Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Мы благодарим Европейский союз (FedER средств POCI/01/0145/FEDER/007728 через Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) и национальные фонды (FCT/MEC, Funda'o пара Ci'ncia e Tecnologia и Министерио да Эдукао э Ciincia) в соответствии с Соглашение о партнерстве PT2020 UID/Куи/50006/2019 и проекты (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Стипендии ФСТ: SFRH/BD/96189/2013 (С. Гомес). Эта работа была поддержана Компанией С. Паоло, Турин, Италия (проект 2017.0526) и Министерством здравоохранения (Проект 5x1000, 2015 и 2016; текущие исследования 2016). Мы глубоко благодарим д-ра Терезу Лопес-Ариас Черногорию (Университет Тренто, учебные лаборатории экспериментальных наук) за помощь в видеозаписи.

1. Строительство ADE2 или LUC1 репортер дрожжей штаммов, содержащих конкретные RE (yAFM-RE или yLFM-RE)
<ol><li>Полоса yAFM-ICORE или yLFM-ICORE штамм12,14 (ICORE I, ISce-I эндонуклеаз под GAL1 промоутер; CO - счетчик выбираемый URA3; RE - репортер KanMX4, дающий сопротивление ...

Дрожжи на основе анализов оказались полезными для изучения различных аспектов функций белка P53. Эти анализы особенно чувствительны для оценки потенциала трансактивации P53 по отношению к вариантам целевых объектов RE, включая оценку функциональных полиморфизмов. Использование цветных ...

Транскрипция является чрезвычайно сложным процессом, включающим динамическую, пространственную и временную организацию транскрипционных факторов (ТФ) и кофакторов для набора и модуляции РНК-полимераз на хроматиновых регионах в ответ на специфические стимулы1 . Большинство TFs, в том числе человека P53 супрессор опухоли, признают конкретные цис-действующих элементов в виде последовательностей ДНК, называемых ответных элементов (REs), которые состоят из одного (или несколько) уникальных мотивов 6-10 нуклеотидов долго. В рамках этих мотивов, отдельные позиции могут показать различные степени изменчивости2, как правило, суммируется по позиции вес матрицы (PWM) или логотипы3,4.
Дрожжи S. cerevisiae является подходящей модельной системой для изучения различных аспектов человеческих белков через дополнения анализы, эктопические выражения, и функциональные анализы, даже если ортололожный дрожжевой ген не присутствует5, 6 , 7. Из-за эволюционного сохранения базальных компонентов транскрипционной системы8, многие человеческие TFs (когда эктопически выражается в дрожжевых клетках) может модулировать выражение гена репортера, действуя через промоутеров инженерии содержат соответствующие REs. Система транскрипционной модели, представленная здесь для человека P53, характеризуется тремя основными переменными, эффекты которых могут быть модулированы: 1) модальность выражения и тип P53, 2) re последовательность управления P53-зависимой транскрипции, и 3) тип ген репортера(рисунок 1A).
Что касается модальности выражения P53, S. cerevisiae позволяет выбирать индуцируемую, репрессивную или составную промоутеров9,10,11. В частности, индуцированный промоутер GAL1 позволяет базальный (используя раффиноз в качестве источника углерода) или переменной (путем изменения количества галактозы в средствах массовой информации) выражение TF в дрожжах. В самом деле, тонко настраиваемый выражение представляет собой критическое развитие для изучения не только P53 себя, но и другие белки семьи P5312,13.
Что касается типа REs, контролирующего P53-зависимое выражение, S. cerevisiae позволяет строить различные штаммы репортера, обладающие уникальными различиями в RE интереса в ином изогенном фоне. Эта цель достигается с помощью адаптации особенно универсальный подход к редактированию генома, разработанный в S. cerevisiae, называется delitto perfetto12,14,15,16.
Кроме того, различные гены репортеров (т.е. URA3, HIS3 и ADE2) могут быть использованы для качественной и количественной оценки транскрипционной деятельности человека TFs в S. cerevisiae, каждый с конкретными особенностями, которые могут быть адаптированы к экспериментальным потребностям17,18,19,20,21. Выражение этих генов репортера придает uracil, гистидин, и аденина прототрофии, соответственно. Репортер URA3 не позволяет рост клеток в присутствии 5-FOA, а также, и, таким образом, он может быть противопоставить. Система репортеров ADE2 имеет то преимущество, что, помимо выбора питательных веществ, она позволяет идентифицировать дрожжевые клетки, которые выражают дикий тип (т.е. функциональный на экспрессии ADE2) или мутант (т.е.не функциональный на ADE2 ) P53 из колонии цвета.
Например, дрожжевые клетки, выражающие ген ADE2, генерируют белые колонии нормального размера на пластинах, содержащих ограничивающие количества аденина (2,5-5,0 мг/л), в то время как те, которые плохо или не транскрибируют, появляются на той же пластине, что и меньший красный (или розовый) Колонии. Это связано с накоплением промежуточного в аденина биосинтетических пути (т.е. P-рибосиламино-имидазол, который ранее был назван амино-имидазол риботид или AIR), который преобразуется в форме красного пигмента. Качественный цвет на основе ADE2 репортер ген с тех пор был заменен на количественные Светлячок Photinus пиралис (LUC1)12,22. Совсем недавно репортер ADE2 был объединен с репортером лака в простой в оценке, полуколичественный, двойной репортер ассс, который может быть использован для подкласса класса P53 мутантов в соответствии с их остаточным уровнем функциональности 23.
Флуоресцентные репортеры, такие как EGFP (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) или DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein), также использовались для количественной оценки трансактивационной активности, связанной со всеми возможными мутациями неправильности в TP53 последовательность кодирования24. Наконец, вероятность объединения настраиваемых промоутеров для экспрессии аллелей P53 с изогенными штаммами дрожжей, отличающимися для гена RE и/или репортера, привела к разработке матрицы данных, которая генерирует уточненную классификацию связанных с раком и зародышевых мутант P53 аллели25,26,27.
Описанные выше подходы используются для измерения транскрипционной активности белка P53. Тем не менее, выражение дикого типа P53 в дрожжах S. cerevisiae28 и Schizosaccharomyces pombe29 может вызвать замедление роста, которое было связано с арестом клеточного цикла28,30 или клеточная смерть31. В обоих случаях ингибирование роста дрожжей вызвано высоким выражением P53 и коррелирует с потенциальной транскрипционной модуляцией эндогенных дрожжевых генов, участвующих в росте клеток. Поддерживая эту гипотезу, потеря функции мутант P53 R273H не вмешиваться в рост дрожжевых клеток, когда выражается на аналогичных уровнях, как дикий тип P5332. И наоборот, выражение в дрожжах токсичного мутанта P53 V122A (известный более высокой транскрипционной активностью по сравнению с диким типом P53) вызвало более сильный тормозной эффект роста, чем дикий тип P5332.
Кроме того, было продемонстрировано, что человек MDM2 был в состоянии ингибировать человека P53 транскрипционной активности в дрожжах, способствуя его убиквиции и последующей деградации33. Соответственно, способность человека MDM2 и MDMX ингибировать P53-индуцированного ингибирования роста дрожжей было продемонстрировано32,34. В дополнительном исследовании, корреляция между P53 транскрипционной активности и уровней экспрессии актина была установлена, с определением предполагаемых P53 RE вверх по течению на гене ACT1 в дрожжах32. Последовательно, экспрессия актина была усилена диким типом P53 и тем более P53 V122A, но не мутантом P53 R273H. И наоборот, экспрессия действия P53 уменьшилась в со-присутствии ингибиторов P53 MDM2, MDMX, или пифитрин-З (маломолекулярный ингибитор транскрипционной активности P53), согласующиеся с результатами, основанными на оценке роста дрожжей. Важно отметить, что эти результаты установили корреляцию между P53-индуцированной ингибирования роста и степень его активности в дрожжах, который также был использован для выявления и изучения малых молекул, модулирующих Функции P5328,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

Вывод о том, что известный белок P53 млекопитающих может выступать в качестве транскрипции фактор (TF) в дрожжах S. cerevisiae позволило для разработки различных функциональных анализов для изучения воздействия 1) связывающий сайт (т.е., элемент ответа (RE) варианты последовательности на P53 трансактивации специфичности или 2) TP53 мутации, совместно выраженные кофакторы, или небольшие молекулы на P53 трансактивации деятельности. Разработаны различные базовые и трансляционные исследовательские приложения. Экспериментально эти подходы используют два основных преимущества модели дрожжей. С одной стороны, простота редактирования генома позволяет быстро строить качественные или количественные системы репортера, используя изогенные штаммы, которые отличаются только на уровне конкретного P53-RE для изучения последовательности-специфическости P53-зависимых трансактивации. С другой стороны, наличие регулируемых систем эктопического выражения P53 позволяет оценивать трансактивацию в широком диапазоне экспрессии белка. Рассмотрены в этом докладе широко используются системы, которые основаны на генах цвет репортера, люциферазе и росте дрожжей, чтобы проиллюстрировать их основные методологические шаги и критически оценить их прогностической силы. Кроме того, крайняя универсальность этих подходов может быть легко использована для изучения различных TFs, включая P63 и P73, которые являются другими членами семейства генов TP53.

Строительство ADE2 или LUC1 репортер дрожжей штаммов
Delitto perfettoapproach12,14,15,16 был адаптирован для строительства ...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Представлены здесь четыре протокола для создания и эксплуатации дрожжей Saccharomyces cerevisiae репортер штаммов для изучения человека P53 трансактивации потенциал, последствия его различных связанных с раком мутаций, совместно выраженных взаимодействующих белков, и эффекты конкретных малых молекул.

Дрожжи как шасси для разработки функциональных анализов для изучения человека P53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Здравствуйте, меня зовут Бартоломео Боско, и я аспирант лаборатории транскрипционные сети в Центре интегративной биологии Университета Тренто в Италии. Как вы знаете, транскрипция является чрезвычайно сложным процессом, включающим пространственную и временную организацию транскрипционные факторы и кофактора. Большинство из них, в том числе человек P53, распознают специфические цис-действующие элементы, называемые элементами реакции, и привязка к этому секвенированию ДНК необходима для модуляции транскрипции генов-мишеней.В этой работе, мы хотели бы показать вам протокол для изучения P53 последовательности конкретных функций трансактивации с использованием дрожжей в качестве модели системы, как белок в гене репортера цвета или люциферазы или на количественной оценки роста клеток, чтобы подчеркнуть основные экспериментальные шаги и универсальность этих подходов. Протокол первый, строительство репортер дрожжей штаммов, которые содержат конкретные P53 ответ элемент вверх по течению аденина-2 или светлячок люциферазы гена. Чтобы построить напряжение репортера, сначала следуйте шагам 1.1 до 1.15, чтобы преобразовать дрожжевые клетки с олигонуклеотидами, нацеленными на желаемый регион промоутера.Преобразование основано на стандартном литиевом ацетат-протоколе. После того, как трансформанты появляются на 5-FOA пластин, как правило, после трех дней инкубации при 30 градусах, реплики пластины их на не селективных пластин YPDA, а также на пластинах YPDA, содержащих G418, маркировка каждой пластины для облегчения их последующего сравнения. Инкубировать тарелки на ночь при 30 градусах.На следующий день, определить кандидата репортер штаммов из колоний, которые G418 чувствительных, но вырос на пластинах YPDA. Полоса выявленных колоний на новой пластине YPDA, чтобы получить одну колонию изолятов, и пусть они растут в течение двух дней при 30 градусах. Проверьте правильную интеграцию желаемого элемента ответа P53, выполняя реакцию PCR с условиями, упомянутыми в шаге 1.20.Загрузите алицит продукта ПЦР на гель агарозы, чтобы проверить правильную длину ампликона до последовательности Sanger. Протокол второй, мы представляем пример того, как оценить P53 способность к трансактивации белка с использованием качественного цвета на основе аденина-2 дрожжевой анализ. Преобразование дрожжевых клеток с векторами экспрессии P53 после того же протокола на основе лития ацетата, описанного в разделе 1.Полоса одного дрожжевого преобразования колоний, до шести на тарелку, на новой селективной пластины, и пусть они растут на ночь при 30 градусах. На следующий день, используя стерильные бархаты, реплики пластины полосы на новых селективных пластин, которые позволяют для оценки фенотипа цвета, т.е. селективные пластины, содержащие ограничение количества аденина.Инкубировать при 30 градусах в течение трех дней. Те же полосы могут быть реплики покрытием несколько раз. Протокол 3, мы теперь представляем пример оценки способности трансактивации протеина P53 используя количественный люминесценции-основанный анализ дрожжей LUC1.Во-первых, трансформировать дрожжевые клетки с векторами экспрессии P53, следуя, опять же, протоколу на основе лития ацетата, описанного во втором разделе. Патч одиночных трансформаторов на новых селективных пластин, содержащих глюкозу в качестве источника углерода, и пусть они растут на 30 градусов в одночасье. Для каждого типа преобразования сделайте пять-семь различных патчей.После ночного роста, повторное использование небольшого количества клеток с помощью стерильной зубочистки или наконечник пипетки в синтетической селективной среде, содержащей раффинозу в качестве источника углерода. Эти клеточные суспензии должны иметь оптическую плотность на 600 нанометров около 0,4, а затем могут быть разделены на несколько пластин 96-колодец для инкубации при различных температурах, лечения, или подвергать клетки различное количество галактозы для активации P53 выражения. Для измерения активности репортера светлячка перенесите от 10 до 20 микролитров клеточной подвески из прозрачной пластины 96-колодец в белую пластину 384-колодец и смешайте клетки с равным объемом буфера лиза, инкубационный в течение 10, 15 минут при комнатной температуре на шейкере.Добавьте 10, 20 микролитров подложки светлячков люциферазы. И измеряйте световые блоки с помощью многояблошьного считыватель пластин. Измерьте также оптическую плотность культур в плите 96-хорошо.Протокол 4, мы теперь представляем пример того, как использовать ингибирование роста дрожжей, вызванных P53. Преобразуйте дрожжевые клетки с векторами экспрессии P53 или сотрансформируете их векторами экспрессии для coexpress P53 и одного из его кофакторов, таких как MDM2, следуя, опять же, протоколу на основе литиевого ацетата, описанного в первой части. Выращиваем трансформантные клетки в селективной среде примерно до одной оптической плотности.И разбавить их до 0,05, и добавить выбранную молекулу в соответствующую концентрацию. Инкубировать клетки при 30 градусах на шейкере в течение 42 часов. Затем семя 100 микролитров дрожжевой клеточной культуры в минимальных селективных средних пластин.Инкубировать в течение двух дней при 30 градусах. Правильная интеграция RE вместо кассеты ICORE может быть проверить колонией PCR, начиная с небольшого количества клеток от клонов дрожжей-кандидатов и используя грунтовки, описанные в таблице три, чтобы усилить целевой локус. Продукты ПЦР, группа из около 500 нуклеотидов, могут быть проверены секвенированием Sanger для подтверждения последовательности отредактированного геномного местоположения на наличие правильной последовательности элементов ответа P53.Напряжение репортера готово к использованию в функциональных анализах. Чтобы оценить способность P53 к трансактивации белка, проверьте цвет дрожжевых колоний. Например, мы представляем сравнение между диким типом P53 и мутантами R175H и R282W с использованием двух различных репортеров, P21-5-prime и PUMA, и двух различных температур, 30 градусов и 37 градусов.Интересно, что в то время как R175H является потеря функции P53 аллель, красные колонии во всех условиях, R282W показывает чувствительность температуры с остаточной активности трансактивации на 30 градусов, в результате чего белые колонии, но потеря активности на 37 градусов, в результате чего красные или розовые колонии. Расширенный набор данных представлен на рисунке два B.Wild типа P53 в четырех мутантных аллелей были протестированы на трансактивации с использованием 10 различных P53 ответ элемент репортер штаммов, три температуры, и составные уровни выражения. Результаты суммируются в цветовом коде, который напоминает фенотип цвета дрожжевой колонии.Мутантный аллель P53 K139E сохраняет частичную активность и является холодочувствительным. Например, колонии красные в gadD45 репортер штамма на 24 и 30 градусов, но они белые при 37 градусов. Здесь мы представляем пример результатов, полученных с помощью этого метода, сравнивая трансактивацию специфичности человеческих и C.elegans P53 дрожжей.Результаты на графике бар выражаются как средние относительные световые единицы со стандартной погрешностью в четыре репликации. Были сопоставлены пять различных элементов реагирования P53. Три различных уровня экспрессии белка P53 были протестированы путем изменения концентрации галактозы в среде.Два ортолога P53 показывают заметно различную специфику трансактивации. Об этом свидетельствуют результаты с элементами ответа ced13 и V1, которые имеют одинаковую последовательность, за исключением наличия или отсутствия 28-нуклеотидного промека. Человек P53 экспонатов гораздо выше трансактивации с V1 связывания сайта, в то время как C.elegans P53 показывает обратное.Результаты не зависит от уровня экспрессии P53 при галактозе-необремом промоутере. Измерьте рост дрожжей, подсчитав количество колоний, полученных в 100 микролитров культуры капель. Рассчитайте эффект реактивации мутантов соединений, учитывая рост диких P53, выражаюющих дрожжи, как максимально возможный эффект, установленный на 100%, в то время как рост клеток, выражаюющих мутант P53, представляет собой нулевой уровень реактивации.В этом примере Nutlin-3a снимает ингибирование P53 дикого типа, вызванное коэкспрессией MDM2, в то время как PhiKan083 частично активирует мутант Y220C P53. В обоих случаях это приводит к P53-зависимому снижению роста дрожжей. Дрожжи базальных клеток оказались полезными для исследования значений, аспектов функций белка P53.Протокол, описанный в этой работе, особенно чувствителен для оценки потенциала трансактивации дикого типа или связанного с раком мутанта P53 к вариантам целевых объектов. Кроме того, этот подход может быть использован для выявления малых молекул, влияющих на функции P53, и для изучения взаимодействия P53 с кофактором. Использование цветных репортеров, миниатюризация люциферазы, а также тест на ингибирование роста приводят к экономически эффективным и масштабируемым анализам, потенциально подотнозвимым для химического библиотечного скрининга.Наконец, система, описанная в этой работе, может быть легко принята с изучением других факторов транскрипции, специфичных для последовательности.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Сокультивирования Анализы по изучению макрофагами и микроглии стимуляции глиобластомы вторжения

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Как изучать базальной мембраны Жесткость как биофизической Trigger в раке простаты и других патологий, связанных с возрастом или метаболических заболеваний

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 РАК-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ мышь в качестве модели для изучения рака кахексия

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Органоидные культуры простаты как инструменты для перевода генотипов и мутационных профилей в фармакологические ответы

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Комбинированные Условный Нокдаун и Адаптированные Сфера Формирование Анализ для изучения Stemness-Ассоциированный ген пациента полученных стволовых клеток рака желудка

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Мониторинг сборки eIF4F путем измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Использование инструмента E1A Minigene для изучения изменений сплайсинга мРНК

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Быстрый процесс скрининга для определения потенциальной комбинированной терапии GBM с использованием стволовых клеток глиомы, полученных от пациента

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Сфероиды эпителиальных и эндотелиальных клеток молочной железы как потенциальная функциональная модель in vitro для исследований рака молочной железы

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...