Name: yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53
Uploaded: 2019-08-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Biz Avrupa Birliği (FEDER fonları POCI/01/0145/FEDER/007728 programa Operacional factores de rekabet Vidade YARıŞıN) ve ulusal fonlar (FCT/MEC, Fundação para a Ciência e Tecnologia ve Ministério da Educação e Ciência) altında teşekkür Ortaklık Anlaşması PT2020 UID/QUI/50006/2019 ve projeler (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014-POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT burs: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Bu çalışma Compagnia S. Paolo, Torino, Italya (Project 2017,0526) ve Sağlık Bakanlığı, (proje 5x1000, 2015 ve 2016; güncel araştırma 2016) tarafından destekleniyordu. Video kaydı ile ilgili yardım almak için Dr. Teresa López-Arias Montenegro 'ya (Trento Üniversitesi, Deneysel Bilimler Öğretim laboratuvarları) derinden teşekkür ediyoruz.

1. özel bir RE (yAFM-RE veya yLFM-RE) içeren ADE2 veya LUC1 muhabiri maya suşları inşaatı
<ol><li>Yafm-ıcore veya ylfm-ıcore strain,12,14 (ıcore = ı, ISCe-ı endonükleaz GAL1 Promoter altında) Streak; CO = sayaç seçilebilir URA3; RE = muhabir KanMX4 kanamyisin direnci conferring; Tablo 1) bir YPDA agar plakasında-80 °C ' de saklanan% 15 gliserol stokta (Tablo 2). 2-3 ...

Maya tabanlı konular p53 protein fonksiyonlarının çeşitli yönlerini araştırmak için yararlı olduğunu kanıtladı. Bu değerlendirme, fonksiyonel polimorfizmlerinin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere RE hedef sitelerin türevleri doğrultusunda p53 Transaktivasyon potansiyelini değerlendirmek için özellikle duyarlıdır. Renkli gazetecilerin kullanımı yanı sıra Lusiferaz tahlil sonucu minyatürleşme maliyet-etkili ve nispeten ölçeklenebilir gösteriyor. Ayrıca, büyüme inhibisyonu testi potans...

Transkripsiyon, belirli uyaranlara yanıt olarak kromatin bölgelerinde RNA polimerinlerinin işe alma ve modülasyonu için dinamik, uzamsal ve temporal transkripsiyon faktörleri (TFs) ve Kofaktörler organizasyonu içeren son derece karmaşık bir süreçtir1 . Çoğu TFs, insan p53 tümör bastırıcı dahil, DNA dizileri şeklinde belirli cis-etkili unsurları tanımak yanıt elemanları denilen (REs), tek (veya birden fazla) benzersiz motifleri oluşur ~ 6-10 nükleotid uzun. Bu motifler içinde, bireysel pozisyonlar varyasyon2, genellikle pozisyon ağırlık matrisleri (PWM) veya logolar3,4tarafından özetlenen çeşitli dereceleri gösterebilir.
Maya S. cerevisiae , bir ortolog Maya geni mevcut olmadığında bile, tamamlayıcı bulgular, ektopik ifade ve fonksiyonel bulgular yoluyla insan proteinlerinin farklı yönlerini incelemek için uygun bir model sistemidir. 6 , 7. transkripsiyon sisteminin bazal bileşenlerinin evrimsel koruma nedeniyle8, birçok insan TFs (ektopik Maya hücrelerinde ifade edildiğinde) için tasarlanan organizatörler aracılığıyla hareket ederek bir muhabir geni ifadesi modüle olabilir uygun REs içerir. Burada insan p53 için sunulan transkripsiyon modeli sistemi, etkileri modüle edilebilir üç büyük değişken ile karakterize edilir: 1) ifade ve p53 türünün modalitesi, 2) RE dizisi p53 bağımlı transkripsiyon kontrol, ve 3) türü (Şekil 1a).
P53 ifadesinin modalitesi ile ilgili olarak, S. cerevisiae , indüklenebilir, bastırılabilir veya kurucu organizatörler9,10,11' in seçimini sağlar. Özellikle, indüklenebilir GAL1 Organizatör bazal sağlar (bir karbon kaynağı olarak bulunan Rafinoz kullanarak) veya değişken (medyada galaktoz miktarını değiştirerek) Maya bir TF ifadesi. Aslında, ince ayarlanabilir ifade sadece p53 kendisi değil, aynı zamanda diğer p53 aile proteinlerini incelemek için kritik bir gelişimi temsil eder12,13.
P53-bağımlı ifade kontrol res türü ile ilgili olarak, S. cerevisiae başka bir izojenik arka plan ilgi Re benzersiz farklılıklar sahip farklı gazeteci suşları inşası sağlar. Bu amaç, S. cerevisiae'de geliştirilen ve delitto Perfetto12,14,15,16adlı özellikle çok yönlü genom düzenleme yaklaşımının adaptasyonu kullanılarak ulaşılır.
Ayrıca, farklı muhabir genler (i.e., URA3, HIS3, ve ADE2) niteliksel ve niceliksel S. cerevisiaeiçinde insan TFs transkripsiyonel faaliyetleri değerlendirmek için kullanılabilir, belirli özellikleri ile her Deneysel ihtiyaçlar için uyarlanmış17, 18,19,20,21. Bu muhabirin genlerinin ifadesi, sırasıyla urasil, histidin ve adenin protorofinin ifadesidir. URA3 Reporter 5-FOA varlığında hücrelerin büyümesini de izin vermez ve böylece counterselected olabilir. ADE2 Reporter sistem avantajı vardır, beslenme seçimi yanı sıra, bu vahşi tipi (i.e., ADE2 ifade işlevsel) veya Mutant (i.e.,fonksiyonel değil ifade Maya hücrelerinin tanımlanması sağlar ADE2 ) Koloni renkten p53.
Örneğin, ADE2 geni ifade Maya hücreleri normal boyutta beyaz koloniler (2.5-5.0 mg/L) adenin miktarları sınırlayıcı içeren plakaları oluşturmak, bu kötü ya da daha küçük kırmızı (veya pembe) aynı plaka üzerinde görünür transkripleme değil iken Koloni. Bu, bir orta adenin biyosentetik yol birikimi nedeniyle (yani, P-ribosylamino-imidazol, daha önce amino-imidazol ribotide veya hava denir), kırmızı bir pigment oluşturmak için dönüştürülür. Nicel Firefly photinus pyralis (LUC1)12,22ile değiştirildi bu yana nitel renk tabanlı ADE2 Reporter gen vardır. Daha yakın zamanda, ADE2 Reporter lacz Reporter ile kombine edilmiştir kolay-to-Score, yarı-niceliksel, Çift muhabiri assay bu alt sınıflandırmak için yararlanılabilir p53 mutantlar işlevselliği onların kalıntı düzeyine göre 23 yaşında.
EGFP (Gelişmiş yeşil floresan proteini) veya DsRed (Discosoma Sp. kırmızı floresan proteini) gibi floresan muhabirleri, tüm olası yanlış mutasyonlar ile ilişkili Transaktivasyon aktivitesinin nicel değerlendirilmesi için de kullanılmıştır. TP53 kodlama sırası24. Son olarak, Re ve/veya muhabir geni için farklı izojenik maya suşları ile p53 allel ifade için ayarlanabilir Rehberleri birleştirerek şans kanser ilişkili ve germline rafine sınıflandırma üreten bir veri matrisinin gelişmesine yol açmıştır mutant p53 alelleri25,26,27.
Yukarıda açıklanan yaklaşımlar p53 proteinin transkripsiyonel aktivitesini ölçmek için kullanılır. Ancak, MA S. cerevisiae28 ve şizofrenozaccharomyces pombe29 ' da Wild-Type p53 ifadesi, hücre döngüsü tutuklaması ile ilişkili olan büyüme gerilmesine neden olabilir28,30 veya hücre ölümü31. Her iki durumda da, Maya büyüme inhibisyonu yüksek p53 ifadesi ile tetiklenir ve hücre büyümesi dahil endojen Maya genlerinin potansiyel transkripsiyonel modülasyonu ile korelasyon olmuştur. Bu hipotezi destekleyen, kayıp-of-fonksiyon mutant p53 R273H mantar hücre büyüme vahşi tipi olarak benzer düzeylerde ifade edildiğinde müdahale etmedi p5332. Tersine, toksik mutant p53 V122A Maya ifadesinde (vahşi tip p53 ile karşılaştırıldığında daha yüksek transkripsiyonel aktivite için bilinen) vahşi tip p5332daha güçlü bir büyüme inhibitör etkisi neden oldu.
Ayrıca, insan MDM2 Maya, onun mayası ve sonraki bozulma33teşvik insan p53 transkripsiyonel aktivite inhibe başardı gösterildi. Buna göre, human MDM2 ve mdmx p53 indüklenen Maya büyüme inhibisyonu inhibe yeteneği gösterildi32,34. Ek bir çalışmada, p53 transkripsiyonel aktivite ve aktin ifade seviyeleri arasında bir korelasyon, Maya32 ACT1 geni üzerinde bir Putatif p53 Re upstream belirlenmesi ile kuruldu. Sürekli olarak, aktin ifadesi Wild-Type p53 ve daha çok p53 V122A tarafından, ancak mutant p53 R273H tarafından geliştirilmiştir. Tersine, p53 tarafından aktin ifadesi p53 inhibitörleri MDM2, mdmx veya pifithrin-α (p53 transkripsiyon aktivitesinin küçük bir molekül inhibitörü), Maya-büyüme tahlil dayalı sonuçlar ile tutarlı bir ortak varlığı azaldı. Daha da önemlisi, bu sonuçlar p53-indüklenen büyüme inhibisyonu ve Maya aktivitesinin derecesi arasında bir korelasyon kuruldu, hangi da tanımlamak ve küçük moleküller modüle p53 fonksiyonları çalışma sömürüldü28,34 , 35.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:790px;" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Aspartic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">11189</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:119px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:123px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Phenylalanine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">78019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:486px;">Peptone</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:486px;">Yeast ex+A2:C26tract</td>
			<td style="width:119px;">BD Bacto</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">BDTM</td>
			<td style="width:123px;">233520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lithium Acetate Dihydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:486px;">Bacteriological Agar Type A</td>
			<td style="width:119px;">Biokar Diagnostics</td>
			<td style="width:123px;">A1010 HA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A2939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Arginine Monohydro-chloride</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A5131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Adenine Hemisulfate Salt</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Passive Lysis Buffer 5x</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E1941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Bright-Glo Luciferase Assay System&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PROMEGA</td>
			<td style="width:123px;">E2620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">5-FOA</td>
			<td style="width:119px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:123px;">F9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Galactose</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">Dextrose&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Isoleucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Lysine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L1262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Methionine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">M2893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:486px;">D-(+)-Raffinose Pentahydrate</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">R0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Serine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Threonine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Valine</td>
			<td style="width:119px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

yeast as a chassis for developing functional assays to study human p53

Bilinen memeli p53 proteinin, Maya S. cerevisiae 'de bir transkripsiyon faktörü (TF) olarak hareket edebilir bulgu, 1 ' in etkilerini incelemek için farklı fonksiyonel bulguların gelişmesine izin verdi) bağlayıcı site [Yani, yanıt elemanı (Re)] p53 transaktivasyonu özgüllüğü veya 2) TP53 mutasyonlar, ortak ifade edilen Cofactors veya p53 Transaktivasyon aktivitesinde küçük moleküller üzerinde sıra türevleri. Farklı temel ve translasyonel araştırma uygulamaları geliştirilmiştir. Deneysel olarak, bu yaklaşımlar Maya modelinin iki büyük avantajları sömürüyor. Bir yandan, genom düzenleme kolaylığı, yalnızca belirli bir p53-RE seviyesinde farklı olan izojenik suşları sömürüyor ve p53 bağımlına göre sıralı-özgüllüğü araştırmak için nitel veya kantitatif muhabir sistemlerinin hızlı inşası sağlar transaktivasyonu. Öte yandan, ektopik p53 ifadesi için düzenlenmiş sistemlerin kullanılabilirliği, çok çeşitli protein ifadesinde Transaktivasyon değerlendirilmesi sağlar. Bu raporda yaygın olarak renk muhabiri genler, luciferase ve Maya büyümesi temel metodolojik adımları göstermek ve eleştirel onların öngörü gücünü değerlendirmek için dayalı sistemler kullanılır. Dahası, bu yaklaşımların aşırı çok yönlülüğü, TP53 gen ailesinin diğer üyeleri olan P63 ve P73 dahil olmak üzere farklı TFs çalışmaları için kolayca yararlanılabilir.

İnşaatı ADE2 veya LUC1 muhabir maya suşları
Delitto perfettoyaklaşım12,14,15,16 p53 Reporter maya suşları (Şekil 1B) inşası sağlamak için adapte ed...

Watch this Scientific Journal Video about Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53 at JoVE.com

Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53

Burada sunulan dört protokolleri oluşturmak ve mayalı Saccharomyces cerevisiae muhabiri suşları insan p53 Transaktivasyon potansiyeli, çeşitli kanserle ilişkili mutasyonlar etkileri, ortak ifade etkileşim proteinleri çalışma ve istismar spesifik küçük moleküllerin etkileri.

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

The finding that the well-known mammalian P53 protein can act as a transcription factor (TF) in the yeast S. cerevisiae has allowed for the development of ...

Merhaba, benim adım Bartolomeo Bosco, ve İtalya Trento Üniversitesi Bütünleştirici Biyoloji Merkezi Transkripsiyonel Ağ Laboratuvarı'nda doktora öğrencisiyim. Bildiğiniz gibi transkripsiyon transkripsiyon faktörü ve kofaktör mekansal ve zamansal organizasyonu içeren son derece karmaşık bir süreçtir. Çoğu, insan P53 de dahil olmak üzere, yanıt elementleri olarak adlandırılan belirli cis-acting elemanları tanımak, ve bu DNA-sıralama için bağlayıcı hedef genlerin transkripsiyon modülasyonu için gereklidir.Bu çalışmada, size, transaktivasyon fonksiyonlarına özgü P53 dizisini, mayayı bir renk muhabiri geninde veya luciferase'de protein olarak model sistemi olarak kullanarak veya bu yaklaşımların ana deneysel adımlarını ve çok yönlülüğünü vurgulamak için hücre büyümesinin niceliklerini vurgulamak için test olarak kullanma protokolünü göstermek istiyoruz. Protokol bir, adenin-2 veya firefly luciferase geninin yukarı doğru belirli bir P53 tepki elemanı içeren muhabir maya suşlarının yapımı. Bir muhabir gerginlik inşa etmek için, ilk adımları izleyin 1.1 ile 1.15 istenilen promotör bölge hedefleyen oligonükleotidler ile maya hücreleri dönüştürmek için.Dönüşüm standart lityum asetat bazlı protokole dayanmaktadır. Transformatörler 5-FOA plakalar üzerinde görünür, genellikle 30 derece kuluçka üç gün sonra, çoğaltma plaka olmayan seçici Olmayan YPDA plakaları üzerine ve ayrıca YPDA plakalar G418 içeren, sonraki karşılaştırma kolaylaştırmak için her plaka işaretleme. Tabakları bir gecede 30 derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, G418 duyarlı ama YPDA plakaları üzerinde büyüdü kolonilerin aday muhabir suşları belirlemek. Tek koloni izole elde etmek için yeni bir YPDA plaka üzerinde tanımlanan koloniler Çizgi ve onları 30 derece iki gün boyunca büyümeye izin. Adım 1.20'de belirtilen koşullarla PCR reaksiyonu gerçekleştirarak istenen P53 yanıt elemanının doğru entegrasyonunu kontrol edin.Sanger sıralamadan önce doğru amplicon uzunluğunu kontrol etmek için PCR ürününün bir aliquot'u agarose jelüzerine yükleyin. İkinci protokol, nitel renk bazlı adenin-2 maya testini kullanarak P53 protein transaktivasyon yeteneğinin nasıl değerlendirilebildiğini anlatan bir örnek sayılmiyoruz. Birinci bölümde açıklanan aynı lityum asetat bazlı protokolü izleyerek P53 ifade vektörleri ile maya hücrelerini dönüştürün.Çizgi tek maya transformant koloniler, plaka başına altı kadar, yeni bir seçici plaka üzerinde, ve onları 30 derece bir gecede büyümeye izin. Ertesi gün, steril kadifeler kullanarak, çoğaltma plaka renk fenotip değerlendirilmesi için izin yeni seçici plakalar üzerinde çizgiler, yani adenin sınırlayıcı miktarda içeren seçici plakalar.Üç gün boyunca 30 derecede kuluçkaya yat. Aynı çizgiler çoğaltma birden çok kez kaplanabilir. Protokol üç, şimdi kantitatif lüminesans tabanlı LUC1 maya test ini kullanarak P53 protein transaktivasyon yeteneğinin değerlendirilmesinin bir örneğini savuruyoruz.İlk olarak, aşağıdaki P53 ifade vektörleri ile maya hücreleri dönüştürmek, yine, lityum asetat tabanlı protokol bölüm iki açıklanan. Karbon kaynağı olarak glikoz içeren yeni seçici plakalara tek transformantlar yerleştirin ve bir gecede 30 derecede büyümelerini bekleyin. Her dönüşüm türü için beş ila yedi farklı yamalar yapın.Bir gecede büyümeden sonra, karbon kaynağı olarak raffinose içeren sentetik seçici ortamda steril kürdan veya pipet ucu kullanarak hücrelerin küçük bir miktar resuspend. Bu hücre süspansiyonları 0.4 civarında 600 nanometre de optik bir yoğunluğa sahip olmalı ve daha sonra farklı sıcaklıklarda kuluçka için birden fazla 96-iyi plakalar bölünebilir, tedaviler, ya da P53 ifadesini etkinleştirmek için galaktoz değişen miktarda hücreleri maruz bırakmak için. Ateş böceği nin etkinliğini ölçmek için, şeffaf 96 kuyulu plakadan 10 ila 20 mikrolitre hücre süspansiyonu beyaz 384 kuyulu bir plakaya aktarın ve hücreleri eşit hacimli lysis tamponuyla karıştırın ve oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.Ateş böceği luciferase substrat 10, 20 mikrolitre ekleyin. Ve ışık birimlerini çok etiketli plaka okuyucu kullanarak ölçün. Ayrıca 96-kuyu plaka kültürlerin optik yoğunluğunu ölçün.Protokol 4, şimdi P53 tarafından indüklenen maya büyüme inhibisyonu yararlanmak için nasıl bir örnek sıyoruz. Maya hücrelerini P53 ifade vektörleriyle dönüştürün veya P53'ü ve MDM2 gibi kofaktörlerinden birini, bölüm bir'de açıklanan lityum asetat bazlı protokolü takip etmek için ifade vektörleriyle dönüştürün. Transformant hücreleri seçici ortamda yaklaşık bir optik yoğunluğa büyütün.Ve 0.05 onları seyreltmek ve uygun konsantrasyoniçin seçilen bir molekül ekleyin. Hücreleri 30 derecede bir çalkalayıcıyla 42 saat kuluçkaya yatırın. Sonra, en az seçici orta plakalar maya hücre kültürünün 100 mikrolitre tohum.30 derecede iki gün kuluçkaya yat. ICORE kaset yerine doğru RE entegrasyonu koloni PCR tarafından kontrol edilebilir, aday maya klonlar hücrelerinin küçük bir miktar başlayarak ve hedeflenen locus yükseltmek için tablo üç açıklanan astar lar kullanarak. Yaklaşık 500 nükleotitten oluşan bir bant olan PCR ürünleri, doğru P53 yanıt elementi dizisinin varlığı için düzenlenmiş genomik konumun dizisini doğrulamak için Sanger dizilimi tarafından kontrol edilebilir.Muhabir gerginliği fonksiyonel tahlillerde kullanılmaya hazır. P53 protein transaktivasyon yeteneğini değerlendirmek için maya kolonilerinin rengini kontrol edin. Örneğin, vahşi tip P53 ve mutantlar R175H ve R282W arasında iki farklı muhabir, P21-5-prime ve PUMA ve iki farklı sıcaklık, 30 derece ve 37 derece kullanarak bir karşılaştırma sıyoruz.İlginçtir, R175H bir kaybı-fonksiyon P53 alel iken, her koşulda kırmızı koloniler, R282W 30 derece artık transaktivasyon aktivitesi ile sıcaklık hassasiyeti gösterir, beyaz koloniler sonuçlanan, ama 37 derece aktivite kaybı, kırmızı veya pembe koloniler ile sonuçlanan. Genişletilmiş veri seti şekil iki B.Wild-tipi P53 dört mutant aleller de 10 farklı P53 yanıt elemanı muhabir suşları, üç sıcaklık ve kurucu ifade düzeyleri kullanılarak transaktivasyon için test edilmiştir sunulmaktadır. Sonuçlar maya kolonisi renk fenotip hatırlatan bir renk kodu özetlenir.P53 K139E mutant alel kısmi aktivitekorur ve soğuğa duyarlıdır. Örneğin, koloniler 24 ve 30 derece GADD45 muhabiri zorlanma kırmızı, ama 37 derece beyaz. Burada insan ve C.elegans P53 mayasının transaktivasyon özgüllüğünü karşılaştırarak bu yöntemle elde edilen sonuçlara bir örnek salıyoruz.Çubuk grafiğindeki sonuçlar, standart hatası dört çoğaltma olan ortalama göreli ışık birimleri olarak ifade edilir. Beş farklı P53 yanıt öğesi karşılaştırıldı. P53 protein ekspresyonunun üç farklı düzeyi ortadaki galaktoz konsantrasyonu değiştirilerek test edildi.İki P53 ortologları belirgin olarak farklı transaktivasyon özgüllüğü gösterir. Bu, 28 nükleotitli bir spacer'In varlığı veya yokluğu dışında, aynı sırayı paylaşan ced13 ve V1 yanıt elemanlarının sonuçlarıyla örneklenmiştir. C.elegans P53 tam tersini gösterirken İnsan P53 V1 bağlayıcı site ile çok daha yüksek transaktivasyon sergiler.Sonuçlar galaktoz indükleyici altında P53 ifade düzeyinden bağımsızdır. 100 mikrolitre kültür damlaelde kolonilerin sayısını sayarak maya büyüme ölçün. Mutant P53 ifade hücrelerinin büyüme reaktivasyon sıfır düzeyde temsil ederken% 100 olarak belirlenen maksimal olası etkisi olarak maya ifade vahşi tip P53 büyüme göz önüne alındığında bileşiklerin mutant reaktivasyon etkisini hesaplayın.Bu örnekte, Nutlin-3a, MDM2'nin birlikte ekspresyonunun neden olduğu yabani tip P53 inhibisyonunu azaltırken PhiKan083 kısmen Y220C P53 mutantını yeniden etkinleştirir. Her iki durumda da, bu maya büyüme p53 bağımlı azalma ile sonuçlanır. Maya bazal hücreleri değerleri araştırmak için yararlı kanıtlanmıştır, P53 protein fonksiyonlarının yönlerini.Bu çalışmada açıklanan protokol, yabani tip veya kanserle ilişkili mutant P53'ün transaktivasyon potansiyelini hedef bölgelerin varyantlarına göre değerlendirmek için özellikle hassastır. Ayrıca, yaklaşım P53 fonksiyonlarını etkileyen küçük molekülleri belirlemek ve kofaktör ile P53 etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Renk muhabirlerinin kullanımı, luciferase minyatürleştirilmesi, hem de maliyet-etkin ve ölçeklenebilir tahliller kimyasal kütüphane tarama için uygun büyüme inhibisyonu testi sonucu.Son olarak, bu çalışmada açıklanan sistem, diğer diziye özgü transkripsiyon faktörlerinin incelenmesi ile kolayca benimsenebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Prostat Kanseri ve Diğer Yaşa bağlı Patolojilerde veya Metabolik Hastalıklarda bir Biyofiziksel Tetik olarak Bazal Membran Rijitliğinin Eğitim Nasıl

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia

Kolon-26 Karsinoma Tümör taşıyan Kanser Kaşeksi Araştırmaları Modeli Olarak Fare

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Genotipleri ve Mutasyonel Profilleri Farmakolojik Tepkilere Çeviren Araçlar Olarak Prostat Organoid Kültürleri

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Using the E1A Minigene Tool to Study mRNA Splicing Changes

mRNA Birleştirme Değişikliklerini incelemek için E1A Minigene Aracını Kullanma

mRNA processing involves multiple simultaneous steps to prepare mRNA for translation, such as 5&#180;capping, poly-A addition and splicing. Besides ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...