Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Vi tackar Europeiska unionen (FEDER Funds POCI/01/0145/FEDER/007728 genom programa Operacional factores de Competitividade-konkurrera) och nationella fonder (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia och Ministério da Educação e Ciência) under Partnerskapsavtal PT2020 UID/QUI/50006/2019 och projekten (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT-stipendier: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Detta arbete stöddes av Compagnia S. Paolo, Turin, Italien (projekt 2017,0526) och hälsoministeriet, (projekt 5x1000, 2015 och 2016; nuvarande forskning 2016). Vi tackar djupt Dr Teresa López-Arias Montenegro (universitetet i Trento, experimentell vetenskap undervisning laboratorier) för att få hjälp med videoinspelning.

1. uppförande av ADE2 eller LUC1 reporter jäststammar som innehåller en specifik re (yafm-re eller ylfm-re)
<ol><li>Strimma en yafm-iCore eller ylfm-iCore stam12,14 (iCore = I, ISCE-I endonuclease under GAL1 promotor; CO = räknare valbar URA3; RE = reporter KanMX4 Förlänande kanamycin motstånd; Tabell 1) från en 15% glycerolstock lagrad vid-80 ° c på en YPDA-agar-platta (tabell 2</s...

Jästbaserade analyser har visat sig vara användbara för att undersöka olika aspekter av p53-proteinfunktioner. Dessa analyser är särskilt känsliga för utvärdering av p53-transaktiveringspotential mot varianter av RE-målplatser, inklusive utvärdering av funktionella polymorfismer. Användningen av färg reportrar samt miniatyrisering av luciferas-analysen resulterar i kostnadseffektiva och relativt skalbara analyser. Dessutom är tillväxthämmande test potentiellt mottagliga för att användas i kemisk bibliot...

Transkription är en mycket komplicerad process som involverar dynamisk, rumslig och tidsmässig organisering av transkriptionsfaktorer (TFs) och kofaktorer för rekrytering och modulering av RNA-polymeraser på kromatinregioner som svar på specifika stimuli1 . De flesta TFs, inklusive den humana p53-tumörsuppressor, känner igen specifika CIS-verkande element i form av DNA-sekvenser som kallas responselement (REs), som består av enstaka (eller flera) unika motiv ~ 6-10 nukleotider långa. Inom dessa motiv kan individuella positioner Visa olika grader av variabilitet2, vanligen sammanfattade efter positions vikts matriser (PWM) eller logotyper3,4.
Jästen S. cerevisiae är ett lämpligt modellsystem för att studera olika aspekter av mänskliga proteiner genom komplessionstester, ektopisk uttryck och funktionella analyser, även när en ortolog jästgen inte är närvarande5, 6 , 7. på grund av det evolutionära bevarandet av basala komponenter i transkriptionella systemet8, många mänskliga TFS (när ectopically uttrycks i jästceller) kan modulera uttrycket av en reporter gen genom att agera genom initiativtagare konstruerade för att innehåller lämpliga förnybara energikällor. Den transkription modellsystem som presenteras här för humant p53 kännetecknas av tre stora variabler vars effekter kan moduleras: 1) den modalitet uttryck och typ av p53, 2) den RE sekvens kontrollera p53-beroende transkription, och 3) vilken typ av reporter-genen (figur 1a).
När det gäller p53-uttryckets modalitet tillåter S. cerevisiae valet av inducerbara, repressibla eller konstitutiva initiativtagare9,10,11. I synnerhet tillåter den inducerbara GAL1 promotorn basal (med raffinos som kolkälla) eller variabel (genom att ändra mängden galaktos i Media) uttryck för en TF i jäst. I själva verket representerar det fint avstämda uttrycket en kritisk utveckling för att studera inte bara p53 självt utan även andra p53-familjproteiner12,13.
När det gäller den typ av förnybara energikällor som styr det p53-beroende uttrycket gör S. cerevisiae det möjligt att bygga olika reporter stammar som har unika skillnader i intresse för en annars ISOGEN bakgrund. Detta mål nås med hjälp av en anpassning av en särskilt mångsidig genom redigering metod som utvecklats i S. cerevisiae, kallad delitto Perfetto12,14,15,16.
Dessutom kan olika rapportörer (dvs. URA3, HIS3 och ADE2) användas för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera transkriptionella aktiviteter av humant TFS i S. cerevisiae, var och en med specifika funktioner som kan skräddarsys efter experimentella behov17,18,19,20,21. Uttrycket av dessa rapportgener ger uracil, histidin, och adenin prototrophy, respektive. Den URA3 reporter tillåter inte tillväxten av celler i närvaro av 5-FOA också, och därmed kan det motväljas. Den ADE2 reporter systemet har fördelen att, förutom näringsmässiga urval, det gör det möjligt att identifiera jästceller som uttrycker vildtyp (dvs funktionella på ADE2 uttryck) eller mutant (dvsinte funktionella på ADE2 ) P53 från kolonens färg.
Till exempel, jästceller uttrycker ADE2 genen generera normalt stora vita kolonier på plattor som innehåller begränsande mängder av adenin (2.5-5.0 mg/L), medan de som dåligt eller inte transkribera det visas på samma platta som mindre röd (eller rosa) Kolonier. Detta beror på ackumulering av en intermediär i adenin biosyntetiska väg (dvs, P-ribosylamino-Imidazol, som tidigare har kallats amino-Imidazol ribotid eller luft), som omvandlas till ett rött pigment. Den kvalitativa färgbaserade ADE2 reporter genen har sedan ersatts med den kvantitativa Firefly Photinus mottfjärilar (LUC1)12,22. På senare tid har ADE2 reporter kombinerats med lacz reporter i en lätt-till-poäng, semi-kvantitativ, dubbel reporter test som kan utnyttjas för att underklassificera p53 mutanter enligt deras kvarvarande nivå av funktionalitet 23.
Fluorescerande reportrar som egfp (Enhanced Green fluorescerande protein) eller dsred (discosoma SP. Red fluorescerande protein) har också använts för kvantitativ utvärdering av transaktiveringsaktivitet förknippad med alla möjliga genom-mutationer i TP53 kodning sekvens24. Slutligen har möjligheten att kombinera avstämbara promotorer för p53-allel-uttryck med isogena jäststammar som skiljer sig för re-och/eller reporter-genen lett till utvecklingen av en datamatris som genererar en förfinad klassificering av cancerrelaterad och köns Cells muterade p53-alleler25,26,27.
De metoder som beskrivs ovan används för att mäta den transkriptionella aktiviteten hos proteinet p53. Emellertid kan uttrycket av vildtyp p53 i jästen S. cerevisiae28 och Schizosaccharomyces pombe29 orsaka tillväxthämning, som har förknippats med cellcykelarrest28,30 eller celldöd31. I båda fallen utlöses jästtillväxthämning av högt p53-uttryck och har korrelerats med potentiell transkriptionell modulering av endogena jästgener involverade i celltillväxt. Genom att stödja denna hypotes har förlusten av funktion Mutant p53 R273H inte interfererat med jästcellernas tillväxt när den uttrycks på liknande nivåer som vildtyp p5332. Omvänt orsakade uttrycket i jäst av det giftiga muterade p53 V122A (känt för högre transkriptionell aktivitet jämfört med vildtyp p53) en starkare tillväxthämmande effekt än av vildtyp p5332.
Dessutom visades att Human MDM2 kunde hämma den humana p53-transkriptionella aktiviteten i jäst, främja dess ubiquitination och efterföljande nedbrytning33. Följaktligen visades förmågan hos Human MDM2 och mdmx att hämma p53-inducerad jäst tillväxthämning32,34. I en ytterligare studie fastställdes ett samband mellan p53-transskriptionell aktivitet och aktin-uttrycksnivåer, med identifieringen av ett förmodat p53-medel uppströms på ÄRV1 -genen i jäst32. Konsekvent, aktin uttryck förstärktes av vildtyp p53 och ännu mer av p53 V122A, men inte av muterat p53 R273H. Omvänt minskade aktin-uttrycket av p53 i samtidig förekomst av p53-hämmare MDM2, mdmx eller pifithrin-α (en liten molekyl hämmare av p53-transkriptionell aktivitet), som överensstämde med resultat baserade på jästtillväxtanalysen. Viktigt, dessa resultat fastställde ett samband mellan p53-inducerad tillväxthämning och graden av dess aktivitet i jäst, som också har utnyttjats för att identifiera och studera små molekyler som modulerar p53-funktioner28,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

Konstaterandet att det välkända proteinet hos däggdjur p53 kan fungera som en transkriptionsfaktor (TF) i jästen S. cerevisiae har tillåtit utveckling av olika funktionella analyser för att studera effekterna av 1) bindnings plats [dvs., responselement (re)] sekvenvarianter på p53-transaktiveringselektivitet eller 2) TP53 -mutationer, Co-uttryckta kofaktorer eller små molekyler på p53-transaktiveringsaktivitet. Olika grundläggande och translationella forskningstillämpningar har utvecklats. Experimentellt, dessa metoder utnyttja två stora fördelar med jästen modell. Å ena sidan möjliggör enkel genom redigering snabb konstruktion av kvalitativa eller kvantitativa reporter system genom att utnyttja isogena stammar som endast skiljer sig åt på en specifik p53-RE för att undersöka sekvensspecificitet hos p53-beroende transaktivering. Å andra sidan tillåter tillgängligheten av reglerade system för utomkvedshavandeskap p53-uttryck utvärderingen av transaktivering i ett brett spektrum av proteinuttryck. Granskas i denna rapport är i stor utsträckning används system som bygger på färg reporter gener, luciferase, och tillväxten av jäst för att illustrera deras viktigaste metodologiska steg och att kritiskt bedöma deras prediktiva effekt. Dessutom kan den extrema mångsidigheten hos dessa metoder lätt utnyttjas för att studera olika TFs inklusive p63 och P73, som är andra medlemmar i TP53 Gene familj.

Byggandet av ADE2 or LUC1 reporter jäststammar
Dendelitto perfettoapproach12,14,15,16 har anpassats för att möjliggöra byggandet av p53 reporter jäststammar (figur 1...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Presenteras här är fyra protokoll för att konstruera och exploatera jäst Saccharomyces cerevisiae reporter stammar att studera humant p53 transaktiveringspotential, effekterna av dess olika cancerrelaterade mutationer, Co-uttryckta samverkande proteiner, och effekterna av specifika små molekyler.

Jäst som chassi för att utveckla funktionella analyser för att studera humant p53

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Hej, mitt namn är Bartolomeo Bosco, och jag är doktorand vid Laboratory of Transcriptional Network vid Centrum för integrativ biologi vid universitetet i Trento i Italien. Som ni vet är transkription en extremt komplex process som involverar rumslig och tidsmässig organisation av transkriptionsfaktor och kofaktor. De flesta av dem, inklusive den mänskliga P53, erkänna specifika cis-agerar element, kallas svarselement, och bindning på denna DNA-sekvensering krävs för modulering av transkriptionen av målgener.I detta arbete, Vi skulle vilja visa dig protokollet för att studera P53 sekvens specifika i transaktivering funktioner med hjälp av jäst som ett modellsystem som protein i en färg reporter gen eller luciferas eller på kvantifiering av celltillväxt för att belysa de viktigaste experimentella steg och mångsidigheten hos dessa metoder. Protokoll ett, konstruktion av reporter jäst stammar som innehåller en specifik P53 svar element uppströms adenin-2 eller firefly luciferas genen. För att konstruera en reporter stam, först följa steg 1.1 till 1.15 att omvandla jästceller med oligonukleotider inriktning önskad promotor regionen.Omvandlingen baseras på det standard litiumacetat-baserade protokollet. När transformanter visas på 5-FOA plattor, vanligtvis efter tre dagars inkubation vid 30 grader, replika platta dem på icke-selektiva YPDA plattor och även på YPDA plattor som innehåller G418, märkning varje platta för att underlätta deras efterföljande jämförelse. Inkubera plattorna över natten vid 30 grader.Nästa dag, identifiera kandidaten reporter stammar från kolonier som är G418-känsliga men växte på YPDA plattor. Strimla de identifierade kolonierna på en ny YPDA-platta för att få enstaka koloniisover, och låt dem växa i två dagar vid 30 grader. Kontrollera korrekt integration av önskad P53 svar element, utför en PCR reaktion med villkor som nämns i steg 1.20.Ladda en alikvot av PCR-produkten på agarosgel för att kontrollera rätt amplikonlängd före Sanger-sekvensering. Protokoll två, presenterar vi ett exempel på hur man utvärderar P53 protein transaktivering förmåga med hjälp av den kvalitativa färg-baserade adenin-2 jäst analys. Omvandla jästceller med P53 uttryck vektorer efter samma litium acetat-baserade protokoll som beskrivs i avsnitt ett.Streak enda jäst transformant kolonier, upp till sex per tallrik, på en ny selektiv platta, och låt dem växa över natten på 30 grader. Dagen efter, med hjälp av sterila sammet, replika plattan strecken på nya selektiva plattor som möjliggör bedömning av färgen fenotyp, dvs selektiva plattor som innehåller begränsa mängden adenin.Inkubera i 30 grader i tre dagar. Samma streck kan replikeras flera gånger. Protokoll tre, presenterar vi nu ett exempel på utvärderingen av P53 protein transactivation förmåga med hjälp av kvantitativa luminegel-baserade LUC1 jäst analysen.Först omvandla jästceller med P53 uttryck vektorer efter, igen, litiumacetat-baserade protokollet som beskrivs i avsnitt två. Patch enda transformants på nya selektiva plattor som innehåller glukos som kolkälla, och låt dem växa i 30 grader över natten. För varje omvandlingstyp gör du fem till sju olika korrigeringsfiler.Efter den över natten tillväxt, resuspend en liten mängd celler genom att använda en steril tandpetare eller en pipett spets i syntetiskt selektivt medium som innehåller raffinose som kolkälla. Dessa cell suspensioner bör ha en optisk densitet vid 600 nanometer runt 0,4 och kan sedan delas i flera 96-brunns plattor för inkubering vid olika temperaturer, behandlingar, eller att exponera celler till varierande mängd galaktos för att aktivera P53 uttryck. För att mäta firefly reporter aktivitet, överföra 10 till 20 mikroliter cell suspension från den genomskinliga 96-brunnsplattan i en vit 384-brunnsplatta, och blanda cellerna med en lika stor volym av lysbuffert, inkubera i 10, 15 minuter vid rumstemperatur på en shaker.Tillsätt 10, 20 mikroliter av firefly luciferasubstrat. Och mäta ljusenheter med hjälp av en multilabel tallrik läsare. Mäta också den optiska tätheten av kulturerna i 96na-brunnen pläterar.Protokoll fyra, presenterar vi nu ett exempel på hur man kan utnyttja hämningen av tillväxten av jäst framkallas av P53. Omvandla jästceller med P53-uttrycksvektorer, eller cotransform dem med uttrycksvektorer för att coexpress P53 och en av dess kofaktorer, såsom MDM2, efter, igen, litiumacetat-baserade protokollet som beskrivs i avsnitt ett. Odla transformant celler i selektivt medium till ungefär en optisk densitet.Och späd dem till 0,05, och tillsätt en vald molekyl till lämplig koncentration. Inkubera celler i 30 grader på en skakmaskin i 42 timmar. Sedan, frö 100 mikroliter av jäst cellkultur i minimal selektiva medelplattor.Inkubera i två dagar vid 30 grader. Den korrekta RE-integrationen i stället för ICORE-kassetten kan kontrolleras av kolonin PCR, med början från en liten mängd celler från kandidatjästkloner och använda primers som beskrivs i tabell tre för att förstärka den riktade locusen. PCR-produkter, ett band på ca 500 nukleotider, kan sedan kontrolleras av Sanger sekvensering för att bekräfta sekvensen av den redigerade genomiska platsen för närvaron av rätt P53-responselementsekvens.Reporterstammen är klar att användas i funktionella analyser. För att utvärdera P53 protein transaktivering förmåga, kontrollera färgen på jäst kolonier. Till exempel presenterar vi en jämförelse mellan wild-type P53 och mutanterna R175H och R282W med hjälp av två olika reportrar, P21-5-prime och PUMA, och två olika temperaturer, 30 grader och 37 grader.Intressant, medan R175H är en förlust-of-funktion P53 allel, röda kolonier i alla förhållanden, R282W visar temperaturkänslighet med kvarvarande transaktivering aktivitet vid 30 grader, vilket resulterar i vita kolonier, men förlust av aktivitet vid 37 grader, vilket resulterar i röda eller rosa kolonier. En utökad datauppsättning presenteras i figur två B.Wild-typ P53 i fyra mutanta alleler testades för transaktivering med hjälp av 10 olika P53 svar element reporter stammar, tre temperaturer och konstitutiva uttryck nivåer. Resultat sammanfattas i en färgkod som påminner jästkolonin färg fenotyp.Den P53 K139E mutanta allelen behåller partiell aktivitet och är kallkänslig. Till exempel är kolonier röda i GADD45-reporterstammen vid 24 och 30 grader, men de är vita vid 37 grader. Här presenterar vi ett exempel på resultat som erhållits med denna metod, jämföra transaktiverings specificiteten hos mänskliga och C.elegans P53 jäst.Resultat i stapeldiagrammet uttrycks som genomsnittliga relativa ljusenheter med standardfel på fyra replikat. Fem olika P53 svar element jämfördes. Tre olika nivåer av P53 protein uttryck testades genom att variera koncentrationen av galaktos i mediet.De två P53 ortologikerna visar markant olika transaktiveringssysstnad. Detta exemplifieras av resultaten med ced13 och V1 svar element som delar samma sekvens, med undantag för närvaro eller frånvaro av en 28-nukleotid distanser. Human P53 uppvisar mycket högre transaktivering med V1-bindningsstället, medan C.elegans P53 visar motsatsen.Resultaten är oberoende av nivån på P53 uttryck under galaktos-inducerbara promotorn. Mät jästtillväxt genom att räkna antalet kolonier som erhålls i de 100 mikroliterskulturen sjunker. Beräkna mutant reaktiveringseffekten av föreningar med tanke på tillväxten av vilda typ P53 uttrycker jäst som maximal möjlig effekt, satt till 100%medan tillväxten av celler som uttrycker mutantA P53 utgör noll nivå av reaktivering.I det här exemplet avlastar Nutlin-3a hämningen av P53 av vildtyp som orsakas av coexpressionen av MDM2, medan PhiKan083 delvis återaktiverar Y220C P53-mutanten. I båda fallen resulterar detta i en P53-beroende minskning av jäst tillväxt. Jäst basala celler har visat sig användbara för att undersöka värden, aspekter av P53 protein funktioner.Det protokoll som beskrivs i detta arbete är särskilt känsliga för att utvärdera transaktiveringspotential av vild-typ eller cancer-associerade mutant P53 till varianter av målplatser. Vidare kan tillvägagångssättet användas för att identifiera små molekyler som påverkar P53-funktioner och för att studera P53 interaktion med kofaktor. Användningen av färgen reportrar, miniatyrisering av luciferas, samt tillväxthämning test resultera i kostnadseffektiva och skalbara analyser potentiellt mottagliga för kemiska bibliotek screening.Slutligen kan det system som beskrivs i detta arbete enkelt antas med studiet av andra sekvensspecifika transkriptionsfaktorer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser för att studera makrofager och mikroglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Hur att studera Basement Membrane styvhet som en Biophysical Trigger vid prostatacancer och andra åldersrelaterade sjukdomar eller metabola sjukdomar

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Colon-26 karcinom tumörbärande mus som en modell för studier av cancerkakexi

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostata Organoid kulturer som verktyg för att översätta genotyper och Mutationella profiler till farmakologiska svar

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Kombinerad villkorlig Knockdown och anpassad sfärbildning assay att studera en Stemness-Associated Gene av patient-derived Gastric Cancer Stamceller

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Övervakning av eIF4F-sammansättning genom mätning av eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

Använda E1A Minigene Tool för att studera mRNA-splitsningsändringar

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ett snabbt screeningarbetsflöde för att identifiera potentiell kombinationsterapi för GBM med hjälp av patientbaserade Glioma-stamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Bröst epitelial och endotelcellssfäroider som en potentiell funktionell in vitro-modell för bröstcancerforskning

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...