Name: microelectrode impalement method to record membrane potential from a cannulated middle cerebral artery
Uploaded: 2019-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Intramural support Research program (IRSP) fra UMMC, AHA videnskabsmand udviklings legat (13SDG14000006) tildelt Mallikarjuna R. Pabbidi.

Hanrotter blev opstaldet i dyrepleje anlægget i UMMC, som er godkendt af foreningen til vurdering og akkreditering af laboratorie dyrepleje (AAALAC). Dyrene havde fri adgang til mad og vand under hele studiet. Dyrene blev holdt i et kontrolleret miljø med en temperatur på 24 ± 2 °C, fugtighedsniveauer på 60 – 80% og 12 h lys/mørke cyklusser. Alle protokoller blev godkendt af Udvalget for dyrepasning og-brug i UMMC.
1. klargøring af udstyr
<ol><li>Anbring en dobbelt kanal differenti...

<ol>
	<li>Nelson, M. T., Quayle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+and+properties+of+potassium+channels+in+arterial+smooth+muscle.">Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle.</a> American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Calcium channels in vascular smooth muscle cells.</a> Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).</li><li>Large, W. A., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+physiological+role+of+the+Ca(2+)-activated+Cl-+conductance+in+smooth+muscle.">Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle.</a> American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).</li><li>Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channel+blockers+inhibit+myogenic+tone+in+rat+cerebral+arteries.">Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries.</a> Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).</li><li>Yamazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+expression+of+volume-regulated+chloride+channels+in+canine+vascular+smooth+muscle+cells.">Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells.</a> Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).</li><li>Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitative+Ca2++entry+and+the+regulation+of+smooth+muscle+tone.">Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone.</a> Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).</li><li>Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+single-channel+and+whole+cell+currents+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).</li><li>Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+whole-cell+currents+in+smooth+muscle+cells+from+mesenteric+resistance+artery+of+guinea-pig.">Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig.</a> Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).</li><li>Shelly, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na(+)+pump+alpha+2-isoform+specifically+couples+to+contractility+in+vascular+smooth+muscle:+evidence+from+gene-targeted+neonatal+mice.">Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).</li><li>Coca, A., Garay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , (1993).</li><li>Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-dependent+membrane+depolarization+in+cat+middle+cerebral+artery.">Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery.</a> Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).</li><li>Knot, H. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arterial+diameter+and+wall+[Ca2+]+in+cerebral+arteries+of+rat+by+membrane+potential+and+intravascular+pressure.">Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure.</a> Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).</li><li>Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels,+potassium+channels,+and+voltage+dependence+of+arterial+smooth+muscle+tone.">Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone.</a> American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).</li><li>Harder, D. R., Sperelakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+induced+in+guinea+pig+arterial+smooth+muscle+by+tetraethylammonium.">Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium.</a> American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+rat+mesenteric+lymphatic+vessels+and+their+regulation+by+stretch.">Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).</li><li>Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrical+properties+of+middle+cerebral+and+mesenteric+artery+in+cat.">Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat.</a> American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).</li><li>Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+membrane+properties+in+vascular+muscle+cells+from+various+vascular+beds.">Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds.</a> Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).</li><li>Cogolludo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+inhibits+voltage-gated+K++currents+in+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells:+role+of+5-HT2A+receptors,+caveolin-1,+and+KV1.5+channel+internalization.">Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization.</a> Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).</li><li>Ganitkevich, V., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+modulates+inositol+1,4,5-trisphosphate-mediated+Ca2++transients+in+guinea-pig+coronary+myocytes.">Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes.</a> Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).</li><li>Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++channel+openers,+cromakalim+and+Ki4032,+inhibit+agonist-induced+Ca2++release+in+canine+coronary+artery.">K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).</li><li>Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRL+38227+(levcromakalim)-induced+hyperpolarization+reduces+the+sensitivity+to+Ca2++of+contractile+elements+in+caninse+coronary+artery.">BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).</li><li>Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+of+the+conducted+electrical+response+in+arterioles+of+hamster+cheek+pouch+in+vitro.">Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro.</a> American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).</li><li>Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+in+smooth+muscle.">Calcium sparks in smooth muscle.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).</li></ol>

Denne artikel indeholder de nødvendige trin til, hvordan man bruger en skarp mikroelektrode-Spidning på pæl metode til at optage Vm fra en kanylerede beholder. Denne metode er almindeligt anvendt, og tilbyder høj kvalitet, konsistente optagelser af Vm , der besvarer en bred vifte af eksperimentelle spørgsmål.
Nogle kritiske overvejelser og fejlfindingstrin beskrives her for at sikre, at metoden lykkes. Kvaliteten af mikroelektroden (skarpheden og modstanden) og den ...

Membran potentialet (Vm) i en celle refererer til den relative forskel mellem ionisk ladning på tværs af plasma membranen og membranens relative permeabilitet over for disse ioner. Vm genereres af differentialfordelingen af ioner og vedligeholdes af ionkanaler og pumper. Ionkanaler som K+, na+og CL− bidrager væsentligt til hvile Vm. Vaskulære glatte muskelceller (Vsmc'er) udtrykker mere end fire forskellige typer af K+ kanaler1, to typer af spænding-gated ca2 + kanaler (vgcc)2, mere end to typer af CL− kanaler3, 4 af , 5, lager drevne ca2 + kanaler6, stretch-aktiverede kation kanaler7,8, og elektro gene natrium-kalium ATPase pumper9 i deres plasma membraner, som alle kan være involveret i reguleringen af Vm.
Vm af Vsmc'er afhænger af lumen tryk. I ikke-trykbærende beholdere varierer Vm fra-50 til-65 mv, men i trykbærende arterielle segmenter spænder vm fra-37 til-47 mv10. Elevation af Intravaskulært tryk forårsager vsmc'er til depolarisere11, nedsætter tærsklen for vgcc åbning, og øger calcium tilstrømning bidrager til udviklingen af myogenic tone12. Tværtimod vil membran hyperpolarisering, på grund af høj K+ kanal aktivitet, i passive eller ikke-trykbeholdere forhindre vgcc i at åbne, hvilket resulterer i begrænset calcium indgang og et fald i intracellulær calcium, hvilket bidrager til mindre vaskulære tone13. Således, Vm på grund af ændringer i lumen tryk synes at spille en væsentlig rolle i vaskulær tone udvikling, og både Vgcc og K+ kanaler spiller en afgørende rolle i reguleringen af Vm.
Vm varierer mellem fartøjstype og art. Vm er-54 ± 1,3 mv i marsvin Superior mesenterisk arteriel strimler14,-45 ± 1 mv i rotte midterste cerebrale arterier ved 60 mmHg lumen Tryk12, og-35 ± 1 mv i rotte parenchymalarterier ved 40 mmHg lumen Tryk15. Hvile Vm indspillet i ustrakt rotte lymfe muskulatur er-48 ± 2 mv16. Vm af cerebrale Vsmc'er er mere negativ end i perifere arterier. I sammenligning, Feline midterste cerebral arterier blev rapporteret at have en Vm af ca-70 mv, mens mesenteriske og koronararterier blev rapporteret at have-49 og-58 mv, henholdsvis17,18. Forskelle i Vm på tværs af vaskulære senge kan afspejle forskellene i ekspression og funktion af ionkanaler og elektro gene natrium-kalium pumper.
Stigninger og fald i Vm kaldes henholdsvis membran depolarisering og hyperpolarisering. Disse ændringer i Vm spiller en central rolle i mange fysiologiske processer, herunder ion-kanal gating, celle signalering, muskelsammentrækning, og handling potentiel formering. Ved et fast tryk, mange endogene og syntetiske vasodilatator forbindelser, der aktiverer K+ kanaler forårsage membran hyperpolarisering, resulterer i vasodilatation1,13. Omvendt, vedvarende membran depolarisering er afgørende i agonist-induceret eller Receptor-medieret vasokonstriktion19. Vm er en kritisk variabel, der ikke kun regulererca 2 + tilstrømning gennem vgcc13 , men også påvirker frigivelsen afca 2 + fra interne butikker20,21 og ca2 +-følsomhed af kontraktile apparatet22.
Mens der er flere metoder til at registrere Vm fra forskellige celletyper, synes data indsamlet fra mikroelektrode Spidning på pæl metode af kanyler, der er mere fysiologiske end data indhentet fra isolerede vsmc'er. Ved optagelse fra isolerede VSMC ved hjælp af aktuelle klemme metoder, ses Vm som spontane forbigående hyperpolariseringer i VSMCs24. Isolerede Vsmc'er er ikke i syncytium, og ændringerne i serie modstanden kan bidrage til oscillatoriske opførsel af Vm. På den anden side, oscillerende adfærd er ikke observeret, når Vm er indspillet fra intakte fartøjer, sandsynligvis på grund af celle celle kontakt mellem vsmc'er, der er i syncytium i arterien og er summeret i hele beholderen fører til en stabil Vm 24. målingen af Vm fra trykbeholdere, der anvender standard mikroelektrode teknik, er således relativt tæt på de fysiologiske forhold.
Optagelse vm fra kanyler kan give vitale oplysninger, da vm af vsmc'er, der er i syncytium er en af de vigtigste determinanter for vaskulær tone og blodgennemstrømning, og graduering af vm kunne give en måde at spile eller konstrikte blodkar. Derfor er det vigtigt at forstå den metode, der er involveret i optagelse Vm. Denne artikel beskriver intracellulær optagelse af Vm fra kanylerede midterste cerebrale arterier (mub) ved hjælp af en mikroelektrode Spidning på pæl metode. Denne protokol vil beskrive, hvordan de monetære udligningsbeløb, mikroelektroder, der er oprettet elektrometer og udføre den Spidning på pæl metode til at optage Vm. Der diskuteres også repræsentative data, almindelige problemer, der opstod under brugen af denne metode og potentielle problemer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneshetic Vaporiser</td>
			<td>Parkland scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc., NY</td>
			<td>Eclipse Ti-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kleine Guillotine Type 7575</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA</td>
			<td>73-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Littauer Bone Cutter</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>16152-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC40 Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-3287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device camera</td>
			<td>Qimaging, , BC</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential electrometer amplifier</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD223A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line pressure transducer</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA</td>
			<td>MA1 72-4496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>PCS-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes</td>
			<td>Warner Instruments LLC, CT</td>
			<td>G200-6,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Fil (Microfiber syringe)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH1SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myograph</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, VT</td>
			<td>CH-1-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Sutter Instrument, San Rafael, CA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration-free table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>3435-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p Clamp 10</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon, NY</td>
			<td>NIS-elements</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microelectrode impalement method to record membrane potential from a cannulated middle cerebral artery

Membran potentialet (Vm) af vaskulære glatte muskelceller afgør fartøjets tone og dermed blodtilførslen til et organ. Ændringer i ekspression og funktion af ionkanaler og elektro gene pumper, der regulerer Vm i sygdomstilstande, kan potentielt ændre vm, vaskulær tone og blodgennemstrømning. Således er en grundlæggende forståelse af Elektrofysiologi og de nødvendige metoder til nøjagtigt at registrere Vm i sunde og syge stater afgørende. Denne metode vil tillade modulere Vm ved hjælp af forskellige farmakologiske midler til at genoprette vm. Selv om der er flere metoder, hver med sine fordele og ulemper, denne artikel indeholder protokoller til at optage Vm fra kanylerede modstand fartøjer som den midterste cerebral arterien ved hjælp af mikroelektrode Spidning på pæl metode. Midterste cerebrale arterier har lov til at få myogenic tone i en myograph kammer, og beholderen væggen er spiddet ved hjælp af høj modstand mikroelektroder. Vm -signalet opsamles gennem en elektromagnet, digitaliseret og analyseret. Denne metode giver en nøjagtig aflæsning af Vm på en fartøjs væg uden at beskadige cellerne og uden at ændre membran modstanden.

Den præsenterede metode kan pålideligt bruges til at optage Vm i kanyler. En kort procedure, der beskriver, hvordan man isolerer MCA fra hjernen, er præsenteret i figur 1a. Efter at have adskilt hjernen fra kraniet blev MCA dissekeret og anbragt i en Petri skål med lavt calcium-PSS. En del af bindevæv, der var vedhæftet blev også dissekeret sammen med MCA ved hjælp af fjeder saks og pincet for at forhindre skader på MCA under isolation. Om...

Watch this Scientific Journal Video about Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery at JoVE.com

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Det primære mål med denne artikel er at give oplysninger om, hvordan man registrerer membran potentiale (Vm) fra den midterste cerebrale arterien ved hjælp af mikroelektrode Spidning på pæl metode. Den kanylerede midterste cerebrale arterier er ækvilibreret for at få myogenic tone, og beholderen væg er spiddet ved hjælp af høj modstand mikroelektroder.

Mikroelektrode Impalement metode til at optage membran potentiale fra en Cannulated Middle cerebral arterien

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Denne protokol kan bruges til at måle membranpotentialet af normale og syge blodkar og til at evaluere farmakologiske midler, der modulerer membranpotentiale, vaskulær tone og blodgennemstrømning. Membranpotentialerne genereret fra denne teknik er tæt på det fysiologiske område, da vaskulære glatte muskler i et kar er i et syncytium. Før proceduren påbegyndes, skal du placere en dual channel differentialelektometerforstærker tæt på karkammeret på det ønskede sted.Brug et BNC-BNC-kabel til at forbinde outputtet fra forstærkerekanalen A eller B til digitaliseringsinputtet for digitaliseringsinput. Monter sonden i mikromanipulatoren, og drej mikromanipulatoren mod mikroskopet og myografen på et vibrationsfrit bord. Anlæer knapperne og kontakterne på forsiden af forstærkeren i de relevante positioner for forsøget, som beskrevet i manualen.Tilslut derefter badejorden til forstærkerens kredsløbsjord med en passende elektrode, og sørg for, at buret er jordet til forstærkerens chassis. For at forberede borosilikat glas mikroelektroder, bruge en standard puller at opnå en kort, gradvis, otte-til 10-millimeter konus med en mindre-end-en-mikrometer diameter, looping to gange for højere modstand og mindre tips. Brug en mikrofibersprøjte til at fylde mikroelektroden med tre-molar kaliumchlorid, langsomt trække stemplet under injektionen for at give plads til væsken til at fylde og for at forhindre dannelsen af bobler inde i mikroelektroden.Anvend den fuldt lastede mikroelektrode på mikroelektrodeholderen, og skub forsigtigt, men fast elektrodeskaftet ind i holderen gennem borehullet. Fjern eventuel overskydende væske med et laboratorievæv, og tilslut elektrodeholdersamlingen til forstærkersonden. Udtænt en elektrodetest for at måle elektrodemodstanden.Åbn derefter optagesoftwaren, tildel et navn til filen, og gem filen til fremtidig analyse. Dernæst skylles myografkammeret med destilleret vand flere gange, før kammeret læsses med fem milliliter normal fysiologisk saltopløsning eller PSS. Brug en fem- eller 10-milliliter sprøjte, fylde både glas kanyler og vedlagte slanger med filtreret normal PSS uden at indføre nogen luftbobler, og bruge stumpe kraftbeton til at gøre en halv knude i to 10-0 monofilament nylon suturer.Derefter, ved hjælp af dissektion snøre under en dissektion mikroskop, placere de delvist lukkede sutur knuder på begge kanyler lidt væk fra spidserne. For midten cerebral arterie isolation, bruge foråret saks og scerokker til at identificere og dissekere en uforgrenet segment af midten cerebral arterie, med en indre diameter på 100 til 200 mikrometer, af rotte hjernen. Brug fine kraftbecer til at montere den midterste cerebral arterie på glas kanyler, og stramme suturer for at sikre arterien til kanylen.Luk den distale kanyle, så der ikke vil være nogen strøm i arterien, og tilslut indløbspipetten til et reservoir af PSS. Visualiser den kanylede midterste cerebral arterie ved hjælp af en afgift-koblet enhed kamera monteret på en omvendt mikroskop og billedbehandling software. Indstil mca'ens aksiale længde til en omtrentlig længde, således at den hverken fremstår stiv eller slap.Ligevægt badet løsning med 95% ilt og 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius. Neddyb jorden af forstærkeren i PSS af myografen. Belyse karkammeret, og visualiser spidsen af mikroelektroden i badopløsningen gennem mikroskopet.Brug mikromanipulatoren til at flytte spidsen af mikroelektroden tæt på blodkarrens ydervæg, og begynd optagelsen. Langsomt flytte spidsen af mikroelektroden mod fartøjet, der sigter mod midten af fartøjet. Når spidsen kommer tæt på fartøjet, skal elektroden frem i en hurtig bevægelse for at spidde musklens membran.Når membranen er trængt ind, kan der observeres ændringer i membranpotentialet. Rør ikke ved mikromanipulatoren, når membranen er spiddet. Når membranen potentielle ændringer er blevet registreret, skal du bruge manipulatoren til at fjerne mikroelektroden i en hurtig bevægelse, og stoppe optagelsen, før du gemmer datafilerne.Impalement anses for at være en succes, når der er en hurtig afbøjning til negative værdier, membranpotentialet er stabilt i mindst 30 sekunder, og spændingen vender brat tilbage til nul millivolt ved fjernelse af elektroden. Efter en vellykket impalement og membran potentiel stabilisering, lægemidler af interesse kan perfunderes i badet og ændringer i membranen potentiale kan registreres. I dette repræsentative eksperiment, perfusion med kaliumchlorid depolariseret membranen med cirka seks millivolt, mens perfusion med en calcium-afhængig aktivator af store ledende calcium-aktiverede kalium kanaler hyperpolarized membranen med næsten fire millivolts.Det vigtigste at huske er at trække meget resistente mikroelektroder, der har en kort, gradvis konus med en mindre end en-mikrometer diameter.

Research

JoVE Journal

Medicine

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Endothelin-1-induceret mellem-cerebral arterieokklusion Model for iskæmisk slagtilfælde med laser-doppler-flowmetri Vejledning i Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Anvendelse af en Cranial vindue for at visualisere den midterste cerebrale arterie Under endothelin-1-induceret mellem-cerebral arterieokklusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Optimeret System for Cerebral Perfusion Overvågning i Rat Stroke Model af intraluminal mellem-cerebral arterieokklusion

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Modellering Stroke i mus: Permanent Koagulering af den distale Middle Cerebral Artery

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolisk cerbri arterieokklusion (MCAO) for iskæmisk slagtilfælde med Homologe Blodpropper i rotter

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Kvantificering af neurovaskulær Protection Efter Gentagne Hypoksisk Forkonditionering og Forbigående mellem-cerebral arterieokklusion i mus

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...