações de transativação marcadamente diferentes. Isso é exemplificado pelos resultados com elementos de resposta ced13 e V1 que compartilham a mesma sequência, exceto pela presença ou ausência de um espaçador de 28 nucleotídeos. O P53 humano exibe transativação muito maior com o local de ligação V1, enquanto C.elegans P53 mostra o oposto.Os resultados são independentes do nível de expressão P53 sob o promotor indutível galactose. Medir o crescimento da levedura contando o número de colônias obtidas nas 100 quedas da cultura dos microliters. Calcule o efeito de reativação mutante dos compostos considerando o crescimento da levedura selvagem do tipo P53 expressando como o efeito máximo possível, definido para 100% enquanto o crescimento das células expressando p53 mutante representam zero nível de reativação.Neste exemplo, Nutlin-3a alivia a inibição do P53 tipo selvagem causada pela coexpressão de MDM2, enquanto PhiKan083 reativa parcialmente o mutante Y220C P53. Em ambos os casos, isso resulta em uma redução p53 dependente do crescimento da levedura. As células basais de levedura têm se mostrado úteis para investigar valores, aspectos das funções proteicas P53.O protocolo descrito neste trabalho é particularmente sensível para avaliar o potencial de transativação do mutante P53 associado ao tipo selvagem ou câncer para variantes de locais-alvo. Além disso, a abordagem pode ser usada para identificar pequenas moléculas que afetam as funções P53 e para estudar a interação P53 com o cofator. O uso dos repórteres coloridos, a miniaturização da luciferase, bem como o teste de inibição do crescimento resultam em ensaios econômicos e escaláveis potencialmente favoráveis à triagem de bibliotecas químicas.Finalmente, o sistema descrito neste trabalho pode ser facilmente adotado com o estudo de outros fatores de transcrição específicos da sequência.

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Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Ensaio de formação de esferas condicionais combinadas e ensaio de formação de esfera adaptada para estudar um gene associado à haste de células-tronco de câncer gástrico derivados do paciente

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Monitorando o conjunto eIF4F medindo a interação eIF4E-eIF4G em células vivas

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar terapia de combinação potencial para GBM usando células-tronco glioma derivadas do paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...