Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
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Agradecemos a la Unión Europea (Fondos FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 a través del Programa Operacion Factores de Competitividade - COMPETE) y fondos nacionales (FCT/MEC, Fundación para la Ciencia y la Tecnología y El Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério da Educación y La Ciéncia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología y el Ministério de la Educación y la Ciencia) en el marco de la Acuerdo de Asociación PT2020 UID/QUI/50006/2019 y los proyectos (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Becas FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Este trabajo fue apoyado por la Compagnia S. Paolo, Turín, Italia (Proyecto 2017.0526) y el Ministerio de Salud, (Proyecto 5x1000, 2015 y 2016; investigación actual 2016). Agradecemos profundamente a la Dra. Teresa López-Arias Montenegro (Universidad de Trento, laboratorios de enseñanza de ciencias experimentales) por su ayuda con la grabación de vídeo.

1. Construcción de cepas de levadura de reportero ADE2 o LUC1 que contengan un RE específico (yAFM-RE o yLFM-RE)
<ol><li>Racha una cepa yAFM-ICORE o yLFM-ICORE12,14 (ICORE - I, ISce-I endonucleasa bajo el promotor GAL1; CO - contador seleccionable URA3; RE - reportero KanMX4 que confiere resistencia a la kanamicina; Tabla 1) de un stock de glicerol del 15% almacenado a -80 oC en una placa de agar Y...

Los ensayos a base de levadura han demostrado ser útiles para investigar varios aspectos de las funciones de la proteína P53. Estos ensayos son particularmente sensibles para evaluar el potencial de transactivación De53 hacia variantes de sitios objetivo RE, incluida la evaluación de polimorfismos funcionales. El uso de reporteros de color, así como la miniaturización del ensayo de luciferasa resultan en ensayos rentables y relativamente escalables. Además, la prueba de inhibición del crecimiento es potencialment...

La transcripción es un proceso extremadamente complejo que implica la organización dinámica, espacial y temporal de factores de transcripción (TF) y cofactores para el reclutamiento y modulación de arnmerasas en regiones de cromatina en respuesta a estímulos específicos1 . La mayoría de los TF, incluido el supresor de tumores P53 humano, reconocen elementos específicos de acción cis en forma de secuencias de ADN llamadas elementos de respuesta (RE), que consisten en motivos únicos (o múltiples) únicos de 6-10 de largo. Dentro de estos motivos, las posicionesindividuales pueden mostrar varios grados de variabilidad 2, generalmente resumidos por matrices de peso de posición (PWM) o logotipos3,4.
La levadura S. cerevisiae es un sistema modelo adecuado para el estudio de diferentes aspectos de las proteínas humanas a través de ensayos de complementación, expresión ectópica y ensayos funcionales, incluso cuando un gen de levadura ortopélogono no está presente5, 6 , 7. Debido a la conservación evolutivade los componentes basales del sistema transcripcional 8, muchos TF humanos (cuando se expresan ectopticamente en células de levadura) pueden modular la expresión de un gen reportero actuando a través de promotores contienen REE apropiados. El sistema de modelo de transcripción presentado aquí para P53 humano se caracteriza por tres variables principales cuyos efectos pueden ser modulados: 1) la modalidad de expresión y el tipo de P53, 2) la secuencia RE que controla la transcripción dependiente de P53, y 3) el tipo de gen del reportero (Figura1A).
En cuanto a la modalidad de expresión P53, S. cerevisiae permite la elección de promotores inducibles, represibles o constitutivos9,10,11. En particular, el promotor inducible GAL1 permite la expresión basal (usando la rafinosa como fuente de carbono) o variable (cambiando la cantidad de galactosa en los medios) de un TF en la levadura. De hecho, la expresión finamente ajustable representa un desarrollo crítico para el estudio no sólo P53 sí mismo, sino también otras proteínas de la familia P5312,13.
En cuanto al tipo de RE que controlan la expresión dependiente de P53, S. cerevisiae permite la construcción de diferentes cepas de reportero que poseen diferencias únicas en el RE de interés en un fondo isogénico. Este objetivo se alcanza mediante una adaptación de un enfoque de edición del genoma particularmente versátil desarrollado en S. cerevisiae,llamado delitto perfetto12,14,15,16.
Además, se pueden utilizar diferentes genes de reportero (es decir, URA3, HIS3 y ADE2) para evaluar cualitativa y cuantitativamente las actividades transcripcionales de los FE humanos en S. cerevisiae,cada uno con características específicas que pueden adaptarse a las necesidades experimentales17,18,19,20,21. La expresión de estos genes reportero confiere uracilo, histidina y protrotrofia de adenina, respectivamente. El reportero de URA3 no permite el crecimiento de células en presencia de 5-FOA también, y por lo tanto puede ser contraseleccionado. El sistema de reporteros ADE2 tiene la ventaja de que, además de la selección nutricional, permite la identificación de células de levadura que expresan tipo salvaje (es decir, funcional en expresión ADE2) o mutantes (es decir,no funcionales en ADE2 ) P53 del color de la colonia.
Por ejemplo, las células de levadura que expresan el gen ADE2 generan colonias blancas de tamaño normal en placas que contienen cantidades limitantes de adenina (2,5-5,0 mg/L), mientras que las que pobremente o no transcriben aparecen en la misma placa que el rojo más pequeño (o rosa) Colonias. Esto se debe a la acumulación de un intermedio en la vía biosintética de adenina (es decir, P-ribosylamino-imidazol, que anteriormente se ha llamado amino-imidazol ribotida o AIR), que se convierte para formar un pigmento rojo. El gen cualitativo reportero ADE2 basado en color ha sido reemplazado por el cuantitativo Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Más recientemente, el reportero de ADE2 se ha combinado con el reportero de lacZ en un ensayo de reportero doble, semicuantitativo y fácil de obtener que puede ser explotado para subclasificar mutantes P53 de acuerdo con su nivel residual de funcionalidad 23.
También se han utilizado reporteros fluorescentes como EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) o DsRed (Discosoma sp. proteína fluorescente roja) para la evaluación cuantitativa de la actividad de transactivación asociada con todas las posibles mutaciones de SECUENCIA de codificación TP5324. Por último, la posibilidad de combinar promotores ajustables para la expresión de alelo P53 con cepas de levadura isogénicas diferentes para el gen RE y/o reportero ha llevado al desarrollo de una matriz de datos que genera una clasificación refinada de las cepas de mutantes P53 alelos25,26,27.
Los enfoques descritos anteriormente se utilizan para medir la actividad transcripcional de la proteína P53. Sin embargo, la expresión de tipo salvaje P53 en la levadura S. cerevisiae28 y Schizosaccharomyces pombe29 puede causar retraso en el crecimiento, que se ha asociado con la detención del ciclo celular28,30 o muerte celular31. En ambos casos, la inhibición del crecimiento de la levadura se desencadena por una alta expresión de P53 y se ha correlacionado con la posible modulación transcripcional de genes de levadura endógenos implicados en el crecimiento celular. Apoyando esta hipótesis, el mutante de pérdida de función P53 R273H no interfirió con el crecimiento de las células de levadura cuando se expresa en niveles similares a P5332de tipo salvaje. Por el contrario, la expresión en levadura del mutante tóxico P53 V122A (conocido por una mayor actividad transcripcional en comparación con el tipo salvaje P53) causó un efecto inhibidor del crecimiento más fuerte que el tipo salvaje P5332.
Además, se demostró que el MDM2 humano fue capaz de inhibir la actividad transcripcional humana P53 en la levadura, promoviendo su ubiquitinación y posterior degradación33. En consecuencia, se demostró la capacidad de MDM2 humano y MDMX para inhibir la inhibición del crecimiento de levadura inducida por P5332,34. En un estudio adicional, se estableció una correlación entre la actividad transcripcional P53 y los niveles de expresión de actina, con la identificación de un putativo P53 RE aguas arriba en el gen ACT1 en la levadura32. Consistentemente, la expresión de actina fue mejorada por P53 de tipo salvaje y aún más por P53 V122A, pero no por el mutante P53 R273H. Por el contrario, la expresión de actina por P53 disminuyó en la copresencia de inhibidores de P53 MDM2, MDMX o pifithrin-o (un inhibidor de molécula pequeña de la actividad transcripcional P53), consistente con resultados basados en el ensayo de crecimiento de levadura. Es importante destacar que estos resultados establecieron una correlación entre la inhibición del crecimiento inducida por P53 y el grado de su actividad en la levadura, que también ha sido explotada para identificar y estudiar moléculas pequeñas que modulan las funciones P5328,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

La constatación de que la conocida proteína P53 de mamíferopuede actuar como un factor de transcripción (TF) en la levadura S. cerevisiae ha permitido el desarrollo de diferentes ensayos funcionales para estudiar los impactos de 1) sitio de unión [es decir, elemento de respuesta (RE)] variantes de secuencia en la especificidad de la transactivación P53 o 2) mutaciones TP53, cofactores co-expresados o moléculas pequeñas en la actividad de transactivación P53. Se han desarrollado diferentes aplicaciones de investigación básica straslacional. Experimentalmente, estos enfoques aprovechan dos grandes ventajas del modelo de levadura. Por un lado, la facilidad de edición del genoma permite la construcción rápida de sistemas de reporteros cualitativos o cuantitativos mediante la explotación de cepas isogénicas que difieren sólo a nivel de un P53-RE específico para investigar la especificidad de la secuencia de P53 dependiente transactivación. Por otro lado, la disponibilidad de sistemas regulados para la expresión ectópica P53 permite la evaluación de la transactivación en una amplia gama de expresión proteica. En este informe se revisan sistemas ampliamente utilizados que se basan en genes de reporteros de color, luciferasa, y el crecimiento de la levadura para ilustrar sus principales pasos metodológicos y evaluar críticamente su poder predictivo. Además, la versatilidad extrema de estos enfoques se puede explotar fácilmente para estudiar diferentes TF, incluyendo P63 y P73, que son otros miembros de la familia de genes TP53.

Construcción de ADE2 o LUC1 reportero tensións de levadura
Eldelitto perfettoapproach12,14,15,16 ha sido adaptado para permitir la construcción de cepas de levadura de reportero P53 (Figur...

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Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Aquí se presentan cuatro protocolos para construir y explotar cepas de reporteros de Saccharomyces cerevisiae para estudiar el potencial de transactivación P53 humano, los impactos de sus diversas mutaciones asociadas al cáncer, las proteínas interexpresas que interactúan y las proteínas interexpresas que interactúan, y los efectos de moléculas pequeñas específicas.

Levadura como chasis para el desarrollo de ensayos funcionales para estudiar P53 humanos

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Hola, me llamo Bartolomeo Bosco, y soy estudiante de doctorado en el Laboratorio de La Red Transcripcional del Centro de Biología Integrativa de la Universidad de Trento en Italia. Como usted sabe, la transcripción es un proceso extremadamente complejo que implica la organización espacial y temporal del factor de transcripción y cofactor. La mayoría de ellos, incluido el P53 humano, reconocen elementos específicos que actúan con cis, llamados elementos de respuesta, y la unión en esta secuenciación del ADN es necesaria para la modulación de la transcripción de los genes diana.En este trabajo, nos gustaría mostrarle el protocolo para estudiar la secuencia P53 específica en funciones de transactivación utilizando la levadura como sistema modelo como proteína en un gen reportero de color o la luciferasa o en la cuantificación del crecimiento celular para resaltar los principales pasos experimentales y la versatilidad de estos enfoques. Protocolo uno, construcción de cepas de levadura reportera que contienen un elemento de respuesta P53 específico aguas arriba de la adenina-2 o el gen de la luciferasa de la luciosa. Para construir una cepa reportera, primero siga los pasos 1.1 a 1.15 para transformar las células de levadura con oligonucleótidos dirigidos a la región promotora deseada.La transformación se basa en el protocolo estándar basado en acetato de litio. Una vez que los transformantes aparecen en placas 5-FOA, generalmente después de tres días de incubación a 30 grados, los replican en placas YPDA no selectivas y también en placas YPDA que contienen G418, marcando cada placa para facilitar su posterior comparación. Incubar las placas durante la noche a 30 grados.Al día siguiente, identifique las cepas de reporteros candidatos de colonias que son sensibles al G418 pero que crecieron en placas YPDA. Raya las colonias identificadas en una nueva placa YPDA para obtener aislados de una sola colonia, y dejarlas crecer durante dos días a 30 grados. Compruebe la integración correcta del elemento de respuesta P53 deseado, realizando una reacción PCR con las condiciones mencionadas en el paso 1.20.Cargue una alícuota del producto PCR en gel de agarosa para comprobar la longitud correcta del amplión antes de la secuenciación de Sanger. Protocolo dos, presentamos un ejemplo de cómo evaluar la capacidad de transactivación de proteínas P53 utilizando el ensayo cualitativo de levadura adenina basada en color 2. Transforme las células de levadura con vectores de expresión P53 siguiendo el mismo protocolo basado en acetato de litio descrito en la sección uno.Raya colonias transformadoras de levadura única, hasta seis por plato, en una nueva placa selectiva, y dejar que crezcan durante la noche a 30 grados. Al día siguiente, utilizando terciopelos estériles, réplica las rayas en nuevas placas selectivas que permiten la evaluación del fenotipo de color, es decir, placas selectivas que contienen una cantidad limitante de adenina.Incubar a 30 grados durante tres días. Las mismas rayas se pueden replicar varias veces. Protocolo tres, ahora presentamos un ejemplo de la evaluación de la capacidad de transactivación de proteína P53 utilizando el ensayo cuantitativo de levadura LUC1 basado en luminiscencia.En primer lugar, transforme las células de levadura con vectores de expresión P53 siguiendo, de nuevo, el protocolo basado en acetato de litio descrito en la sección dos. Parcher los transformantes individuales en nuevas placas selectivas que contengan glucosa como fuente de carbono, y dejarlos crecer a 30 grados durante la noche. Para cada tipo de transformación, haga de cinco a siete parches diferentes.Después del crecimiento durante la noche, resuspender una pequeña cantidad de células mediante el uso de un palillo de dientes estéril o una punta de pipeta en medio selectivo sintético que contiene rafinosa como fuente de carbono. Estas suspensiones celulares deben tener una densidad óptica a 600 nanómetros alrededor de 0,4 y luego se pueden dividir en múltiples placas de 96 pocillos para la incubación a diferentes temperaturas, tratamientos, o para exponer las células a una cantidad variable de gatasta para activar la expresión P53. Para medir la actividad del reportero de luciérnforo, transfiera de 10 a 20 microlitros de suspensión celular de la placa transparente de 96 pozos a una placa blanca de 384 pozos, y mezcle las células con un volumen igual de tampón de licencia, incubando durante 10, 15 minutos a temperatura ambiente en una coctelera.Añadir 10, 20 microlitros de sustrato de luciosa de luciérped. Y mida las unidades de luz usando un lector de placas multietiqueta. Mida también la densidad óptica de los cultivos en la placa de 96 pozos.Protocolo cuatro, ahora presentamos un ejemplo de cómo explotar la inhibición del crecimiento de la levadura inducida por P53. Transforme las células de levadura con vectores de expresión P53, o conviértalas con vectores de expresión para coexpresar P53 y uno de sus cofactores, como MDM2, siguiendo, de nuevo, el protocolo basado en acetato de litio descrito en la sección uno. Cultivo de células transformadoras en medio selectivo a aproximadamente una densidad óptica.Y diluirlos a 0.05, y añadir una molécula elegida a la concentración adecuada. Incubar las células a 30 grados en un agitador durante 42 horas. Luego, siembra 100 microlitros de cultivo de células de levadura en placas medianas selectivas mínimas.Incubar durante dos días a 30 grados. La correcta integración RE en lugar del casete ICORE se puede comprobar mediante PCR de colonia, a partir de una pequeña cantidad de células de clones de levadura candidatos y utilizando imprimaciones descritas en la tabla tres para amplificar el locus objetivo. Los productos PCR, una banda de unos 500 nucleótidos, pueden ser comprobados por la secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia de la ubicación genómica editada para la presencia de la secuencia de elementos de respuesta P53 correcta.La cepa reportera está lista para ser utilizada en ensayos funcionales. Para evaluar la capacidad de transactivación de proteína P53, compruebe el color de las colonias de levadura. Por ejemplo, presentamos una comparación entre el tipo salvaje P53 y los mutantes R175H y R282W usando dos reporteros diferentes, P21-5-prime y PUMA, y dos temperaturas diferentes, 30 grados y 37 grados.Curiosamente, mientras que R175H es un alelo P53 de pérdida de función, colonias rojas en todas las condiciones, R282W muestra sensibilidad a la temperatura con actividad de transactivación residual a 30 grados, resultando en colonias blancas, pero pérdida de actividad a 37 grados, resultando en colonias rojas o rosadas. Un conjunto de datos extendido se presenta en la figura dos P53 de tipo B.Wild en cuatro alelos mutantes que se probaron para la transactivación utilizando 10 cepas diferentes de reportero de elementos de respuesta P53, tres temperaturas y niveles de expresión constitutiva. Los resultados se resumen en un código de color que recuerda el fenotipo de color de la colonia de levadura.El alelo mutante P53 K139E conserva la actividad parcial y es sensible al frío. Por ejemplo, las colonias son rojas en la cepa reportera GADD45 a 24 y 30 grados, pero son blancas a 37 grados. Aquí, presentamos un ejemplo de resultados obtenidos con este método, comparando la especificidad de la transactivación de la levadura humana y C.elegans P53.Los resultados en el gráfico de barras se expresan como unidades de luz relativa promedio con error estándar de cuatro réplicas. Se compararon cinco elementos de respuesta P53 diferentes. Se probaron tres niveles diferentes de expresión de proteína P53 variando la concentración de gactosa en el medio.Los dos ortologos P53 muestran una especificidad de transactivación marcadamente diferente. Esto se ejemplifica con los resultados con los elementos de respuesta ced13 y V1 que comparten la misma secuencia, excepto por la presencia o ausencia de un espaciador de 28 nucleótidos. El P53 humano exhibe una transactivación mucho más alta con el sitio de unión V1, mientras que C.elegans P53 muestra lo contrario.Los resultados son independientes del nivel de expresión P53 bajo el promotor inducible de gactosa. Mida el crecimiento de la levadura contando el número de colonias obtenidas en las caídas de cultivo de 100 microlitros. Calcular el efecto de reactivación mutante de compuestos considerando el crecimiento de la levadura de tipo salvaje P53 como el efecto máximo posible, establecido en 100%, mientras que el crecimiento de las células que expresan mutante P53 representa el nivel cero de reactivación.En este ejemplo, Nutlin-3a alivia la inhibición del tipo salvaje P53 causada por la coexpresión de MDM2, mientras que PhiKan083 reactiva parcialmente el mutante Y220C P53. En ambos casos, esto resulta en una reducción dependiente de P53 del crecimiento de la levadura. Las células basales de levadura han demostrado ser útiles para investigar valores, aspectos de las funciones proteicas P53.El protocolo descrito en este trabajo es particularmente sensible para evaluar el potencial de transactivación de tipo salvaje o mutante asociado al cáncer P53 a variantes de sitios de destino. Además, el enfoque se puede utilizar para identificar moléculas pequeñas que afectan a las funciones P53 y para estudiar la interacción P53 con cofactor. El uso de los reporteros de color, la miniaturización de la luciferasa, así como la prueba de inhibición del crecimiento resultan en ensayos rentables y escalables potencialmente susceptibles al cribado de bibliotecas químicas.Por último, el sistema descrito en este trabajo se puede adoptar fácilmente con el estudio de otros factores de transcripción específicos de la secuencia.

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Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Derribo condicional combinado y ensayo de formación de esferas adaptadas para estudiar un gen asociado a la stemness de células madre de cáncer gástrico derivadas del paciente

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Monitorización del conjunto eIF4F midiendo la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Uso de la herramienta E1A Minigene para estudiar los cambios en el empalme de ARNm

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flujo de trabajo de detección rápido para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...