Name: microelectrode impalement method to record membrane potential from a cannulated middle cerebral artery
Uploaded: 2019-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery at JoVE.com

Dit werk werd deels ondersteund door subsidies van het intramurale support Research Program (IRSP) van UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) uitgereikt aan Anna Pabbidi.

De mannelijke ratten werden gehuisvest in de Dierenzorg faciliteit op UMMC, die is goedgekeurd door de vereniging voor de beoordeling en accreditatie van laboratoriumdieren zorg (AAALAC). Dieren hadden gedurende de hele studie vrije toegang tot voedsel en water. De dieren werden gehandhaafd in een gecontroleerde omgeving met temperatuur bij 24 ± 2 °C, vochtigheidsniveaus van 60 – 80% en 12 h lichte/donkere cycli. Alle protocollen werden goedgekeurd door de Dierenzorg en het gebruik Comite van UMMC.
<p class="jove...

<ol>
	<li>Nelson, M. T., Quayle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+and+properties+of+potassium+channels+in+arterial+smooth+muscle.">Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle.</a> American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Calcium channels in vascular smooth muscle cells.</a> Journal of Vascular Research. 32 (6), 353-370 (1995).</li><li>Large, W. A., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+physiological+role+of+the+Ca(2+)-activated+Cl-+conductance+in+smooth+muscle.">Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle.</a> American Journal of Physiology. 271 (2 Pt 1), C435-C454 (1996).</li><li>Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channel+blockers+inhibit+myogenic+tone+in+rat+cerebral+arteries.">Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries.</a> Journal of Physiology. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).</li><li>Yamazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+molecular+expression+of+volume-regulated+chloride+channels+in+canine+vascular+smooth+muscle+cells.">Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells.</a> Journal of Physiology. 507 (Pt 3), 729-736 (1998).</li><li>Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitative+Ca2++entry+and+the+regulation+of+smooth+muscle+tone.">Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone.</a> Trends in Pharmacol Sciences. 19 (7), 266-269 (1998).</li><li>Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+single-channel+and+whole+cell+currents+in+vascular+smooth+muscle+cells.">Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).</li><li>Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-activated+whole-cell+currents+in+smooth+muscle+cells+from+mesenteric+resistance+artery+of+guinea-pig.">Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig.</a> Journal of Physiology. 501 (Pt 2), 343-353 (1997).</li><li>Shelly, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na(+)+pump+alpha+2-isoform+specifically+couples+to+contractility+in+vascular+smooth+muscle:+evidence+from+gene-targeted+neonatal+mice.">Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), C813-C820 (2004).</li><li>Coca, A., Garay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. , (1993).</li><li>Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-dependent+membrane+depolarization+in+cat+middle+cerebral+artery.">Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery.</a> Circulation Research. 55 (2), 197-202 (1984).</li><li>Knot, H. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+arterial+diameter+and+wall+[Ca2+]+in+cerebral+arteries+of+rat+by+membrane+potential+and+intravascular+pressure.">Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure.</a> Journal of Physiology. 508 (Pt 1), 199-209 (1998).</li><li>Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels,+potassium+channels,+and+voltage+dependence+of+arterial+smooth+muscle+tone.">Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone.</a> American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).</li><li>Harder, D. R., Sperelakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potentials+induced+in+guinea+pig+arterial+smooth+muscle+by+tetraethylammonium.">Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium.</a> American Journal of Physiology. 237 (1), C75-C80 (1979).</li><li>Nystoriak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+increase+in+pressure-dependent+constriction+of+brain+parenchymal+arterioles+from+subarachnoid+hemorrhage+model+rats+due+to+membrane+depolarization.">Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).</li><li>Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+properties+of+rat+mesenteric+lymphatic+vessels+and+their+regulation+by+stretch.">Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch.</a> Lymphatic Research and Biology. 12 (2), 66-75 (2014).</li><li>Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrical+properties+of+middle+cerebral+and+mesenteric+artery+in+cat.">Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat.</a> American Journal of Physiology. 239 (1), C23-C26 (1980).</li><li>Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+membrane+properties+in+vascular+muscle+cells+from+various+vascular+beds.">Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds.</a> Federation Proceedings. 42 (2), 253-256 (1983).</li><li>Cogolludo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+inhibits+voltage-gated+K++currents+in+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells:+role+of+5-HT2A+receptors,+caveolin-1,+and+KV1.5+channel+internalization.">Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization.</a> Circulation Research. 98 (7), 931-938 (2006).</li><li>Ganitkevich, V., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+potential+modulates+inositol+1,4,5-trisphosphate-mediated+Ca2++transients+in+guinea-pig+coronary+myocytes.">Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes.</a> Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).</li><li>Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++channel+openers,+cromakalim+and+Ki4032,+inhibit+agonist-induced+Ca2++release+in+canine+coronary+artery.">K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346 (6), 691-700 (1992).</li><li>Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRL+38227+(levcromakalim)-induced+hyperpolarization+reduces+the+sensitivity+to+Ca2++of+contractile+elements+in+caninse+coronary+artery.">BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347 (4), 438-444 (1993).</li><li>Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+of+the+conducted+electrical+response+in+arterioles+of+hamster+cheek+pouch+in+vitro.">Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro.</a> American Journal of Physiology. 269 (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).</li><li>Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks+in+smooth+muscle.">Calcium sparks in smooth muscle.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278 (2), C235-C256 (2000).</li></ol>

Dit artikel bevat de nodige stappen op het gebruik van een scherpe microelektrode impalement methode om Vm record van een gecanuleerde schip voorbereiding. Deze methode wordt veel gebruikt, en biedt een hoge kwaliteit, consistente opnames van Vm dat antwoord op een breed scala van experimentele vragen.
Sommige kritieke overwegingen en stappen voor probleemoplossing worden hier beschreven om het succes van de methode te garanderen. De kwaliteit van de micro-elektrode (de s...

Het membraanpotentiaal (Vm) van een cel verwijst naar het relatieve verschil van Ionische lading over het plasmamembraan en de relatieve permeabiliteit van het membraan naar deze ionen. De Vm wordt gegenereerd door de differentiële verdeling van ionen en wordt onderhouden door ionenkanalen en pompen. De ionenkanalen zoals K+, na+, en cl− dragen wezenlijk tot het rusten Vmbij. Vasculaire gladde spiercellen (VSMCs) Express meer dan vier verschillende soorten K+ kanalen1, twee soorten van voltage-gated CA2 + kanalen (VGCC)2, meer dan twee soorten cl− kanalen3, 4 , 5, op te slaan-bediend CA2 + kanalen6, Stretch-activated kation kanalen7,8, en electrogenic natrium-kalium ATPase pompen9 in hun plasmamembranen, die allemaal kunnen worden betrokken bij de regulering van Vm.
De Vm van VSMCs hangt af van lumen druk. In niet-drukvaten, Vm varieert van-50 tot-65 mv, echter, in onder druk gezette arteriële segmenten, vm varieert van-37 tot-47 MV10. Elevatie van intravasculaire druk oorzaken VSMCs te depolariseren11, vermindert de drempel voor VGCC opening, en verhoogt de calcium instroom bij te dragen tot de ontwikkeling van myogene Toon12. Integendeel, in passieve of niet-drukvaten, membraan hyperpolarisatie, als gevolg van hoge K+ kanaal activiteit, zal voorkomen dat VGCC van de opening, wat resulteert in een beperkte calcium binnenkomst en een daling van de intracellulaire calcium, bij te dragen tot minder vasculaire Toon13. Zo, Vm als gevolg van veranderingen in de lumen druk lijkt te spelen een essentiële rol in de vasculaire Toon ontwikkeling, en zowel VGCC en K+ kanalen spelen een cruciale rol in de regulering van Vm.
Vm varieert tussen Scheepstype en soort. Vm is-54 ± 1,3 mv in proefkonijn superieure mesenterica arteriële stroken14,-45 ± 1 mv in de rat midden cerebrale slagaders op 60 mmHg lumen druk12, en-35 ± 1 mv in rat parenchymale slagaders op 40 mmHg lumen druk15. De rust Vm opgenomen in ongestrekte rat lymfatische spier is-48 ± 2 MV16. Vm van cerebrale VSMCs is negatiever dan in perifere slagaders. Ter vergelijking, katachtige middelste cerebrale slagaders werden gemeld aan een Vm van ongeveer-70 mV hebben, terwijl mesenterica en kransslagaders werden gemeld te hebben-49 en-58 mv, respectievelijk17,18. Verschillen in de Vm over vasculaire bedden kunnen weerspiegelen de verschillen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic natrium-kalium pompen.
De verhogingen en de dalingen in Vm worden bedoeld als membraan depolarisatie en hyperpolarisatie, respectievelijk. Deze veranderingen in Vm spelen een centrale rol in vele fysiologische processen, met inbegrip van ionen-kanaal gating, cel signalering, spiercontractie, en actie potentiële propagatie. Bij een vaste druk, veroorzaken vele endogene en synthetische vaatverwijdende samenstellingen die K+ kanalen activeren membraan hyperpolarisatie, resulterend in vasodilatatie1,13. Omgekeerd, aanhoudende membraan depolarisatie is van vitaal belang in agonist-geïnduceerde of receptor-gemedieerde vasoconstrictie19. Vm is een kritische variabele die niet alleen reguleert CA2 + instroom door VGCC13 , maar ook van invloed op de release van CA2 + van interne winkels20,21 en CA2 +-gevoeligheid van het samentrekbaar apparaat22.
Hoewel er verschillende methoden om Vm record van verschillende soorten cellen, gegevens verzameld uit de microelektrode impalement methode van gecanuleerde schepen lijkt meer fysiologische dan de gegevens verkregen uit geïsoleerde VSMCs. Wanneer geregistreerd van geïsoleerde VSMC gebruikend huidige klem methodes, wordt Vm gezien als spontane voorbijgaande Hyperpolarizations in VSMCs24. Geïsoleerde VSMCs zijn niet in de syncytium, en de veranderingen in de reeks weerstand kan bijdragen tot de oscillerende gedrag van Vm. Aan de andere kant, oscillerende gedrag wordt niet waargenomen wanneer Vm is opgenomen van intacte schepen, waarschijnlijk te wijten aan cel-cel contact tussen VSMCs die in syncytium in de slagader en zijn gesommeerd door het hele schip leidt tot een stabiele Vm 24. aldus, is de meting van Vm van onder druk gezette schepen gebruikend standaard microelektrode impalement techniek vrij dicht bij de fysiologische voorwaarden.
Opname Vm van gecanuleerde schepen kunnen vitale informatie, aangezien vm van VSMCs die in syncytium is een van de belangrijkste determinanten van vasculaire Toon en de doorbloeding, en de modulatie van de v-m kan een manier om verwijden of vernauwen bloedvaten. Zo is het essentieel om te begrijpen van de methodologie die betrokken zijn bij de opname Vm. Dit artikel beschrijft intracellulaire opname van Vm van gecanuleerde middelste cerebrale slagaders (MCAs) met behulp van een microelektrode impalement methode. Dit protocol zal beschrijven hoe te bereiden MCAs, microelektrodes, het opzetten van de elektrometer en uitvoeren van de impalement methode om Vmrecord. Ook representatieve gegevens, gemeenschappelijke problemen die werden aangetroffen bij het gebruik van deze methode en mogelijke problemen worden besproken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aneshetic Vaporiser</td>
			<td>Parkland scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon Instruments Inc., NY</td>
			<td>Eclipse Ti-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kleine Guillotine Type 7575</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA</td>
			<td>73-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Littauer Bone Cutter</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>16152-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria MC40 Ultra Fine Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>11370-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors Sharp-Blunt</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>14008-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-3287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophysiology Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charge-coupled device camera</td>
			<td>Qimaging, , BC</td>
			<td>Retiga 2000R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Differential electrometer amplifier</td>
			<td>WPI</td>
			<td>FD223A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-line pressure transducer</td>
			<td>Harvard Apparatus, MA</td>
			<td>MA1 72-4496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Thor labs</td>
			<td>PCS-5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrodes</td>
			<td>Warner Instruments LLC, CT</td>
			<td>G200-6,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Fil (Microfiber syringe)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode holder</td>
			<td>WPI</td>
			<td>MEH1SF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myograph</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, VT</td>
			<td>CH-1-SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puller</td>
			<td>Sutter Instrument, San Rafael, CA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration-free table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>3435-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 10</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p Clamp 10</td>
			<td>Molecular devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Nikon, NY</td>
			<td>NIS-elements</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microelectrode impalement method to record membrane potential from a cannulated middle cerebral artery

Membraanpotentiaal (Vm) van vasculaire gladde spiercellen bepaalt het vaartuig Toon en dus de bloedtoevoer naar een orgaan. Veranderingen in de expressie en functie van ionenkanalen en electrogenic pompen die te reguleren Vm in ziekte omstandigheden zou kunnen veranderen vm, vasculaire Toon, en de bloedstroom. Aldus, is een basisbegrip van Elektrofysiologisch en de methodes noodzakelijk om Vm in gezonde en zieke staten nauwkeurig te registreren essentieel. Deze methode kan moduleren Vm met behulp van verschillende farmacologische middelen te herstellen vm. Hoewel er verschillende methoden, elk met zijn voor-en nadelen, dit artikel biedt protocollen voor het opnemen Vm van gecanuleerde weerstand schepen zoals het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode. Middelste cerebrale slagaders zijn toegestaan om myogene Toon te krijgen in een myograph kamer, en het schipmuur is inpaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes. Het Vm -signaal wordt verzameld via een elektrometer, gedigitaliseerd en geanalyseerd. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige lezing van de Vm van een vaatwand zonder beschadiging van de cellen en zonder de membraan weerstand te veranderen.

De gepresenteerde methode kan betrouwbaar worden gebruikt voor het opnemen Vm in gecanuleerde schepen. In Figuur 1awordt een korte procedure beschreven om MCA van de hersenen te isoleren. Na het scheiden van de hersenen van de schedel, werd het MCA ontleed en geplaatst in een Petri schaaltje met een laag calcium PSS. Een deel van het bindweefsel dat werd gehecht werd ook ontleed samen met MCA met behulp van de lente schaar en Tang om schade aan MCA...

Watch this Scientific Journal Video about Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery at JoVE.com

Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery

Het primaire doel van dit artikel is om de details van hoe het membraanpotentiaal (Vm) van het midden cerebrale slagader met behulp van de microelektrode impalement methode te bieden. De gecanuleerde middelste cerebrale slagader is geëquilibreerd te krijgen myogene Toon, en het schipmuur is Impaled met behulp van hoge weerstand microelektrodes.

Microelektrode impalement methode om membraan potentieel van een gecanuleerde middelste cerebrale slagader record

Membrane potential (Vm) of vascular smooth muscle cells determines vessel tone and thus blood flow to an organ. Changes in the expression and function of ...

Dit protocol kan worden gebruikt om het membraanpotentieel van normale en zieke bloedvaten te meten en farmacologische agentia te evalueren die het membraanpotentieel, de vasculaire toon en de bloedstroom moduleren. Het membraan potentieel gegenereerd uit deze techniek zijn dicht bij het fysiologische bereik, omdat vasculaire gladde spieren binnen een vat zijn in een syncytium. Plaats voor het begin van de procedure een dual channel differentiële elektrometerversterker dicht bij de scheepskamer op de gewenste locatie.Gebruik een BNC-BNC-kabel om de uitgang van het versterkerkanaal A of B aan te sluiten op de kanaalingang van de digitizer. Monteer de sonde in de micromanipulator en draai de micromanipulator naar de microscoop en de myograaf op een trillingsvrije tafel. Plaats de knoppen en schakelaars op de voorkant van de versterker in de juiste posities voor het experiment, zoals beschreven in de handleiding.Sluit vervolgens de badgrond aan op de circuitgrond van de versterker met een geschikte elektrode en zorg ervoor dat de kooi wordt geaard op het chassis van de versterker. Om de borosilicelectrodes voor te bereiden, gebruikt u een standaardtrekker om een korte, geleidelijke, acht-tot 10-millimeter taper te bereiken met een diameter van minder dan één micrometer, tweemaal lussen voor hogere weerstanden en kleinere uiteinden. Gebruik een microvezelspuit om de micro-elektroder te vullen met kaliumchloride van drie weken, waarbij de zuiger tijdens de injectie langzaam wordt ingetrokken om ruimte te maken voor de vloeistof om te vullen en om de vorming van bellen in de micro-elektroden te voorkomen.Plaats de volledig geladen micro-elektroden op de micro-elektrodenhouder en duw de elektrodesteel voorzichtig maar stevig in de houder door het verveelde gat. Verwijder overtollig vocht met een laboratoriumweefsel en sluit de elektrodehouder aan op de versterkersonde. Voer een elektrodetest uit om de elektrodeweerstand te meten.Open vervolgens de opnamesoftware, wijs een naam toe aan het bestand en sla het bestand op voor toekomstige analyse. Spoel vervolgens de myograafkamer meerdere malen met gedestilleerd water voordat u de kamer laadt met vijf milliliter normale fysiologische zoutoplossing, of PSS. Met behulp van een vijf-of 10-milliliter spuit, vul zowel glazen canules en de bijgevoegde buizen met gefilterde normale PSS zonder de invoering van luchtbellen, en gebruik botte tangen om een halve knoop te maken in twee 10-0 monofilament nylon hechtingen.Plaats vervolgens, met behulp van dissectie-tangen onder een dissectiemicroscoop, de gedeeltelijk gesloten hechtknopen op beide canules iets weg van de uiteinden. Voor midden cerebrale slagader isolatie, gebruik veer schaar en tangen te identificeren en ontleden een onvertakte segment van de middelste hersenslagader, met een binnendiameter van 100 tot 200 micrometer, van de rat hersenen. Gebruik fijne tangen om de middelste hersenslagader op de glazen canules te monteren en draai de hechtingen aan om de slagader aan de canule te beveiligen.Sluit de distale canule af zodat er geen stroom in de slagader is en sluit de instroompipet aan op een reservoir van PSS. Visualiseer de gebliktuleerde middelste hersenslagader met behulp van een opgeladen apparaatcamera die is gemonteerd op een omgekeerde microscoop en beeldvormingssoftware. Stel de axiale lengte van de MCA zo in dat deze niet stijf of slap lijkt.Equilibrate het bad oplossing met 95% zuurstof en 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius. Dompel de grond van de versterker onder in de PSS van de myograaf. Verlicht de vatkamer en visualiseer de punt van de micro-elektroder in de badoplossing door de microscoop.Met behulp van de micromanipulator, beweeg de punt van de micro-elektroden dicht bij de buitenwand van het bloedvat, en begin met de opname. Beweeg langzaam de punt van de micro-elektroden naar het vat, gericht op het midden van het vat. Wanneer de punt in de nabijheid van het vat komt, gaat u de elektrode in één snelle beweging naar voren om het membraan van de spier te impaleren.Zodra het membraan is doorgedrongen, kunnen veranderingen in het membraanpotentieel worden waargenomen. Raak de micromanipulator niet aan nadat het membraan is gespietst. Wanneer het membraan potentiële veranderingen zijn opgenomen, gebruik de manipulator om de micro-elektroder te verwijderen in een snelle beweging, en stop de opname voor het opslaan van de gegevensbestanden.Impalement wordt als succesvol beschouwd wanneer er een snelle afbuiging naar negatieve waarden is, het membraanpotentieel minimaal 30 seconden stabiel is en de spanning abrupt terugkeert naar nul millivolt bij verwijdering van de elektrode. Na een succesvolle impalement en membraan potentiële stabilisatie, geneesmiddelen van belang kan worden geperfundeerd in het bad en veranderingen in het membraan potentieel kan worden geregistreerd. In dit representatieve experiment depolariseerde perfusie met kaliumchloride het membraan met ongeveer zes millivolt, terwijl perfusie met een calciumafhankelijke activator van grote geleiding calciumgeactiveerde kaliumkanalen het membraan met bijna vier millivolt hyperpolariseerde.Het belangrijkste om te onthouden is om zeer resistente micro-elektroden die een korte, geleidelijke taper met een minder-dan-een-micrometer diameter te trekken.

Research

JoVE Journal

Medicine

Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model

Modellering Stroke in Muizen - midden cerebrale slagader occlusie met de gloeidraad Model

Stroke is among the most frequent causes of death and adult disability, especially in highly developed countries. However, treatment options to date are ...

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Muis model van de midden cerebrale slagader Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

Intraluminale midden cerebrale slagader Occlusie (MCAO) Model voor ischemische beroerte met Laser Doppler Flowmetry Begeleiding in Muizen

Stroke is the third leading cause of death and the leading cause of disability in the world, with an estimated cost of near $70 billion 
in the United ...

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

De toepassing van permanente midden cerebrale slagader Ligatie in de muis

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat

Endotheline-1 geïnduceerde midden cerebrale slagader occlusie Model voor ischemische beroerte met Laser Doppler flowmetrie Begeleiding in Rat

Stroke is the number one cause of disability and third leading cause of death in the world, costing an estimated $70 billion in the United States in ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Met behulp van een Craniale venster om de midden cerebrale slagader Visualiseer Tijdens Endotheline-1 geïnduceerde midden cerebrale slagader occlusie

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

Optimized System for Cerebral Perfusion Monitoring in the Rat Stroke Model of Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion

Geoptimaliseerde Systeem voor cerebrale perfusie Monitoring in het Rat Stroke Model van intraluminale midden cerebrale slagader occlusie

The translational potential of pre-clinical stroke research depends on the accuracy of experimental modeling. Cerebral perfusion monitoring in animal ...

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Modellering Stroke in Muizen: Permanente Coagulatie van de distale midden cerebrale slagader

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolic Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO for Ischemic Stroke with Homologous Blood Clots in Rats

Embolische midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) voor ischemische beroerte met homologe bloedstolsels in Ratten

Clinically, thrombolytic therapy with use of recombinant tissue plasminogen activator (tPA) remains the most effective treatment for acute ischemic ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...